Ⅱ型糖尿病动物模型研究进展

172 四川生理科学杂志2010；32(4) Ⅱ型糖尿病动物模型研究进展 * 牟道华 t 谭正怀 △ (1．成都中医药大学，四川 成都 610072；2．四川省中医药科学院，四川 成都 610041) Progress of animal models of TypeⅡ diabetes mellitus M u Dao-hua ．-．Tan Zheng-huai。△ (1．ChengduUniversity ofTraditional ChineseMedicine，SichuanChengdu 610075~ 2．Sichuan Academy of Chinese Medidne Sciences，Siehuan Chengdu 610041) 摘 要 Ⅱ型糖尿病的发病率逐年上升，为寻找有效防治糖尿病及其并发症的药物和方法，,&it1通过多种途径开发、发展适 合于研究的Ⅱ型糖尿病动物模型。本文就有关动物模型的特点进行了综述。 关键词 ：Ⅱ型糖尿病；动物模型；进展 着人们生活习惯、生活方式的改变，肥胖的人越来越多。 与之伴随的是Ⅱ型糖尿病的发病率迅速增加。1980年全国 l3 省及北京市3O万人121进行的糖尿病调查中，糖尿病患病率为 0．609％。在不到3O年后的2008年，全国14省市糖尿病和代 谢综合征的患病率调查显示，我国糖尿病患病率达到 9．6 ，增 加超过了 15倍。换言之，目前我国糖尿病患病人数已经超过 7 千万[1]。 d型糖尿病又称非胰岛素依赖型糖尿病(Non-insulin de- pendent diabetes mellitus，NIDDM)，其特点为胰岛素抵抗、胰岛 素分泌受损、空腹高血糖或餐后 2 h高血糖。由于Ⅱ型糖尿病 及其并发症的迅速蔓延 已经成为严重威胁人类健康的世界性 难题，为了找到能有效防治糖尿病及其并发症的药物或方法， 相关动物模型则是其必不可少的重要工具。目前常用的Ⅱ型 糖尿病的动物模型主要分为诱导性动物模型、自发性动物模型 和转基因动物模型。现将相关研究进展综述如下： 1 诱导性 Ⅱ型糖尿病动物模型 Ⅱ型糖尿病的发病与外界环境以及食物等因素密切相关， 多数情况为多因素致病，如过量的能量摄入往往会加重胰岛的 负荷致使胰岛功能受损，或胰岛功能本来就不足，加上食物的 诱导，致使胰岛的分泌往往不能满足机体的需要，导致血糖升 高。 1．1 食物诱导的糖尿病动物模型 食物诱导的Ⅱ型糖尿病动物模型与人类的发病情况类似， 在新药开发、发病机理研究中具有极大的应用价值。许多动物 都可通过食物诱导产生胰岛素抵抗、血糖升高甚至 Ⅱ型糖尿 病，但能够用于实验的动物主要有以下几种： BDF1小鼠：该小鼠是用 C57BL／6小鼠和 DBA／2小鼠杂 交繁殖而成，在此基础上，再喂以高脂饲料而培育出的肥胖型 Ⅱ型糖尿病小 鼠。该小鼠在喂以高脂饲料后 ，体重增长迅速， 在第 3～4个月时出现高血糖、糖尿和 HbAIC升高等糖尿病症 状。其糖耐量已明显受损，体外胰岛培养显示胰岛索含量降 低，且胰岛素分泌对高浓度葡萄糖刺激不敏感[ 。 *基金项目：四川省科学技术厅支撑项 目(2008SZ0126)和成都市科学技 术局支撑 项 目(09GGYB978sⅥ 12)资助 作者简介：牟道华(1985一)，男，在读硕士研究生，主要从事中药药理与 毒理研究，Email：TonyMu@yeah．net。 △通讯作者：谭正怀(1965～)，男，研究员，主要从事内分泌疾病研究， Email：tanzhh616@sohu．COrn。 沙鼠：沙鼠生活在食物来源比较匮乏的草原和沙漠地区， 常以灌木的叶子和种子为食。食物所含能量很少 ，但能保持健 康，既不出现肥胖也元糖尿病发生。若给予热量实验室饲 料4个月，会有部分沙鼠出现典型的代谢综合征症状群(肥胖、 胰岛素抵抗、Ⅱ型糖尿病和血脂紊乱)。若给予高能饲料 1周 ， 沙鼠则会出现高胰岛素血症，胰岛口细胞体积减为原来的 1／3，这些现象均与血糖浓度有密切的关联。沙鼠总是先 出现高胰岛素血症，再出现高血糖，最终出现不可逆的糖尿病 状态[3]。最近研究发现，在沙鼠动脉壁及血管平滑肌细胞有脂 肪生成，其动脉壁脂类沉积和脂肪生成无关[4]。沙鼠的高脂血 症并不是由于肠道吸收太多的脂类，而是因为糖尿病状态本身 而引起的 。 尼罗河大鼠：用常规饲料喂养尼罗河大 鼠后 ，该 鼠首先出 现高胰岛素血症，高血糖，不久后出现了高甘油三脂，高胆固 醇，高血压。若用高脂饲料喂养则上述症状将会更早出现。研 究发现这种大鼠糖尿病的出现是由于基因与饮食交互作用导 致的 。 1．2 饮食诱导与 STZ联合应用 对于一般动物而言，单纯用食物诱导成糖尿病往往会需要 很长的时间，不宜作为研究对象。为缩短成模时问，人们往往 采用复合的方法复制模型，如采用高脂饲料先将动物诱导肥 胖、产生胰岛素抵抗 ，在此基础上再通过不同方法进一步损伤 胰岛功能，使血糖进 一步升高，最终导致糖尿病症状 出现。 Zhang等用 高脂 饲料 喂养 大 鼠 4 w后 ，再 腹腔 注射 STZ 30 mg·kg 两次，便可造成稳定的 Ⅱ型糖尿病动物模型[7]。 Sahin给予 SD大鼠饲喂特殊制备的高脂饲料 2 w后，腹腔注射 40 mg·kg 的 STZ，出现典型Ⅱ型糖尿病症状。Wang等用含 有20 蔗糖和10 猪油的高脂饲料饲养 4 w后一次性注射剂 量为30 mg·kg 的 STZ，通过测定每组大鼠的体重增长曲线、 血糖水平、胆固醇、血甘油三酯水平等指标显示 STZ加高脂饲 料组的糖尿病特征极其明显。这种模型往往具有会出现胰岛 素抵抗、高血糖等 Ⅱ型糖尿病的特征，但常不会出现高胰岛素， 因此该类模型可能不适宜于胰岛素增敏剂的研究。 2 自发性Ⅱ型糖尿病动物模型 遗传因素在Ⅱ型糖尿病的发生、发展中起着非常重要的作 用，为深入研究其发病机理，人们通过多种途径开发出多种可 以用于研究的遗传性 Ⅱ型糖尿病动物模型。目前 主要包括： db／db小 鼠、ob／ob小 鼠、NSY小 鼠(Nagoya—Sbibate-Yasuda 四川生理科学杂志 2010；32(4) 173 mice，NSY mice)，Zucker fa／fa与 ZDF大 鼠(Zucker diabetic fatty)大 鼠、GK大 鼠(Goto-Kakisaki，GK)、OLETF(Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty，OLETF)大 鼠等 。 