Calpain裂解Atg5决定中性粒细胞发生自噬还是凋亡_以及C5a在其中的可能

Calpain裂解 Atg5决定中性粒细胞发生自噬 还是凋亡，以及 C5a在其中的可能作用 * 张保全 1, 2)郭振辉 2) 房 巍 2) 吕凤林 1)** (1)第三军医大学大坪医院野战外科研究所，创伤烧伤与复合伤国家重点实验室，重庆 400042; 2)广州军区总医院MICU科，广州 510010) 摘要 通过阐明 C5a、calpain和 Atg5相互作用，为开展新的研究寻找方向．中性粒细胞凋亡控制炎症反应及其强度，多种 疾病和中性粒细胞凋亡失调有关，但其发生机制尚未阐明．C5a为补体片段，有多种功能，如诱导中性粒细胞趋化、呼吸爆 发、增强吞噬、颗粒酶释放和延迟凋亡．已知 calpain涉及中性粒细胞功能及凋亡调节并对该凋亡发生具有特异性．不同刺 激因素可通过不同路径调节不同 calpain亚型的活性．已有报道 C5a可以通过调节 calpain亚型活性而调节中性粒细胞的趋化 反应．另外，自噬是真核细胞中广泛存在的生物过程，具有细胞保护作用，Atg5对于自噬体形成必不可少．Calpain可裂解 Atg5为 24 ku tAtg5，使其失去形成自噬体的功能并介导凋亡．Atg5参与了自噬和凋亡的转换． 关键词 中性粒细胞，凋亡，自噬，Atg5，calpain，C5a 学科分类号 R563，R310.34 * 国家自然科学基金资助项目 (39770315, 39970330, 30371339, 30571748)和广州市科委攻关引导资助项目(07Z-E0261). **通讯联系人. Tel: 023-68757413, E-mail: lufenglin001@yahoo.com.cn 收稿日期：2008-08-13，接受日期：2008-09-11 生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biophysics 2008, 35(12): 1358~1363 www.pibb.ac.cn 综述与专论Reviews andMonographs 中 性 粒 细 胞 (polymorphonuclear neutrophil， PMN)是机体防御外来病原体的第一道细胞防线， 在趋化因子作用下可聚集到炎症部位，并吞噬异 物、通过呼吸爆发和脱颗粒杀灭病原体，同时释放 细胞因子扩大炎症反应．PMN的凋亡控制炎症反 应的时间和强度．生理情况下，PMN自发性凋亡 而保持体内 PMN的数量稳定．急性炎性情况下， 它们从血液中迁移到炎症组织，促炎介质使 PMN 凋亡延迟，这是 PMN聚集的重要机制之一，在炎 症急性阶段可能有重要的作用．许多促炎介质 (C5a、GM-CSF、 fMLP)被认为是 PMN 的存活因 子，它们通过不同路径延迟 PMN的凋亡．PMN适 时凋亡可减轻对组织的损害，巨噬细胞吞噬凋亡的 PMN时不释放炎性介质，所以它们的凋亡不会严 重损害机体．PMN凋亡紊乱和多种急性和慢性炎 症性疾病相关[1]． 人 C5a 是补体系统级联反应的终末活化产 物．由 74个氨基酸组成，与 C3a、C4a 同称为过 敏毒素， C5a通过其受体 C5aR产生生物学效应， C5aR是 G蛋白偶联受体，属于典型的趋化因子受 体家族．C5a为重要的前炎性介质，起炎症启动和 放大作用，有很多促炎作用，如引起血管舒张、血 管通透性增加，对 PMN有强烈的趋化作用，并能 促使 PMN脱颗粒和呼吸爆发，还能协同其他介质 进一步促进白细胞的活化 [2]，C5a 也延迟 PMN 凋 亡[3]．C5a参与了许多炎性疾病进程[4]． Calpains是钙依赖性的半胱氨酸蛋白酶，通过 特异性蛋白水解作用调节多种酶和蛋白质的功能． 一些 calpain在体内普遍存在，而另一些 calpain局 限在特定的组织．Calpains 超家族的两个主要成 员：calpain 1(μ-calpain)和 calpain 2(m-calpain)，都 由两个不同的多肽亚基组成．大亚基(80 ku)具有催 化活性，小亚基(30 ku)具有调节功能．CAPN1 和 CAPN2 基因分别编码 μ-calpain 和 m-calpain 的大 亚基．Calpains 大亚基由 4 个区构成：Ⅰ区是 calpains的 N端单螺旋结构，可以和无催化活性的 小亚基Ⅵ区相互作用，起稳定作用．Ⅱ区为蛋白酶 区，有活性位点．Ⅲ区是一个 C2样区，以钙依赖 张保全等：Calpain裂解 Atg5决定中性粒细胞发生自噬还是凋亡，以及 C5a在其中的可能作用2008; 35 (12) 自噬涉及到生长发育、衰老、组织稳态的控 制．