高温变性豆粕酶改性过程中蛋白质结构的变化

食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES 42 2011 Vol. 37 No. 4 (Total 280) 高温变性豆粕酶改性过程中蛋白质结构的变化* 任为聪1，程建军1，张智宇1，赵伟华1，江连洲1，2 1(东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨，150030)2(国家大豆工程技术研究中心，黑龙江 哈尔滨，150030) 摘 要 研究了高温变性豆粕(HDDSF)酶改性过程中蛋白质的结构变化，分析了高温变性豆粕蛋白质溶解性 提高与结构的关系。在不同水解度(DH)下，检测酶改性处理前后的可溶性蛋白质的的面巯基(SSH)、自由巯 基(FSH)、总巯基(TSH)、二硫键(-S-S-)和表面疏水性(H0) ，通过 SDS-PAGE 图谱分析蛋白亚基变化。随着 DH 的提高，高温变性豆粕蛋白质溶解性增加，自由巯基和表面疏水性下降，总巯基和二硫键先上升后下降。经酶改 性后蛋白质溶解性明显提高，酶解促使高温变性豆粕的不溶性蛋白质生成了以二硫键为主要化学键连接的可溶 性聚合物，在酶继续作用下，生成的聚合物被最终酶解。 关键词 高温变性豆粕，酶改性，二硫键，表面疏水性 第一作者:硕士研究生(程建军副教授为通讯作者)。 * 黑龙江省科技项目任务书(GB08B401 － 02) 收稿日期:2010 － 12 － 28，改回日期:2011 － 02 － 10 高温变性豆粕是大豆炼油后的副产物，炼油工艺 中高温脱溶步骤会造成蛋白质的热变性，导致溶解性 较差。蛋白质许多重要的功能特性依赖于蛋白质的 溶解性得以体现［1］。通过酶法改性可以提高蛋白质 的溶解性。对酶改性过程中蛋白质结构变化进行分 析比较，有助于了解此过程中的反应机理，具有一定 的理论指导意义。酶解技术已广泛应用于食品加工 领域，Jens［2］依据 Linderstrom-Lang 的理论提出了酶 解蛋白质的模型，并指出在此过程中蛋白质的溶解性 受到蛋白质变性程度和酶的影响。此后国内外研究 者利用植物性蛋白酶［3 － 4］、动物性蛋白酶［5 － 8］和微生 物蛋白酶［9 － 11］改性不同来源的蛋白质，以提高蛋白 质的溶解性。酶改性起始阶段由于加热导致蛋白质 产生聚合物［5］，随着反应的进行，聚合物消失，蛋白 质可电离氨基酸和羧基基团大量暴露，增强了与水的 结合作用［4，6］。巯基和二硫键作为维持蛋白质高级 结构重要的组成部分［12］，一直是检测蛋白质结构变 化的一种。Hsu 和 Wang［13 － 14］通过对高压处理 后的罗非鱼和大豆分离蛋白的巯基进行检测，发现含 量明显减少，证明蛋白质结构变的松散。对热处 理［15］等其他处理后的蛋白质结构变化，同样可以通 过对巯基的检测进行分析。Groleau［16］通过对酶解后 的乳蛋白聚合物进行分析发现，二硫键是形成聚合物 的主要因素。Wagner［17］认为，蛋白质的溶解性受到 多种因素影响，可通过检测表面疏水性来完成。酶解 产物的浊度能反映出在其溶液中的聚集程度， Doucet［18］发现经 Alcalase蛋白酶酶解后的乳清蛋白， 随酶解时间的延长，酶解产物在 pH 3. 0 ～ 5. 0 范围内 的浊度减小，聚集物减少。考虑到酶解是一个复杂的 反应过程，因此结合前人的研究结论和方法，对酶解 过程中蛋白质结构的变化进行详细的分析。将酶解 技术引入到改性高温变性豆粕中，通过酶解过程中蛋 白质结构中巯基和二硫键的检测，试讨论酶改性提高 高温变性豆粕溶解性的机理性问题。 1 材料与方法 1. 1 试验材料 高温变性豆粕:黑龙江省双鸭山市杨霖油脂厂。 1. 2 试验仪器及试剂 HYP － 2 型消化炉，上海纤检仪器有限公司;恒 温水浴锅，余姚市东方电工仪器厂;电动搅拌桨，金坛 市中大仪器厂;飞鸽 TDL － 40B 离心机，上海安亭科 学仪器厂;PHS － 3C 酸度计，上海雷磁仪器厂;TDW 马弗炉，温州市双屿仪器厂;722 型可见分光光度计， 上海光谱仪器有限公司;4500 型荧光分光光度计，日 本日立公司;B － 290 型喷雾干燥机，瑞士 Buchi 公 司。 Alaclase蛋白酶(实测酶活力 198 638. 