2．1 db／db小 鼠 由 C57BL／KsJ近亲交配株常染色体隐性遗传衍化而来， 属Ⅱ型糖尿病模型。由于不正常的剪接，使终止密码子过早的 插入从而使长链瘦素受体 Ob—Rb被替换成 了短链瘦素受体 Ob-Ra。因为 Ob-Rb受体负责瘦素在下丘脑 的调节食欲，体 重 ，能量消耗的作用，缺乏 Ob-Rb受体就会导致肥胖，尽管血清 瘦素水平升高。在 4周龄时，db／db小鼠糖耐量正常，便在 8周 龄时便会产生严重的糖尿病且会 和 ob／ob小 鼠一样的肥胖。 在大多数研究中，均发现 db／db小鼠有早期的高胰岛素血症 ， 血清脂肪酸和甘油三酯升高。动物在一个月时开始贪食及发 胖 ，继而产生高血糖、高血胰岛素，胰高血糖素也升高，一般在 lO个月内死亡。db／db小鼠心脏收缩功能比 ob／ob小鼠有更 加明显的损伤，这可能是由于早期高血糖的原故。该小鼠会发 生左心室扩大，心肌壁增厚，显示出明显的心肌肥大，心脏舒张 功能也受 损，可能是由于脂肪酸诱导的线粒体解 耦联所致。 db／db小鼠心肌线粒体超氧化物、丙二醛和 4～羟基壬烯醛水平 升高提示 db／db小 鼠心肌存在着氧化应激。心脏交感神经激 活和副交感神经张力降低显示心肌自律神经紊乱 。 2．2 ob／ob小鼠 属常染色体隐性遗传 Ⅱ型糖尿病动物。由于 ob／ob小鼠 瘦素基因突变，导致瘦素缺乏 ，C57BL／6 ob／ob小 鼠 4周龄时 发生轻度肥胖 ，现出了高胰 岛索血症和糖耐量受损，但没有 形成糖尿病。在第 15周龄时 ob／ob小鼠才发生严重的肥胖和 糖尿病。某些 ob／ob小鼠血清甘油三酯和脂肪酸水平升高，这 取决于它的营养状态和年龄。除了摄食过量外，ob／ob小 鼠还 表现出体温下降，身体脂肪含量增加 ，能量消耗和活动度降低， 不育或不孕，大约 14月龄时死亡。研究表明 ob／ob小鼠心肌 收缩功能没有或者仅轻微的损伤，但舒张功能有明显紊乱，使 心脏整体功能有一定的降低。当其心脏暴露于高浓度的脂肪 酸中时，脂肪氧化和甘油三脂储存增加 ，葡萄糖氧化降低，心肌 胰岛素抵抗加强。心肌线粒体呼吸容量减少并伴随着各种底 物、ATP合酶解耦联。糖尿病 ob／ob小鼠肝 PPARY2表达水 平升高与胰岛素抵抗有关。口服雌酮硫酸盐(Estrone sulfate) 可降低 ob／ob小鼠肝葡萄糖-6-磷酸酶的活性和酶蛋 白的水平 ， 从而使血糖正常。研究发现它们和人类 Ⅱ型糖尿病不同的是 不具有血液的高凝状态，因此不能用于糖尿病心血管和脑血管 并发症方面的研究_9]。 2．3 NSY小 鼠 是从远交系 JC1／ICR小鼠中选择葡萄糖耐量异常株培育 而成的，其糖尿病发生与年龄、性别密切相关：24周龄时胰岛素 分泌功能严重受损，48周龄的累积发病率雄性为 98 ，雌性为 31 。此鼠在任何年龄阶段都不表现严重肥胖和显著的高胰 岛素血症，胰岛也无肿大或炎性变化 ，研究发现染色体 Chrl1 和 Chrl4共同影响 NSY小 鼠高血糖和肥胖，而其 中单独的一 个染色体却对血糖和肥胖无任何影响_】o]。 2．4 ZDF(Zucker diabetic fatty)大鼠 Zucker fatty rat大鼠基因编码的瘦素受体发生了纯合子错 义突变。