神经变性、肿瘤、Huntington 病、Parkinson 病、肌病和心肌病等都涉及到自噬调节紊乱[6]．自 噬还诱导 2型程序性死亡类型．此外，自噬还具有 防御细菌和病毒入侵、抗原递呈及调节 T细胞的 作用 [9]．20 多年前，研究者观察立克次体感染的 PMN，发现有自噬样囊泡降解胞内细菌的征象[10]， 观察周期性 PMN减少症患者，发现 PMN减少阶 段分叶核 PMN自噬增加[11]． 1 C5a可能通过 calpain途径延迟 PMN凋亡 1．1 PMN 通过 calpain-1 裂解 Bax 释放 Smac/ Diablo发生自发性凋亡 Birgit等[12]报道 calpains协同 caspases促进 PMN Fig. 1 Regulation of autophagy in mammalian cells and autophagy involves the two ubiquitin-like conjugation pathways[7,8] 图 1 哺乳动物细胞自噬的调节以及自噬过程涉及两个泛素样系统[7,8] TOR被认为是自噬的中心调节子．Ⅰ类 PI3K阻滞自噬，Ⅲ类 PI3K 刺激自噬．氨基酸(amino acid)和生长因子(growth factors)、胰岛素 (insulin)等阻滞特征性自噬．诱导自噬的过程中，需要形成隔绝膜，这个过程中涉及两个泛素样连接系统：Atg12-Atg5和 Atg8-PE(虚线方框 内). TOR：target of rapamycin；Atg：autophagy-related gene product；PE：phosphatidylethanolamine；⊥：阻滞；↓：促进. 的方式连接磷脂．大亚基和小亚基的Ⅳ和Ⅵ区都 包含有 5个 EF手，来自两个亚基的第 5个 EF手 相互作用并形成异二聚体，为钙结合区．小亚基的 Ⅴ区富含甘氨酸，结构易变．Calpain 活性由钙、 磷脂、ERK/PKA和内源性阻滞剂调节[5]． 细胞内蛋白质的降解涉及两条途径：泛素蛋白 酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)和自 噬溶酶体途径，分别调控短寿命和长寿命蛋白、细 胞器的降解，从而保证蛋白质的正常工作，维持细 胞的正常运行．90%的蛋白质降解通过自噬路径． 自噬 (autophagy) 这个词来源希腊词汇，意思是 “self”和“eating”．1962 年，Ashford 和 Porten 发现自噬现象．近 10年，随着分子生物学的发展， 首先在酵母中发现了参与自噬的分子机制，随后在 哺乳动物中也发现有相似机制，对自噬的研究才有 了重大发展． 自噬是基本的细胞稳态过程，在所有的真核生 物中高度保守．在自噬过程中，一个隔绝膜包绕部 分胞浆，形成了一个双重膜结构自噬体．自噬体和 溶酶体融合后，自噬体内的胞浆成分被降解．大部 分细胞都有一定基本水平的自噬． 自噬主要通过 TOR(target of rapamycin)、Ⅰ类 PI3K和Ⅲ类 PI3K调节．氨基酸缺乏和生长因子撤 除也可诱导特征性自噬．其中 TOR处于中心环节 (图 1)．TOR 是丝 / 苏氨酸激酶，调节细胞生长、 代谢及自噬．TOR 在两个不同的水平诱导自噬： 转录和自噬体形成．首先，它直接或间接引起自噬 蛋白 Atg13(autophagy-related gene product 13)高度 磷酸化，从而降低了 Atg13和 Atg1的亲和力，阻 滞了自噬．饥饿或者 rapamycin 处理阻滞 TOR 则 导致 Atg13部分去磷酸化，从而通过两个泛素样连 接系统而诱导自噬体形成，这个过程由 ATG蛋白 介导．自噬体膜形成和延长由两个特异性的蛋白质 结合系统促进，Atg5在其开始阶段有重要作用． 其次，TOR通过调节某些基因的转录和翻译而调 节自噬，其中就包括 ATG5[6]．生长因子刺激Ⅰ类 PI3K通过膜连的 Akt/PKB及 PDK1活化 TOR阻滞 自噬，PTEN通过阻断Ⅰ类 PI3K而促进自噬[6]． PE PE Atg7 Atg10 Atg12Atg12 Atg12 Atg12 Atg12 Atg8 Atg8 Atg8 Atg8 Atg8 Atg7 Atg7 Atg7 Atg7 Atg7 Atg10 Atg10Atg5 Atg5 Atg5 Atg16 Atg16 Atg3 Atg3 Atg3 Atg4 Ⅲ类 PI3K 氨基酸 葡萄糖 Ⅰ类 PI3K TOR Atg 胰岛素 生长因子 自噬 1359· · 生物化学与生物物理进展 Prog. Biochem. Biophys. 