神经酰胺及其分析与分离技术研究进展

第 19卷第7期 200 2年7月 精 细 化 工 FINE CHEM ICALS Vo1．19．No．7 July 2 0 0 2 医药与日化原料 神经酰胺及其与分离技术研究进展 谢建平，张敏莲，刘 铮 (清华大学 化工系，北京 100084) 摘要：神经酰胺是一种重要的生物活性物质 ，在医药 、保健和化妆 品行业具有广 阔的应用前景 。 高效分析是深入研究神经酰胺性 质的基础 ，分离技术的研究则是其广泛应用 的前提。本文 综述 了神经酰胺 的分析与分离技术的现有研究成果，并对进一步研究的方 向进行 了讨论。 关键词 ：神经酰胺 ；高效液相色谱 ；色谱 分离 ；分析 中图分类号 ：0657．7 文献标识码 ：A 文章编号 ：1003—5214(2002)07—0381-05 神经酰胺(Ceramide)，即 Ⅳ一脂酰基(神经)鞘氨 醇，是皮肤角质层的重要组分 ，具有屏 障、粘合、保 湿 、抗衰老和抗过敏作用 。最新 的研究发现，神 经酰胺可以通过活化多种蛋白激酶和转录因子参与 细胞内信号传导，从而影响细胞生长、增殖、分化、凋 亡及损伤等多种生理 、病理过程 。目前 ，国际著 名的化妆品公司 Elizabeth Arden已推出了含有神经 酰胺的系列护肤品。神经酰胺作为一种新型生物活 性物质 ，在医药保健 和化妆品行业具有广阔的应用 前景。 高效可靠的神经酰胺分析方法是深入进行神经 酰胺研究的基础。由于神经酰胺分子结 构的多样 性 ，而且它在生物试样中的含量极低 (一般小于总 萃取脂类的 l％) J，由此导致神经酰胺的分离和分 析非常困难 。作者综述 了神经酰胺分析和分离技术 的研究现状及发展趋势 ，旨在引起 国内有关学者对 该领域研究的关注，推动神经酰胺在我国医药保健 和化妆品行业中的应用。 1 神经酰胺简介 神经酰胺 由长链鞘氨醇通过酰胺键与脂肪酸共 价结合而成 ，其中鞘氨醇和脂肪酸的碳链长度、不饱 和度和羟基数 目都是可变化的。脂肪酸根据碳链中 是否含有羟基分成非羟基脂肪酸(Nonhydroxy fatty acid，NHFA)和 羟 基 脂 肪 酸 (Hydroxy fatty acid， HFA)。鞘氨醇有 3种结构，含有不饱和双键的鞘氨 醇称为神经鞘氨醇 (Sphingosine)，饱和的鞘氨醇称 为二氢神经鞘氨醇(Sphinganine)，含有 3个羟基的 鞘氨醇称为植物鞘氨醇(Phytosphingosine)。神经酰 胺 一 般 按 照其 饱 和 度 和羟 基 含 量 的不 同分 成 Ceramide(I)～Ceramide(Ⅶ)。图 1为几种常见神 经酰胺的基本结构示意图。 O ＼ ＼， ＼ ＼ 、、 ＼／＼ ＼／ ＼ Ceramide I N＼八H l OH ，＼ ／，＼ 、八 八 八 ／ ，入 OH O O ＼ 八 ／＼／＼ 、／＼八 ／^ ＼八 ． ＼／＼八 ／^＼八 ／^ ＼／^ ＼／^ ＼／^ ＼ 1 l Ceramide 11 N OH ／、＼／、＼／＼＼ ＼／＼ I l＼、／＼ 八 OH OH Ceramide／／I N＼／＼H l OH ／、厂、／＼＼／、＼／＼ ／＼＼／＼入 I OH OH OH O O l 收稿 13期：2002—03—22 Ceramide V N＼／＼H ／＼／＼1／＼／＼＼八 ／＼ ／、＼／＼ OH l l OH OH 图 1 神经酰胺的基本结构 叫 H 一 v 维普资讯 http://www.cqvip.com 精 细 化 工 FINE CHEMICALS 第19卷 从图 1可知，天然神经酰胺分子结构具有 多样 性。目前已可以人工合成神经酰胺样品，但实际中 应用的神经酰胺多为天然提取物，取 自猪皮、牛脑 、 鸡蛋 、血细胞、植物(如小麦)和酵母细胞等 。 2 神经酰胺分析技术研究进展 神经酰胺分子缺少紫外发色团，不能直接进行 紫外检测 ，因此 ，神经酰胺分析技术的研究进展与检 测方法的不断改进密切相关。 目前已报道的检测方 法有苯甲酰化 一紫外检测法 、荧光标记 一荧光检测 法 、蒸发光散射检测法等 ，近年来质谱和生化分析法 也被应用于神经酰胺的检测。 2．1 苯甲酰化 一UV检测法 1wamori 等人提出了神经酰胺 的苯甲酰化 一 uV检测法。