这种突变发生在 Fa基因序列 中，导致 0b—R功能缺 失。Zucker diabetic fatty大鼠起源于 Zucker fatty rat选择育 种 ，即选出其中血糖高者。因此 Zucker diabetic fatty大鼠产生 于 Zucker fatty rat远交系的近交系品种。ZDF大鼠发生肥胖， 高胰岛索血症 ，高血糖，高瘦素 ，以及高血清甘油三酯和脂肪 酸，在第 6周龄时便出现胰岛素抵抗。高血糖开始于第 6周前 后 ，在 1O到 l2周时出现稳定的高血糖，血清胰岛素水平开始 下降，由于胰岛 B细胞的不足。在 ZDF大 鼠中，心脏会发展成 心肌肥大，脂类储存增加。脂肪酸氧化比率和其基因表 达在 ZDF心肌中都增加，而糖类氧化，丙酮酸盐脱氢酶流量、Glut4 表达都降低。在 ZDF中未观察到 SERCA2a mRNA表达的改 变 _J．。 2．5 GK大鼠 在 1975年，Goto等人在日本仙台从 211个 Wistar大鼠中 经口服糖耐量实验选出 18个轻度糖耐量减退的大鼠，经过 1O 代左右反复选择高血糖鼠交配，形成与人类 Ⅱ型糖尿病近似的 自发性非肥胖 Ⅱ型糖尿病鼠种，称为 GK(Goto~Kakizaki Rat) 大鼠。该鼠种主要表现为胰岛 G细胞分泌功能受损、空腹高血 糖、肝糖原生成增 多，肝脏、肌 肉和脂肪组织 中度胰岛素抵抗 等，并出现各种糖尿病并发症。18月龄时GK大鼠即出现了血 糖升高、心率降低 、心肌萎缩等症状 ，与人类 Ⅱ型糖尿病心脏病 进展极为相似，并有显著的心肌肥大、间质纤维增生和持续的 心肌细胞凋亡。在糖尿病中，心肌压力响应路径被认为是心肌 重构的一个独立的危险因素。GK大鼠心肌梗塞所诱导的抑癌 基因蛋白表达增加，Akt磷酸化减少和相伴的 FOXO3a磷酸化 减少可能导致了心肌细胞死亡增加，GK大鼠发生心肌梗塞后 梗死区域 Sirtl蛋 白过度生成。这种现象与 p53的乙酰化有 关。当 p38 MAP激酶长期处于激活状态时会促进 GK大鼠心 肌梗死后重建，问质纤维化，心肌肥大以及增加前促炎 因子调 节器的表达_1 。也有研究发现糖尿病 GK大鼠的毒蕈碱受体 系统改变可能导致糖尿病膀胱病的发生[1引。 2．6 OLETF大 鼠 通过对 Long-Evans大 鼠进行杂交，筛选超重者进行近交 而成。其胆囊收缩素(CCK)～A受体 mRNA的表达完全缺失， 携带的 ODB1和 ODB2基 因与糖尿病的发病有关。多食、少 动、肥胖和出现糖尿病的临床表现为主要特征。早期 以胰岛素 抵抗、糖脂代谢紊乱为主，以后逐渐出现胰腺功能减退 ，晚期合 并糖尿病肾脏病变 ，与人类 2型糖尿病极为相似。有显 示，OLETF大鼠不仅缺乏外周的饮食饱足感信号，而且 CART 肽引起食欲缺乏的作用也减弱了_1 。 3 转基因动物模型 为阐明某一单个基因在Ⅱ型糖尿病发病中的作用，人们采 用基因敲出或基因过表达等手段复制出一系列 Ⅱ型糖尿病动 物模型，但这种但基因改变的动物模型往往与临床具有一定的 差距，其应用范围也受到很大的限制。 3．1 SREBP-2转基因小鼠 Ishikawa等为了研究胰岛B细胞合成胆固醇的作用，使用 了一种胰 岛 B细胞 SREBP-2转基 因 小 鼠。