猪白细胞干扰素制备与检定方法

猪白细胞干扰素制备与检定 丫’ S 。 lo v ie v c ’〕等人 , 连续发了 4 篇 文 章 , 报导有关猪白细胞千扰素的试验结果 , 现综述如下 : 一、 猪白细胞干扰素制备方法 1 . 制备方法 分离猪白细胞 : 采血后 2 ~ 4 小时内 , 加 2 ~ 3 倍容积的0 . 83 %氯化 娅 溶 液、 摇 匀 , 4 ℃静置 10 分钟 。 取出 , 离心沉淀 1 0 0 0 转 /分 1 0分钟 。倒掉上清液 ( 血浆和 血 红 素 等 ) 。 白细胞用 1”营养液 ( 其中加 10 %牛 的羊膜液 ) 稀释成 10 “细胞 /毫升 。 加干扰素 活化 ( P r im in g ) 。 然后按每毫升细胞液加 1 0一 1 0 0 CID S 。 , 再加入新城 鸡 瘟 病 毒 ( N D V 一 H ) 诱导 , 孵箱3 7 oC 经过 1 8~ 2 0 小 时 。 取出 , 经离心沉淀 , 弃沉淀物 , 上清用 25 %盐酸调 p H 2 . 2 ~ 2 . 4 , 在 4 ℃条件下静 置 4 天 , 使病毒灭活 。 最后用20 %氢氧化钠 液中和 , 调 p H 至7 . 2 ~ 7 . 4 。 至此 , 制成粗 制猪白细胞干扰素 , 冰箱保存备用 。 2 . 营养液选择 在制 备试验中, S o lo v ie v 氏等以 1 9 9液 为基础 , 分别加 10 %猪血浆、 牛血清、 牛的 羊膜液、 猪的羊膜液 , 以及单用猪的羊膜液 等 5 种营养液 , 比较试验的结果 , 确 定 19 9 加 10 %牛的羊膜液效果最好 , 每毫克蛋白质 中的干扰素活性单位 (活力比值 , 干扰素单 位 / m g 蛋 白 ) 高 。 Sol o v 万e v等人认为 : 牛血 清中含有 白蛋 白和球蛋 白, 加到 1 99 中使 营 养液的蛋 白质含量增高 ; 而牛的羊膜液中是 多肤 , 不能增加营养液的蛋 白质含量 。 3 . 猪血选择 根据 S ol o v ie v 等人的试验观察 , 采用 猪血的月份与干扰素产量有关系 。 2 ~ 3 月 采血 , 干扰素的效价为1 28 ~ 2 56 单位 / m l, 4 一 5 月的更低 。 为6 4 ~ 22 5单位 / 二 1 , 6 ~ 1 0月的最高 5 1 2 ~ 2 0 4 5单位 / m l , 1 1 ~ 1 2 月的为 5 12 一 l岭 4单位 / m l。 从上述材料 看 , 6 ~ 1 0月之间采猪血制备干扰素 , 是较好的 时期 。 为什么不同的采血时期 , 对结果有明 显影响呢 了 作者未作解释 。 4 . 活化 通常在制备干扰素时 , 于诱导之前先加 些干扰素处理白细胞 , 使细胞活化有利于提 高干扰素产量 , 这个步 骤叫做活化 。 Sol o’ v ie v等在试验中 , 对猪 白细胞的活化效果同 人白细胞的一样 , 可以用人白细胞干扰素活 化人的和猪的白细胞 , 也可以用 猪的干扰素 活化这两种细胞 。 往每 1 毫升细胞悬液中加 干扰素 1 00 单位 。活化的 比不活化的产量增高 4 0倍以上 。 5 . 诱导病毒 试验中用过新城鸡瘟病毒 (N D V 一H ) 和仙台病毒作诱导剂 。 N D V 诱导效果比仙 台的高 2 倍 。 二 、 猪的与人的白细胞干扰素比较 1 . 猪干扰素的特性 根据 Sol o vi e v 等 ( 2 ’的试验 结 果 ( 参 看表 」 ) , 对于 p H 、 温度和机械应力 , 猪 的千扰素比较敏感 , 除此而外 , 两种干扰素 的许多性质 , 没有明显差别 。 表 i 猪 的 和 人 的 白 细 胞 干 扰 素 某 些 特 性 比 较 在人二倍体细胞上抚病毒活性 4 0 0 0 M E 4 0 0 0 M E 特异活性 在猪肾、 M E / m g 5 7 0 0 1 0 0 0 人二倍体 、 鸡和鼠 L 9 2 9 等细胞 上的种属特异性 一一户一一一 一一一一一一一一一一一一 ! _ l_ _ _抗病毒特异性 放线菌素 D 抑制 半透膜透过力 R N A 酶和 D N A 酶 巫下一 - 一⋯- 味事一一丽一⋯一福一一一蔺一 抑抑 制制 抑 制制 不不 透透 不 透透 不不 敏 感感 不 敏 感感 PH Z 。 