3 U /mL) ， 丹麦 Novo公司;Tris、SDS、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰 胺、尿素、1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS) ，Sigma 公司;甘 氨酸、β-巯基乙醇、5，5 ＇-二巯基二硝基苯甲酸(DT- NB)、EDTA，Amresco公司;14. 4 ～ 97. 4 ku蛋白Mark- er，中国科学院上海生物化学研究所;3，5-二硝基水 杨酸(DNS) ，为国产化学纯;其他试剂均为国产分析 研究报告 2011年第 37卷第 4期(总第 280期) 43 纯。 1. 3 试验方法 1. 3. 1 高温变性豆粕成分及可溶性蛋白质测定方法 蛋白质溶解性 =上清液蛋白质含量 /样品总蛋白 含量;蛋白质含量测定(GB 5009. 5 － 2003) ;粗脂肪 测定(GB 5009. 6 － 2003) ;灰分测定(GB 5009. 4 － 2003) ;水分测定(GB 5009. 6 － 2003) ;粗纤维测定 (GB 5009. 10 － 2003) ;总糖含量测定参考文献［19］; 酶活力测定:按照福林 －酚法(SB /T 10317 － 1999) ; DH测定:pH － stat方法参照文献［20］。 1. 3. 2 碱性蛋白酶改性过程 粉碎过 80 目筛的原料→加水调节适当浓度→调 节适当 pH值→加碱性蛋白酶→用 2 mol /L 的 NaOH 调 pH值进行水解→酶解液→沸水浴灭酶活 10 min →离心分离(5 000 g，10 min)→测定上清液蛋白质含 量→上清液喷雾干燥。 1. 3. 3 电泳检测 参照 Laemmli［21］提出的方法，具体方法如下:选 取 12 %分离胶和 5 %的浓缩胶进行还原和非还原电 泳(上样缓冲液中不添加 β-巯基乙醇)。电泳前样品 沸水浴处理 5 min，吸取 10 μL样品上样，选取 Marker 范围为 14. 4 ～ 97. 4 ku。起始电压 70 V，待样品进入 分离胶，调整电压为 120 V。染色剂为 2. 5 g /L 考马 斯亮蓝 R －250(甲醇∶水∶冰乙酸体积比为 23∶ 23∶ 4) 的混合溶液，脱色剂为(甲醇 ∶ 水 ∶ 冰乙酸体积比为 9∶ 9∶ 2)混合溶液。 1. 3. 4 表面巯基与自由巯基含量的测定 表面巯基与自由巯基含量的测定依据 Ellman［22］ 提出的理论，参照 Tang［23］的方法进行测定的，具体方 法如下:取不同 DH的喷雾干燥样品溶于 4 mL Tris － 甘氨酸缓冲溶液中(Tris 0. 086 mmol /L，甘氨酸 0. 09 mol /L，EDTA 4 mmol /L，pH8. 0) ，样品浓度达到 5 mg /mL，再加入 50 μL Ellman 显色剂(4 mg DTNB 溶 于 1 mL 的缓冲溶液中) ，在室温下(25℃)反应 1 h， 反应结束后在 13600 g 条件下高速离心 10 min，在 412 nm下测定吸光值，不添加样品的溶液作为空白。 测定自由巯基含量时，在 Tris-甘氨酸缓冲溶液中再 加入 8 mol /L的尿素和 5 g /L 的 SDS，测定方法如同 表面巯基。巯基含量依据 Beveridge［24］提出的公式进 行计算。 1. 3. 5 总巯基和二硫键的测定 测定 ss 键的方法依据 Tannhauser［25］提出的理 论，参照 Tang［23］的方法进行测定。NTSB 溶液合成 方法:DTNB(0. 1 g)溶于 1 mol /L Na2SO3 中，调节 pH 为 7. 5。加入 50 μL 0. 1 mol / L 的硫酸铜铵溶液，在 38℃水浴下搅拌直至溶液颜色成浅黄色，20℃贮藏。 NTSB与二硫键反应生成的 NTB 在 412nm 下可测其 吸光值。NTSB溶液与 pH 9. 5 的 0. 2 mol / L tris缓冲 溶液(Tris 0. 2 mol / L 甘氨酸 0. 09 mol /L，EDTA，10 mmol /L，尿素 8 mol /L，SDS 5 g /L和 Na2SO3 0. 