其基本原理是利用苯 甲酰化试剂与神 经酰胺进行柱前衍生反应，生成在 230～280 BITI处 有很强的紫外吸收的 Ⅳ一酰基化合物 ，从而实现对神 经酰胺的间接 uV检测。分析时，将神经酰胺样品、 吡啶和苯甲酰化试剂加入到具塞试管中；在一定温 度下 反应 生成 Ⅳ一酰 基衍 生物 ；将 衍生 物 加入 到 HPLC色谱柱中分离 ；uV检测各衍生物含量 ；换算 各种神经酰胺的含量。一般含有非羟基脂肪酸链的 神经酰胺采用苯甲酸酐作为衍生化试剂，而含有羟 基脂肪酸链的神经酰胺采用苯甲酰氯作为衍生化试 剂。反应温度一般在 70℃左右，反应时间为 3～4 h，确保各种神经酰胺组分上的鞘氨醇和脂肪酸链上 的羟基全部被苯 甲酰化。 神经酰胺苯甲酰化 一uV检测法突出的优点是 具有很好的定量结果，检测灵敏度高 ，可达纳摩尔水 平。此种方法主要的缺点是衍生化过程繁琐 、费时 、 操作条件要求高。同时 ，衍生化产物稳定性较低，可 能存在副产物的影响。 2．2 荧光标记 一荧光检测 荧光标记 一荧光检测的基本原理是通过一定的 衍生化方法使样品对荧光敏感 ，从而实现对神经酰 胺的间接荧光检测。Previati 等人开发了 NAP荧 光标记 一荧 光检测 的神经 酰胺 柱前衍生化方 法。 NAP即 6．甲氧基一 ．甲基一2一萘乙酸，通过 NAP试剂 的羰基组分与神经酰胺中的自由羟基组分结合 ，生 成对荧光敏感 的衍生物。Yano 等人开发 了蒽 酚 一 氰化物荧光标记 一荧光检测的神经酰胺柱前衍生 化方法。以上两种荧光衍生法 的衍生化时间较长 ， 为了缩短衍生化反应时间，Santana 等人对衍生化 方法进行了改进，神经酰胺通过脱酰基形成 自由鞘 氨醇 ，利用其与邻苯二 甲醛(OPA)反应生成荧光标 记化合物。 与神经酰胺苯 甲酰化 一uV检测法类似 ，荧光 标记也具有很好的定量结果，缺点是衍生化过程比 较繁琐和费时 ，而且副产物不能完全除去。 2．3 蒸发光散射检测 蒸发光散射检测器(Evaporative light—scattering detector，ELSD)是一种通用型质量检测器。在检测 过程中，将流动相完全挥发 ，然后测定留下来的样品 颗粒的光散射。由于 ELSD的响应值与被测物 的质 量相关 ，所以可以进行样品的定量分析。由于操作 过程中流动相完全挥发 ，所以基线平稳 ，ELSD已成 为 HPLC中最常用的检测脂类方法。 采用 HPLC—ELSD系统 可直接进行神经 酰胺 的定量分析 ，不需要任何的衍生化过程 ，从而避免了 衍生化过程带来的误差。但此方法的主要缺陷就是 检测的响应值与被测物浓度的关系曲线 比较复杂， 并不是简单的线性关系 J。分析时，需通过实验选 择合适的物质定标 ，从而保证 ELSD对神经酰 胺的定量检测的准确性。 2．4 神经酰胺的质谱分析方法 质谱的高灵敏度和高分辨率以及快速检测优势 使它成为分析活性物质的最常用方法。质谱技术应 用于神经酰胺 的定量定性分析 已见诸文献 ¨” 报 道。质谱技术是一种功能非常强大的分析方法而且 可以给出非常重要 的分子结构信息 。但对于此方 法，只有加入合适的内标物质，才能实现对物质的定 量分析 ，而运行费用昂贵也是限制其应用的重要问 题 。 2．5 神经酰胺的生化分析方法— —E．coli DAG法 Perry和 Hannun【14]将大肠杆菌 一二 脂酰甘油 (E．coli DAG)法应用于神经酰胺的定量分析 ，其操 作步骤为：(1)处理样品细胞 ；(2)萃取脂类 ；(3)利 用 DAG kinase把神经酰胺转换成神经酰胺 1一磷酸 盐 ；(4)采用薄层色谱分离神经酰胺衍生产物 ；(5) 定量分析神经酰胺 1一磷酸盐。 目前 ，此方法 已成为 神经酰胺分析的重要方法之一。 Watts等人 ¨分别采用 E．coli DAG法和质谱 法检测细胞凋亡过程 中神经 酰胺 的变化。结果 明，E．coli DAG法显示凋亡过程中神经酰胺的量增 加，而质谱法显示神经酰胺的量基本不变。据此他 们认为检测过程 中 DAG kinase活性变化会对测量 结果产生影响 ，对 E．coli DAG法分析神经酰胺的 有效性提出质疑。针对这一问题 ，近年来提出了改 进的方法 。 