细菌的革兰氏染色

革兰氏染色的一般步骤 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立。未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。 革兰氏染色属复染法，即将标本固定后，先用结晶紫染色1分钟后水洗，然后加革兰碘液媒染一分钟后用酒精脱色，再用稀释石炭酸复红复染。染色后除可以看到细菌形态外，还可将细菌分为两大类，即不被酒精脱色而保留紫色者为革兰氏阳性菌（G＋）。被酒精脱色复染成红色者为革兰氏阴性菌（Gˉ）。 革兰氏染色原理尚不肯定，可能与细菌所带核糖核酸、细菌壁结构通透性、等电点等因素有关。致病菌如金黄色葡萄球菌、绿色溶血性链球菌、肺炎球菌、白喉杆菌、炭疽杆菌等属革兰氏染色阳性菌。百日咳杆菌、大肠杆菌（大肠埃希菌）、铜绿假单胞菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌、沙门菌、流行性脑膜炎双球菌、淋病双球菌等均属革兰氏阴性菌。所以根据细菌的革兰氏染色性质，可以缩小鉴定范围，有利于进一步分离鉴定，以对疾病做出诊断。又由于各种抗生素的抗菌谱不同，革兰氏染色尚可做为选用抗生素的参考。 革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是： 1）涂片固定。 2）草酸铵结晶紫染1分钟。 3）纯化水冲洗。 4）加碘液覆盖涂面染1分钟。 5）水洗，用吸水纸吸去水分。 6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒后水洗，吸去水分。 7）番红染色液（稀）染10秒钟后，纯化水冲洗。干燥，镜检。 染色的结果，革兰氏正反应菌体都呈紫色，负反应菌体都呈红色。 实验三 细菌的革兰氏染色法 一、目的要求 了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。 二、基本原理 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decoorising agent）和复染液（counterstain）。 碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crysta vioet）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精（ethano）。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。 三、器材 大肠杆菌，金黄色葡萄球菌； 草酸铵结晶紫，番红水溶液，碘液，95%乙醇，载玻片，显微镜等。 四、操作步骤 1．涂片 将培养24小时的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰1～2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。 2．染色 （1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。 （2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。 （3）脱色：将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20～30秒钟，立即用水冲净酒精。 （4）复染：用番红液染1～2分钟，水洗。 （5）镜检：干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。 （6）同法在一载玻片上以大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合制片，作革兰氏染色对比。 注意：革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。 五、实验结果与讨论 微生物染色液的配制 一、吕氏(Loeffler)碱性美蓝染液 　　 A液：美蓝(methylene blue) 0．6g 　　 95%酒精 30ml 　　 B液：KOH 0．01g 　　 蒸馏水 100ml 　　 分别配制A液和B液，配好后混合即可。 二、齐氏(Ziehl)石炭酸复红染色液 　　 A液：碱性复红(basic fuchsin) 0．3g 　　 95%酒精 10ml 　　 B液：石炭酸 5．0g 　　 蒸馏水 95ml 　　 将碱性复红在研钵中研磨后，逐渐加入95%酒精，继续研磨使其溶解，配成A液。 　　 将石炭酸溶解于水中，配成B液。 　　 混合A液及B液即成。通常可将此混合液稀释5—10倍使用，稀释液易变质失效，一次不宜多配。 三、革兰氏(Gram)染色液 　　 1．