1 mol / L)以 1∶ 100 的比例混合，备用。将不同 DH的喷雾干 燥样品溶于 0. 2mol / L tris 缓冲溶液中，浓度为 25 mg / mL。取 0. 1 mL样品溶液与 3 mL 的 NTSB 混合 缓冲液相混合，室温下(25℃)反应 25 min，在 412 nm 下测其吸光值，二硫键含量 =(总巯基 －自由巯基)/ 2。 1. 3. 6 表面疏水性测定 参照 Wagner［17］的方法利用 ANS 作为荧光探针 测定不同 DH 样品的表面疏水性 H0，具体方法如下: 样品溶于 0. 01 mol /L 的磷酸缓冲溶液(pH 7. 0)中， 制成 0. 0125% ～0. 1 %(w /v)的溶液。25 μL的 ANS 溶液(溶于相同缓冲溶液制成 8. 0 mmol /L 的溶液) 添加到 5 mL 的样品溶液中，避光反应 15 min。在 360 nm(激发波长) ，490 nm(发射波长)的条件下进 行测定样品荧光强度。以样品浓度和荧光强度作图， 斜率即为表面疏水性 H0。 1. 3. 7 浊度分析 依据 Groleau［16］的方法。选取 pH3. 0 ～ 10. 0 的 不同缓冲溶液(0. 1 mol /L 的柠檬酸溶液与 0. 2 mol / L的 Na2HPO4 溶液配制 pH 3. 0，4. 0，5. 0 的缓冲液; 0. 2 mol /L的 Na2HPO4 溶液与 0. 2 mol /L的 NaH2PO4 溶液配制 pH 6. 0，7. 0，8. 0 的缓冲液;0. 1 mol /L 的 Na2CO3 溶液与 0. 1 mol /L 的 NaHCO3 溶液配制 pH 9. 0，10. 0 的缓冲液)将不同 DH 样品配制成 1 %的 溶液，室温下(25℃)下平衡 1 h后，在 500 nm条件下 测定吸光值。 1. 4 数据处理及分析 采用 Microsoft Excel 2003 进行数据处理;采用 SPSS 13. 0 进行相关分析;采用 origin 8. 0 进行作图处 理。 2 结果 2. 1 高温变性豆粕部分指标测定 由表 1 可知，高温变性豆粕的蛋白质含量(干 基)可达到 49 %左右，蛋白质资源丰富，但其可溶性 蛋白质含量仅占蛋白质总量的 21 %左右，由于热变 食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES 44 2011 Vol. 37 No. 4 (Total 280) 性的原因，蛋白质高级结构变化，肽链松散，大部分疏 水基团大量暴露在蛋白质肽链外部，这是导致蛋白质 溶解性下降的根本原因［1］。 表 1 原料主要成分指标分析结果 蛋白质含量 /% 粗脂肪含量 /% 灰分含量 /% 水分测定 /% 总糖含量 /% 粗纤维含量 /% NSI /% 48. 89 ± 0. 39 5. 45 ± 0. 28 5. 02 ± 0. 08 9. 88 ± 0. 15 11. 98 ± 0. 11 9. 64 ± 0. 97 21. 24 ± 0. 52 注:总糖含量不包含纤维素、半纤维素和木质素等。 2. 2 不同 DH对高温变性豆粕溶解性的影响 由图 1 可知，随着酶解的开始，与原料溶解性相 比，在 DH1 %时高温变性豆粕的溶解性急剧上升，溶 解性从 21. 24 %提高到 72. 65 %，提高了 51. 41 %， 随后溶解性缓慢地提高;当 DH达到 12 %时，溶解性 达到 88. 33 %，随后变化不再显著(P ＜ 0. 05) ，与原 料相比溶解性提高了 67. 09 %。酶解过程中，高度变 性的高温变性豆粕蛋白质在酶的作用下，被酶解成较 长肽链溶于水中，随着肽链继续被酶解，长肽链被进 一步酶解为分子量更小的短肽［6］，因此，通过控制 DH值可以达到控制高温变性豆粕的溶解性。 图 1 DH对高温变性豆粕溶解性的影响 注:a － h表示溶解性的差异显著性(P ＜ 0. 05) 2. 3 不同 DH 的高温变性豆粕可溶性蛋白质 SDS- PAGE电泳分析 利用 SDS-PAGE电泳对酶解过程中蛋白质的结 构变化进行进一步的分析。由图 2(a)还原型电泳图 谱可知，β-半球蛋白的 α 和 α ＇亚基首先被酶解，DH 为 1 %时便被酶解消失，在分子量为 20. 