3 神经酰胺分离技术研究进展 分离技术的发展对于神经酰胺的应用领域的拓 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 7期 谢建平 ，等 ：神经酰胺及其分析与分离技术研究进展 ·383· 展具有重要的意义 ，是其产业化 中的关键环节。现 有的神经酰胺分离技术包括薄层色谱、高效液相色 谱和气相色谱法 ，表 1列出了已见诸文献报道的神 经酰胺分离中所使用的各类分离技术。 表 1 神经酰胺分离 中所采用的各类分离技术 由表 1可知 ，高效液相色谱法是 目前分离神经 酰胺的最主要技术，其分离模式一般采用正相色谱 和反相色谱两种。正相色谱和反相色谱均适合于神 经酰胺的分离。正相色谱在分离各类神经酰胺方面 具有一定的优势，反相色谱可将 同一类神经酰胺按 其碳链长度的差异进行分离 ，适合于神经酰胺组分 的分离 。薄层色谱法是神经酰胺的另一重要分离技 术 ，但其在神经酰胺含量较低的复杂生物样品的分 离上存在一定的限制。 4 结论与展望 神经酰胺是皮肤角质层的重要组分 ，参与细胞 内信号传导 ，影响细胞的多种生理 、病理过程，因此 可作为一种新型的生物活性物质应用于医药保健和 化妆品行业 。然而神经酰胺的分析与分离技术的发 展是其应用的基础。目前 ，神经酰胺的分析方法包 括苯甲酰化 一紫外、荧光标记 一荧光、ELSD、质谱以 及生化分析方法。分离方法有薄层色谱法、高效液 相色谱法和气相色谱法。其中，高效液相色谱法 已 成为神经酰胺最主要的分离技术。 尽管对神经酰胺的分析研究 已经持续 了几十 年，然而目前仍没有一种令人满意的高效分析方法 ， 可以预见 ，高效可靠的神经酰胺分析方法仍将是近 期内的研究焦点。根据神经酰胺样品的来源、含量、 种类和不同的使用 目的发展高效分离技术是推动神 经酰胺应用及其产业发展的重要基础 和技术关键。 维普资讯 http://www.cqvip.com · 384· 精 细 化 工 FINE CHEMICALS 第l9卷 已知每种神经酰胺具有独特的立体异构体 ，且不同 立体异构体的生物活性存在差别 ，因此 ，发展高效新 型分离介质用于神经酰胺异构体分离是值得重视的 一 个研究方向。 参考文献： 1] 何学民．神经酰胺 的性质及其在化妆品中的应用 [J]．日用化 学 工业 ，1996，4：35—37． 2] Hannun Y A．Functions of ceramide in coordinating cellular responses to stress[J]．Science，1996，274：1855—1859． 3] Cremesti A E，Fischl A S．Current methods for the identification and quantitation of ceramides[J]．Lipids．2000，35(9)：937— 945． 4] 菲利普 M，卢皮 B，辛默里亚 D．神经酰胺类化合物制备方法 及其用途[P]．CN：96 101 950，1996． [5] 1wamori M，Costello C，Maser H．Analysis and quantitation of free ceramide-containing nonhydroxy and 2-hydroxy fatty acids and 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位 ，烟台大学副教授 ，主要从事精细化工方面的教学和研究 工作 ，已发表论文多篇。 Synthesis of N ，N-Dimethyltryptamine Derivative LIU De．chen‘ ，JIANG Ai．．．1i，GUO Qing．hua‘ (1．College of Chemistry and Biology，Yantai University，Yantai 264005，China；2．1nsititute of Food Science and Engineering，Yantai University，Yantai 264005，China ) Abstract：N，N．Dimethyl一2一{5-[(3．amino．1，2，4．oxdiazo1．5．y1)methy1]一1H．indol-3．