2 ~ 2 。 5和PH S~ 9处理 7 天 加温 5 6 ℃ 3 0分钟 效价下降 60 倍 完 全 破 坏 不 敏 感 效价下降 4 倍 一一一一一一一 一一一一一一 } _ _ l _ _ _ _ _加温 7 0 ℃ 1 5分钟 完 全 破 坏 完 全 破 坏声一一 ~一一一一一一一一一- 一一一一- 一一一一一 )_ _ _ _ _ ! 稳 定效 价 稳 定倍一定降一稳下一价价一l效一效机械应力亲液性干燥 一一 -一一一一一一~一一一一 一 l _ l一抗人千扰素血清中和 (血清稀释度) 1 : 2 0 1 : 8 0 0 0一 - - 一 一-一一一一一一一一一一一 - 一~ l _ l 一 一 一 一 一 一 -一—组织培养毒性试验一一一一一一一一一,一一一一一一 l_ _猴皮下 、 小鼠腹腔注射安全试验一-一~ - 一‘一 ~一一一-一一 I_ _猴抗牛痘病毒10 剂量保护试验 全 保 护. - 一 一一一~ 一一一一一一一一一一一一l一家兔眼结膜反应2 . 两种干扰素的种属特性猪干扰素在不同细胞上的抗病毒活性有差别 , 根据 P o k id y s h e v a等 (“ )报导, 猪干扰素对人二倍体细胞有较高的保护力 。 以人 二倍体细胞为对照 , 猪干扰素在各种动物细 胞上的抗病毒活性试验结果 , 见表 2 。 从表 2 看出猪干扰素对猪胚肾、 猪成年肾、 人胎 肾、 鼠胎成纤维、 牛 Y R 和牛胎肾细胞都有 保护作用 , 在猪的 R K 15 和 IB R S一 2 上则没 有抗病毒活性 。 Sol o vi e v 等曾猪干 扰 素对原代猴肾细有保护力 , 对人的原代成纤 维细胞的保护力较低 。 P o k id 对 h eva 等 还 表 2 猪干扰素在各种细胞上的抗病毒活性 猪干扰素平均单位 细 胞 种 各种细胞 人二倍体细胞对照 猪胎肾 猪成年肾 猪胎肾 猪 R K , 。。 猪 IB R S一 2 人胎肾 鼠胎成纤维 牛Y R 牛胎肾 15 0 0 12 0 0 6 4 0 0 1 4 1 0 6 3 0 0 2 5 2 0 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 7 8 0 0 4 0 0 0 1 0 0 0 2 0 0 0 4 3 7 8 6 4 6 0 4 12 0 2 0 0 0 2 0 0 0 证明 , 猪干扰素对不同年令的鼠成纤维细胞 保护力也不 同 。 三、 猪干扰素人体试验初步结果 1 . 人体试验方法 经动物试验证明 , 浓缩猪干扰素无过明 原性 、 无反应原性、 无毒性 。 在细胞上证明 无毒性 、 滴定效价 ( i 0 0 0 0M E / m l ) , 在猴 子体上的证明有抗牛痘病毒效力 。 经过全面 检定合格之后 , 做人体试验 。 由流行病学 、 过敏反应学 、 生物化学各专家和临床医师组 成委员会负责此项试验 。 从其同事之中选出 26 位志愿者 , 其中30 岁以下者 9 位、 30 岁以 上的 17 位 。 男人 17 名、 妇女 9 人 。 志愿者于 接种前均经健康检查 ( 透视、 血液和尿化验 以及内科 、 耳科检查 ) 。 供试验用的猪白细胞干扰素每毫升含有 5 0 0 0 0国际单位和 o . 7 4 m g 蛋白质 。 22 名志愿者 , 每天滴鼻三次 , 每次滴猪 白细胞干扰素0 . 25 毫升 , 连续滴 5 天 ; 其余 · 4 名, 按前述方法滴 19 9营养液作为对 照 。 接种后观察全身反应 (体温和 自觉症状 ) 、 上呼吸道局部变化、 血液和尿化验分析 , 测 定干扰素转移和观察反应原性 。 