1 ～ 31. 0 ku 之间形成新条带;β-半球蛋白的 β亚基和球蛋白的 A 亚基条带在图谱上随 DH的提高而减弱，当 DH为 10 %时条带在图谱上消失;球蛋白的 B 亚基条带也呈 减弱趋势，但在 DH为 14 %时，仍可见部分未酶解的 B亚基条带。 由于非还原电泳样品缓冲液中不含有 β-巯基乙 醇，因此蛋白质的共价键未被破坏，见图 2(b)。随酶 解的进行，在 43. 0 ～ 66. 2 ku 形成了新条带，此条带 为通过二硫键连接的 AB亚基聚合物［26 － 27］，在 DH为 10 %时被酶解消失。其他亚基条带随 DH 的提高均 呈现减弱趋势，形成了分子量更小的肽而聚集在谱图 的最下端。 (a)还原型;(b)非还原性 图 2 不同 DH的高温变性豆粕可溶性蛋白质 还原型(a)与非还原型(b)SDS-PAGE电泳分析 2. 4 不同 DH对高温变性豆粕可溶性蛋白质巯基与 二硫键的影响 由图 3 可知，随着 DH 的提高，表面巯基(SSH) 先由对照样的 3. 70 μmol /g 下降到 8 % 时的 1. 99 μmol /g随后再次上升到 2. 39 μmol /g，而自由巯基 (FSH)一直呈现下降的趋势，从 5. 92 μmol /g 下降到 DH 为 6% 时的 4. 04 μmol /g，并趋于平缓(P ＜ 0. 05)。总巯基(TSH)和二硫键(－ S － S －)随着酶 解的开始，在 DH 为 1%时急剧上升，分别从 15. 79 μmol /g 和 6. 71 μmol /g 上升到 25. 29 μmol /g 和 20. 67 μmol /g，随后随 DH 的提高而下降，最终下降 到 13. 91 μmol /g和 9. 81 μmol /g，证明先形成了依靠 二硫键连接的蛋白质结构，随后逐渐被破坏。巯基和 二硫键的变化，可以反映蛋白质在此酶解过程中的结 构变化，随着酶解的进行，形成巯基和二硫键的半胱 氨酸残基被酶破坏，使得在整体呈现下降趋势。 2. 5 不同 DH对高温变性豆粕可溶性蛋白质表面疏 水性的影响 由图 4 可知，酶解对高温变性豆粕蛋白质的表面 疏水性产生影响。随着酶解的开始，与原料相比，在 DH为 1%时表面疏水性急剧下降，从 596. 6 下降到 341. 67，证明酶解对其破坏显著，随后在 DH为 6%时 下降到 255. 94 并趋于平缓(P ＜ 0. 05) ，而后在 DH为 14%时再次下降，这可能由于酶解使得疏水性氨基酸 研究报告 2011年第 37卷第 4期(总第 280期) 45 图 3 不同 DH对高温变性豆粕巯基与二硫键 的影响 注:a － h，i － n，o － u 和 1 － 7 分别表示表面巯基，自由巯 基，总巯基和二硫键的差异显著性(P ＜ 0. 05) ;对照为原 料高温变心豆粕可溶性蛋白质。 残基含量减少并达到短时的平衡，随 DH 的再次提 高，破坏了这种平衡，使得疏水性氨基酸残基的含量 再次下降。 图 4 不同 DH对高温变性豆粕表面疏水性的影响 注:a － f表示表面疏水性的差异显著性(P ＜ 0. 05) ;对照 为原料高温变心豆粕可溶性蛋白质。 2. 6 pH值对高温变性豆粕各水解产物浊度的影响 由图 5 可知，随 DH的提高，样品在各 pH值条件 下浊度的吸光度均下降。所有样品在 pH 值 3. 0 ～ 5. 0 时的浊度，高于 pH值 6. 0 ～ 10. 0 时的浊度，对照 样与 DH为 1 %、2 %、4 %、6 %的样品在 pH 值 4. 0 时浊度到达最高，随后下降，而浊度为 8 %、10 %、12 %和 14 %的样品随 pH 值上升，浊度一直下降;当 pH值 6. 0 后，所有样品浊度下降均趋于平缓(P ＜ 0. 05)。由于大豆蛋白质的等电点在 4. 5 左右，在此 pH区间蛋白质发生聚集，浊度较大，随 DH 的提高， 酶对蛋白质结构破坏加深，使得酶解产物在大豆蛋白 等电点附近的浊度下降。 3 讨论 不同 DH 的高温变性豆粕酶解产物在蛋白结构 上有明显的差异，因此直接影响其溶解性。在酶解的 图 5 不同 pH对各水解产物浊度的影响 注:对照为原料高温变心豆粕可溶性蛋白质。 