yl}ethylamine(Ⅶ )was prepayed with furanidine and p-cyanomethy1．phenylhydrazine(X ) as main reactants．Furanidine reacted with hydrogen chloride gas to give 4．chlorobutanol(XV)in 62％ yield．XV was oxidized by chloro-chromic acid pyridine saIt，leading to 4．chlorobutanal(X1V)in 61％ yield．X1V was converted to 4．chlorobutanal dimethyl acetal(珊 )in 56％ yield．)皿 reacted with dimethylamine to form 4．(N，N-dimethylamino)butanal dimethyl acetal IX in 86％ yield．Cyclization reaction of IX with X gave N，N-dimethyl-2-[5-(cyanomethy1)-1H-indol-3一y1]ethylamine(XI) in 76％ yield．Esterification of XI gave N，N-dimethyl-2-[5-(eth0xycarb0nylmethy1)-l H-indol-3-y1]ethylamine (XII)in 82％ yield，XII condensed with hydr0xyguanidine sulfate to form the final productⅦ in 66％ yield． Key words：N，N-dimethytryptamine derivative；agent of migraine；4-chlorobutanal (上接第 384页) 作者简介：谢建平(1976一)，男，福建武平人，1999年毕业于 生，研究方向为生化分离。主要从事神经酰胺分离新技 清华大学化工系 ，现为清华大学化工系生化研究所硕士研究 术研究。 Ceramides and Recent Developments in Their Isolation and Analysis XIE Jian-ping，ZHANG Min-lian，LIU Zheng (Department of Chemical Engineering，Tsinghua University，Beifing 100084，China ) Abstracts：Ceramides are an important class of compounds due to their role as biologically active molecules and as intracellulay second messengers，showing a great applicable potential in cosmetics and pharm aceutical industry．The identification of the molecular structure of ceramides and the preparative separation process for ceramides aye crucial for elucidating their function in metabolism and for their potential applications．Presented in this paper is an 0verview of the recent establishment and future perspectives in the analysis and the separation methods for ceramides． Key words：ceramides；high perform ance liquid chromatography；chromatographic isolation ；analysis 维普资讯 http://www.cqvip.com