2008; 35 (12) 凋亡，其内源性阻滞剂和其他活化位点的阻滞剂均 可阻止 calpain 介导的 PMN 凋亡 [13]．μ-calpain 是 PMN中存在的主要亚型[14]，μ-calpain 介导艾滋病 (AIDS)患者PMN凋亡，患者 PMN有较高基础水 平的凋亡且和胞内 calpain活性增加严格相关，使 用 PIs(抑制 calpains 活性)治疗 3 个月后，calpain 活性和 PMN凋亡都恢复到正常水平，活体外 PIs 也有同样的抗 calpain活性和抗凋亡的作用，该研 究还认为，AIDS患者用 PIs治疗后 PMN存活时间 延长，主要是阻滞了 μ-calpain，而不是抗病毒作 用 [15]．Altznauer 等在凋亡的 PMN 中发现 calpains 内源性阻滞剂 calpastatin 的水平明显降低及 μ-calpain活化．用 μ-calpain特异性的阻断剂或者 将 calpastatin肽移入胞内能阻断这个进程．进一步 的生化研究发现，在自发和 Fas受体诱导的 PMN 凋亡中，药物阻断 calpain 后防止了 Bax 裂解为 18 ku的片段，使其失去和 Bcl-xL结合的能力，此 外，还阻断了线粒体释放细胞色素 c和 Smac，而 这在 caspase-3活化中是必不可少的．囊性纤维病 病人中的 PMN现为凋亡延迟，将其和健康对照 组的 PMN对比，发现 calpastatin 的蛋白质水平明 显地增加，μ-calpain 的水平明显减少 [14]．因此 μ-calpain在 PMN中自发性凋亡中有重要作用(图 2). Calpain也通过裂解 Bcl家族成员、AIF、转录 因子、caspase-12等参与凋亡的调节[16～19]．不过在 PMN中尚没有相关证据． 1．2 C5a调节 calpains活性并延迟 PMN的凋亡 Hadad等[15]认为 calpain处于 PMN多种功能和 凋亡调节的中心．已有研究显示，C5a通过 PI3K 及 ERK 路径使 Bad 磷酸化或者增强 X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP)的表达而抑制 PMN 的 凋亡 [20～22]，C5a 可增加细胞中 cAMP 的水平延迟 PMN 凋亡 [23, 24] (图 2)，而 ERK 和 PKA 均参与了 calpain活性的调节[5]．静止 PMN中 calpain活性处 于高水平， calpains 抑制 PMN 膜突，而阻断 calpain后，Rho GTPases Cdc42和 Rac活化，促进 了膜突和快速的趋化，这和大多数细胞正好相 反 [25]．Nuzzi 等 [26]发现 C5a 诱导 PMN 趋化时 μ-calpain、m-calpian 起重要而不同的作用． 我们 实验室李保胜、吕凤林等研究发现，C5a刺激肺泡 Ⅱ型上皮细胞(AT-Ⅱ)后胞浆 m-calpain 的含量增 加，并且出现了明显的活性片段，其时相性变化与 该细胞凋亡率相对应， calpain 特异性抑制剂 PD150606抑制 m-calpain的激活并降低了 AT-Ⅱ细 胞的凋亡率，而 μ-calpain的活性及含量没有出现 明显改变(本实验室研究结果)．不同的刺激因素可 以通过不同的路径活化不同的 calpain亚型．比如 IP-10 通过 cAMP-PKA 下调内皮细胞中 m-calpain 的活性[27]，EGF通过 MAPK路径活化角质化细胞 中的 m-calpain[28]，IP-9 通过钙 -PLCβ3(beta3)活化 角质化细胞中的 μ-calpain[29]．C5a 调节 calpain 的 具体路径及 calpain亚型在其中的作用正在研究中. 2 Calpain 裂解 Atg5 之后，使 PMN 由自 噬转换为凋亡 2．1 Atg5在自噬体形成前期有重要作用 自噬体的形成主要由 ATG(autophagy-related gene)的产物 Atg介导．Matsuura等 1997年发现了 第一个 ATG (autophagy-related gene)，迄今已鉴定 出 31 个 ATG 基因 [7]．Mizushima 等 [30]首先鉴定出 哺乳动物的自噬基因 ATG5和 ATG12．自噬体的 形成主要通过两个泛素样连接系统介导(图 1)： Atg12-Atg5 和 Atg8-PE．Atg 12-Atg 5 和 Atg 8-PE 连接系统也相互作用：如果前者有缺陷，则后者不 能靶向前自噬体结构 (PAS)；Atg 8-PE 的水平在 Atg12-Atg5的连接中也有重要作用．