开始阶段，β-半球蛋白的各亚基最先被破坏(见图 2) ，表面巯基、自由巯基的下降，总巯基的上升，说明 外部巯基没有转移至内部，而是蛋白质之间的表面巯 基转化为二硫键，使蛋白质相互结合，形成可溶性聚 集物(见图 2b)。Groleau［16］认为，乳蛋白的酶解物通 过非共价键(疏水作用力)和共价键(二硫键)共同作 用形成了聚合物，但聚合物的形成受到离子强度、pH 和温度等多方面因素的共同影响。Doucet［18］则认为 酶解形成聚合物的反应与类蛋白反应十分相似，二硫 键不是形成聚合物的重要因素，疏水作用力、氢键和 静电相互作用是形成重要因素。 每个大豆球蛋白中存在 6 对由 A和 B 亚基通过 二硫键相互连接形成的亚基对［28］，因此天然大豆蛋 白的二硫键主要集中在大豆球蛋白中。随着酶解的 继续进行，大豆球蛋白 A、B 两亚基(见图 2a)和 AB 聚合物(见图 2b)开始被酶解，自由巯基、总巯基和二 硫键下降(见图 3) ，说明在酶的作用下，形成巯基和 二硫键的半胱氨酸残基被酶破坏，当聚合物和 A、B 两亚基结构破坏，内部的半胱氨酸残基被暴露在外 部，造成表面巯基的再次上升。不同 DH的高温豆粕 酶解产物在大豆蛋白等电点附近浊度的下降，进一步 说明了酶解产物结构的变化，它们之间的相互作用在 酶的作用下在减弱。 本研究中，表面疏水性一直呈现下降趋势，形成 的聚合物表面疏水性氨基酸残基较少，说明整个过程 中疏水性氨基酸残基一直被破坏，蛋白质分子量变小 (见图 2)。这与 Guan［6］的结论一致，Guan 认为破坏 致密的蛋白质结构，蛋白质分子量的减少，以及带电 荷的亲水基团的大量暴露，疏水基团的减少是酶解提 高蛋白质溶解性的重要过程。其他研究者同样认为 亲水基团的大量暴露是酶解提高蛋白质溶解性的原 因［3，5］。 食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES 46 2011 Vol. 37 No. 4 (Total 280) 4 结论 (1)随 DH的提高，酶改性后的高温变性豆粕蛋 白质溶解性明显提高。 (2)酶解过程中，高温变性豆粕的表面疏水性不 断下降;浊度随 pH 的上升呈下降趋势;不溶性蛋白 质形成了以二硫键为主要化学键连接的可溶性聚合 物;随着酶解的进一步进行，可溶性聚合物结构被酶 破坏，蛋白质分子量减小，二硫键含量下降。 参 考 文 献 ［1］ 赵新淮，徐红华，姜毓君． 食品蛋白质—结构、性质与 功能［M］． 北京:科学出版社，2009. ［2］ Jens A N． Enzymatic Hydrolysis of Proteins for Increased Solubility［J］． Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1976，24(6) :1090 － 1093. ［3］ Tsumuraa K，Saitoa T，Tsuge K，et al． Functional proper- ties of soy protein hydrolysates obtained by selective prote- olysis［J］． LWT － Food Science and Technology，2005， 38:255 － 261. ［4］ Lamsal B P，Jung S，Johnson L A． Rheological properties of soy protein hydrolysates obtained from limited enzymatic hydrolysis［J］． LWT - Food Science and Technology， 2007，40:1 215 － 1 223. ［5］ Yin S W，Tang C H，Cao J S，et al． Effects of limited en- zymatic hydrolysis with trypsin on the functional properties of hemp (Cannabis sativa L．)