草酸铵结晶紫染液 　　 A液：结晶紫(crystal violet) 2g 　　 95%酒精 20ml 　　 B液：草酸铵(ammonium oxalate) 0．8g 　　 蒸馏水 80ml 　　 混合A、B二液，静置48小时后使用。 　　 2．卢戈氏(Lugol)碘液 　　 碘片 1．0g 　　 碘化钾 2．0g 　　 蒸馏水 300ml 　　 先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足水分即成。 　　 3．95%的酒精溶液(脱色用)。 　　 4．番红复染液 　　 番红(safranine O) 2．5g 　　 95%酒精 100ml 　　 取上述配好的番红酒精溶液10ml与80ml蒸馏水混匀即成。 四、芽孢染色液 　　 1．孔雀绿染液 　　 孔雀绿(malachite green) 5g 　　 蒸馏水 100ml 　　 2．番红水溶液 　　 番红 0．5g 　　 蒸馏水 100ml 　　 3．苯酚品红溶液 　　 碱性品红 11g 　　 无水酒精 100ml 　　 制法取上述溶液10ml与100ml5%的苯酚溶液混合，过滤备用。 　　 4．黑色素(nigrosin)溶液 　　 水溶性黑色素 10g 　　 蒸馏水 100ml 　　 称取10g黑色素溶于100ml蒸馏水中，置沸水浴中30分钟后，滤纸过滤二次，补加水到100ml，加0．5ml甲醛，备用。 五、荚膜染色液 　　 1．黑色素水溶液 　　 黑色素 5g 　　 蒸馏水 100ml 　　 福尔马林(40%甲醛) 0．5ml 　　 将黑色素在蒸馏水中煮沸5分钟，然后加入福尔马林作防腐剂。 　　 2．番红染液 　　 与革兰氏染液中番红复染液相同。 六、鞭毛染色液 　　 A液：单宁酸 5g 　　 FeCl3 1．5g 　　 蒸馏水 100ml 　　 福尔马林(15%) 2．0ml 　　 NaOH(1%) 1．0ml 　　 配好后，当日使用，次日效果差，第三日则不宜使用。 　　 B液：AgNO3 2g 　　 蒸馏水 100ml 　　 待AgNO3溶解后，取出10ml备用，向其余的90mlAgNO3中滴入浓NH4ON，使之成为很浓厚的悬浮液，再继续滴加NH4OH，直到新形成的沉淀又重新刚刚溶解为止。再将备用的10mlAgNO3慢慢滴入，则出现薄雾，但轻轻摇动后，薄雾状沉淀又消失，再滴入AgNO3，直到摇动后仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止。如所呈雾不重，此染剂可使用一周，如雾重，则银盐沉淀出，不宜使用。 七、富尔根氏核染色液 　　 1．席夫氏(Schiff)试剂 　　 将1g碱性复红加入200ml煮沸的蒸馏水中，振荡5分钟，冷至50℃左右过滤，再加入1mol/LHC120ml，摇匀。待冷至25℃时，加Na2S2O5(偏重亚硫酸钠)3g，摇匀后装在棕色瓶中，用黑纸包好，放置暗处过夜，此时试剂应为淡黄色(如为粉红色则不能用)，再加中性活性炭过滤，滤液振荡1分钟后，再过滤，将此滤液置冷暗处备用(注意：过滤需在避光条件下进行)。 　　 在整个操作过程中所用的一切器皿都需十分洁净、干燥，以消除还原性物质。 　　 2．Schandium固定液 　　 A液：饱和升汞水溶液 　　 50ml升汞水溶液加95%酒精25ml混合即得。 　　 B液：冰醋酸 　　 取A液9毫升+B液1毫升，混匀后加热至60℃。 　　 3．亚硫酸水溶液 　　 10%偏重亚硫酸钠水溶液5ml，1mol/LHCl5ml，加蒸馏水100ml混合即得。 八、Bouin氏固定液 　　 苦味酸饱和水溶液 75ml 　　 福尔马林(40%甲醛) 25ml 　　 冰醋酸 5ml 　　 1g苦味酸可制成75ml饱和水溶液。 　　 先将苦味酸溶解成水溶液，然后再加入福尔马林和冰醋酸摇匀即成。 九、乳酸石炭酸棉蓝染色液 　　 石炭酸 10g 　　 乳酸(比重1．21) 10ml 　　 甘油 20ml 　　 蒸馏水 10ml 　　 棉蓝(cottonblue) 0．02g 　　 将石炭酸加在蒸馏水中加热溶解，然后加入乳酸和甘油，最后加入棉蓝，使其溶解即成。 十、 瑞氏(Wright)染色液 　　 瑞氏染料粉末 0．3g 　　 甘油 3ml 　　 甲醇 97ml 　　 将染料粉末置于干燥的乳缽内研磨，先加甘油，后加甲醇，放玻璃瓶中过夜，过滤即可。 十一、美蓝(Levowitz-Weber)染液 　　 在52ml95%酒精和44ml四氯乙烷的三角烧瓶中，慢慢加入0．6g氯化美蓝(met hylene blue chloride)，旋摇三角烧瓶，使其溶解。放5—10℃下，12—24小时，然后加入4ml冰醋酸。用质量好的滤纸如WhatmanNo．42或与之同质量的滤纸过滤。贮存于清洁的密闭容器内。 图片-铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌-显微图片 　 破伤风梭菌 大肠杆菌 志贺菌革兰染色 　 伤寒沙门菌革兰染色　 　 念球菌病直接镜检 结核分枝杆菌 　　 　肉毒杆菌 ——(*^__^*)