Atg12-Atg5连 接系统似乎是构成性的过程，因为 Atg12-Atg5 连 接的形成不依赖饥饿或者其他诱导自噬的情况．当 膜延长时，Atg12-Atg5表现出非对称局限，大部分 蛋白质和隔绝膜的凸面连接．当自噬体形成后这个 复合物将会和膜分离[8]．在酵母和哺乳动物细胞中 去除 Atg5能有效地阻滞自噬，Atg5在自噬体形成 的过程中有重要作用[31]． 2．2 Calpains 裂解 Atg5为 24 ku tAtg5后抑制自 噬而促进凋亡 除了调节自噬体形成外，Atg5在凋亡中可能 也有重要作用．Yousefi等报道[32]， Atg5经翻译后 修饰而在自噬和凋亡之间建立了联系．Atg5过表 达使多种细胞对于各种刺激更易凋亡．他们还指 出，活体中乳腺肿瘤细胞表达 Atg5的水平升高后 细胞更易死亡．Yousefi的重要贡献在于他在 PMN 中发现了 Atg5 裂解物 24 ku tAtg5．33 ku 的全长 Atg5 除了参与形成自噬体外，其被 calpain 裂解 后，裂解物 truncated-Atg5(1～193)(tAtg5)靶向线粒 体而具有促凋亡活性．在 PMN 自发性凋亡中 tAtg5在 7 h时出现，而在 GM-CSF存在下，其出 现时间大大延迟．在其他凋亡细胞中也观察到 24 ku tAtg5以同样的规律出现，经实验表明， 1360· · 张保全等：Calpain裂解 Atg5决定中性粒细胞发生自噬还是凋亡，以及 C5a在其中的可能作用2008; 35 (12) 3 展 望 综上所述，不同的刺激因素可通过不同的路径 活化不同的 calpain亚型，产生相应的生物学效应， C5a可能通过钙、ERK、cAMP-PKA调节 calpains 活性，后者可以裂解 Atg5 而调节 PMN的自噬和 凋亡．有必要进一步了解具体的 calpain亚型在这 其中的作用和调节．C5a影响 TOR活性调节自噬 也值得探讨．C5a和 calpains都是体内广泛存在的 物质，所有细胞都有一定的自噬水平，它们都参与 了许多共同的疾病，有必要进一步了解它们在疾病 进程中的相互作用． 参 考 文 献 1 Simon H U. 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Thr 193 Thr 193Thr 193 PI3K ERK1/2 AKT Bad cAMP XIAP Smac/diablo Bax Calpain-1,-2 mTOR Atg5 Bcl-XBcl-X truncatedAtg5 truncatedAtg5 凋亡 凋亡 凋亡 凋亡 自噬 1361· · 生物化学与生物物理进展 Prog. Biochem. Biophys. 2008; 35 (12) 2007, 152(4): 429～448 5 Goll D E, Thompson V F, Li H Q, et al. The calpain system. Physiol Rev, 2003, 83(3): 731～801 6 Reggiori F, Klionsky D J. Autophagy in the eukaryotic cell. Eukaryotic Cell, 2002, 1(1): 11～21 7 Klionsky D J. Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade. Nature Reviews/Molecular Cell Biology, 2007, 8(11): 931～937 8 Yang Y P, Liang Z Q, Gu Z L. et al. Molecular mechanism and regulation of autophagy. Acta Pharmacologica Sinica, 2005, 26 (12): 1421～1434 9 Beth L, Deretic V. Unveiling the roles of autophagy in innate and adaptive immunity. Nat Rev Immunol, 2007, 7(10): 767～777 10 Rikihisa Y. Glycogen autophagosomes in polymorphonuclear leukocytes induced by rickettsiae. 