protein isolate［J］． Food Chemistry，2008，106:1 004 － 1 013. ［6］ Guan X，Yao H Y，Chen Z X，et al． Some functional properties of oat bran protein concentrate modified by tryp- sin［J］． Food 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Effect of Enzymic Modification Treatment on Structural Characteristics of Commercial Highly Denatured Defatted Soy Flakes Ren Wei-cong1，Cheng Jian-jun1，Zhang Zhi-yu1， Zhao Wei-hua1，Jiang Lian-zhou1，2 1(College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China) 2(National Soybean Engineering and Technique Research Center，Harbin 150030，China) ABSTRACT The effects of enzymatic modification (EM)treatment on structural characteristics of highly denatured defatted commercial soy flakes (HDDSF)were investigated in order to analyze the relationship between its solubility and structure． Protein solubility，surface hydrophobicity (Ho) ，surface sulfhydryl (SSH)content，free sulfhydryl (FSH)content，total sulfhydryl (TSH)content and disulfide bond (－ S － S －)content were evaluated． Protein sub- units profiles for the hydrolysate were altered by the EM treatment and major changes were observed for the hydroly- sate． With DH increasing，the solubility of HDDSF was increased significantly． The SSH content，FSH content and the TSH content were showed different changes，above all the － S － S － content of HDDSF was significantly increased after EM treatment at DH1 %，but was gradually decreased with further increase in DH． Analysis showed that the sol- uble aggregates were formed during EM treatment． Covalent interactions (i． e． disulfide bonds)was involved in the formation of soluble aggregates． The formation of soluble aggregates significantly improved the solubility of HDDSF， and the soluble aggregates were hydrolyzed by Alaclase thereafter． Key words highly denatured defatted soy flakes，enzymic modification treatment，disulfide bond content，surface hy- drophobicity (Ho)