过敏反应检查 , 接种过干扰素或 1 99 的 1 8名志愿者 , 于接种后第24 天 , 前臂部皮下 注射同批号干扰素 0 . 2毫升 。 根据局部反应 ( 红晕、 浸润和痛感 ) 判定结果 。 2 . 人体反应 试验证明 , 志愿者接种猪干扰素 , 没有 表 3 猪 干 扰 素 在 人 体 的 过 敏 反 应 结 果 观 察 组 皮 内 攻 击 (猪干扰素 ) { 一⋯辈箭苹彭数 、卫。一卢’ 10 } 6 } + } 一 {5 、1”厂“ ⋯-志愿者数 日口。1 6 0 0 0 M E 接 种 干 扰 素 蛋白 o . 15 m g 0 。 2 m l ‘‘ 444 444 33333 444 1 6 0 0 0 M E 接种 19 9 营养液 } 蛋 白 。. 15 m g ! 3 0 。 Z m l lllll 0 } 3 . 4 0 . 人出现全身的和局部的阳性反应, 猪干扰素 滴鼻后在人体内转移性很好 , 没 有 直 接反 应 。 过敏反应试验结果 (表 3 ) 证明 , 志愿 者们接种干扰素或者是 1 99 的皮 肤 反应没有 差别 , 皮内攻击干扰素之后 出的皮肤反应 , 属千扰素制品本身的反应 。 其中有 1 人出现 皮肤红晕反应并持续72 小时 , 此人本来就对 抗菌素过敏 。 3 . 效果观察 作者们的人体试验期间 ( 1 9 7 9年 1 1月26 日至 30 日 ) , 周围没有流感流行 , 接触的没 接种干扰素的同事之间只有 3 人患流感 。 这 就无法判定效果 。 综上所函, 可以初步认为 : 猪白细胞干 扰素在人二倍体细胞上有较高的抗病活性 , - 与人 白细胞干扰素相比较有许多共同性质 , 制备方法和检定项 目与人白细胞干扰素基本 相同 ; 用牛的羊膜液代替小牛血清制猪千扰 素取得初步结果 , 可降低干扰素 蛋 白 质 含 量 , 提高纯度比, 降低过敏反应 , 如能适应 其它细胞培养 , 将是可喜的事情。 总之关于 猪白细胞干扰素研究工作是作得 注 意 的 课 题 。 本文只是 4 篇文章的简要综 述 仅 供 参 考 。 〔B o n p o e H B H p y e o 几“ H S , 6 , ( 5 2 1 , 6 6 3 , 6 7 6 ) 1 9 8 0 B o n p o e H B H p y e o 江 r “ “ , ( 1 2 ) 1 9 5 1 ( 俄文 ) 李淦 综述 〕 免疫诊断细 胞 方 法 (续六 ) 四 、 淋巴细胞毒功能的检定 淋巴细胞的细胞毒劝能在体外与异体细 胞相互作用时会表现出来。 各亚群淋巴细胞 在不同条件下可出现细胞毒反应 。 . 被某种抗 原致敏的淋巴细胞在体外能破坏携带这种抗 原的靶细胞 。 这种效应说明杀伤淋巴细胞属 于特殊的 T 细胞亚群并带有特殊的受体 。 在 混合细胞培养中, 非特异的细胞毒作用可使 淋巴细胞在抗原和致有丝分裂原的影响下发 生转化 。 此外 , 正常淋巴以及其它白细胞可使包 被抗体的靶细胞溶解 。 这种效应是带有免疫 球蛋 白 F c 受体的细胞所具有的 。 (一)细胞培养一般要求 。 防止染菌是细胞培养成功俞童要条件之 一 。 因此, 无菌操作室应有杀菌灯装置 , 空 气消毒设备 , 器皿 、 材料、 器械和试剂应当 无菌, 培养基中应加入抗菌素 。 器皿、 器械和材料之堆备 。 常用韵洗手 水 (消毒 ) , 处理用的酸和硷 , 液体肥皂 , 苏打 , 有中和反应的偏硅酸钠 3 6 0 9 和 409 卡 尔汞溶于24 6二 1水并过遮 , 用前一份溶液加 水 100 份 。 器皿在此溶液中煮沸20 分钟 并 放 令 然后用自来水冲洗 , 供千灭菌备用 。 涂 石蜡的器皿单独放置 , 先擦去石蜡 , 加人。. 5 N N aO H 或氢氧化钾酒精溶液加热 , 接触细 胞表面不应含有毒物质 。 去污剂 。 不能煮沸的器皿洗涤最好用对 细胞无毒的去污剂洗涤 。 酸 。 常用格的混合物 。 重铬酸钾 4 0 9 置 . 4 1 .