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Tel: 86-23-68757413, E-mail: lufenglin001@yahoo.com.cn Received: August 13, 2008 Accepted: September 11, 2008 Calpain-mediated Cleavage of Atg5 Determine Autophagy or Apoptosis of PMN, and C5a's Role* ZHANG Bao-Quan1, 2), GUO Zhen-Hui2), FANGWei2), L譈 Feng-Lin1)** (1)Research Institute of Surgery & Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China; 2)General Hospital of Guangzhou Military Area, Guangzhou 510010, China) Abstract Apoptosis of neutrophils controls the duration and the intensity of an inflammatory response and therefore the extent of neutrophil- mediated tissue damage, disturbance of neutrophil apoptosis has been associated with many diseases, underlying mechanism is not elucidated. C5a is a complement fragment that has multifunctional properties, which induces neutrophil chemoattraction, an oxidative burst, enhancement of phagocytosis, release of granule enzymes, and suppress neutrophil apoptosis. Several studies have reported calpain is involved in both neutrophil functions and apoptosis and it might play a more specific role in the regulation of neutrophil apoptosis. Diffenrent isoform of calpains is activted by diffenrent stimuli through different transduction pathway. It was reported previously that calpain is required for neutrophil migration and chemotaxis induced by C5a. In addition, autophagy is a ubiquitous physiological process that occurs in all eukaryotic cells and is considered to be a survival mechanism. Atg5 promotes autophagy and is indispensable to autophagosome formation. Upon calpain activation, Atg5 is cleaved and the resulting 24 ku Atg5 mediates apoptosis while losting the property of autophagy. Therefore, Atg5 represents a molecular switch between autophagy and apoptosis. The interaction among the C5a, calpain and Atg5 was introduced and new direction for further research was provided. Key words polymorphonuclear neutrophil, apoptosis, autophagy, Atg5, calpain, C5a 1363· ·