该研 究 表 明 SREBP-2蛋白活化导致了大量 G细胞凋亡和胆固醇聚积 ，产生 严重的糖尿病。可以用于脂毒性及胆固醇代谢与 8细胞功能 损伤方面的研究rl 。 3．2 MODY模型L10 M0DY(Maturity-onset diabetes of the young，MODY)，即 青幼年发病的成年型糖尿病 ，是 Ⅱ型糖尿病的一个亚型，有 5 种蛋白质的基因缺失或突变可以导致 M0DY，分别是肝细胞核 因子 46(HNF-4a／MODY1)，葡萄糖激酶(GK，MODY2)，肝细 胞核 因子 la(HNF1a／MODY3)，胰 岛 素启 动 因子 (IPF-1／ 174 四川生理科学杂志 2010；32(4) M0DY4)，肝细胞核因子 18(HNF-1I]，MODY5)。MODY2模 型是由于葡萄糖激酶基因第 629位的核苷酸由T变成了G，导 致了210号位蛋氨酸变成了精氨酸。由于这种突变，造成了成 年突变小鼠肝脏葡萄糖激酶活性明显的降低，但是表达葡萄糖 激酶的 mRNA和这种蛋白质却并没有减少。纯合子的突变小 鼠表现出严重的生长停滞和高血糖，并在出生后不久便死亡； 而杂合子突变小鼠在出生后只表现出轻微的血糖升高和葡萄 糖不耐受及葡萄糖诱导的胰岛素分泌紊乱。此外，雄性突变小 鼠在 9O天后还表现出胰岛敏感性和空腹血清胰岛素水平降 低。而纯合子与杂合子突变小鼠在出生时胰岛 B细胞总数是 相同的，但在210天后胰岛细胞和 细胞容积以及单独的8细 胞容积发生 了显著性的改变 ，这仅在雄性突变小鼠中有所发 现 。 3．3 KK—Ay小 鼠 KK小鼠是日本学者培育的一种轻度肥胖的Ⅱ型糖尿病动 物，将黄色肥胖基因 (即 Ay)转至 KK小鼠，得 KK—Ay小鼠。 与 KK小鼠相比，KK—Ay小鼠有明显的肥胖和糖尿病症状。具 有高血糖、高胰岛素血症、胰岛素抵抗、糖耐量受损、过量饮食 等症状。2月龄时开始出现中度肥胖，4～5月龄时进入稳定 期，脂肪约占总体重量的 33 ；并逐渐出现角膜退化、皮肤上皮 细胞坏死等症状 ；15周龄时还会出现心肌间质纤维化；后期的 肾小球系膜细胞增殖和细胞外基质积聚会进一步恶化形成糖 尿病肾病。KK—Ayl2周龄以后的尿蛋白、血肌酐、体重、随机血 糖、空腹血糖、血红蛋白、血压、终末糖基化产物和转化生长因 子一G等指标均明显高于其对照组BALB／c小鼠，出现典型的Ⅱ 型糖尿病症状[1 。KK-Ay小鼠的糖尿、体重、空腹血糖水平与 基因 Guql和 Guq2有着复杂的关联。其糖耐量和血清胰岛索 则随着年龄的增加而恶化L1 。 4 一 种良好的动物模型必须具备以下条件：稳定可靠，易于 重复；经济易得；复制成功所需时间短，其主要表现与临床表现 相似。综上所述，目前各种 Ⅱ型糖尿病模型有其各自的优缺 点，如：诱导性动物模型价格低廉，可操作性强，但与临床实际 情况相差较远，常影响到研究结果的可靠性；自发性动物模型 的发病机制、病理变化以及临床表现与人类 Ⅱ型糖尿病的发病 机制相似，但其价格较贵，饲养条件要求严格，周期长，使其应 用受到了极大的限制；而转基因动物模型多为单一基因的敲除 或过表达，其针对性较强，是探讨个别基因在糖尿病发病 中的 作用和地位的最佳选择，但制作技术难度较高，目前在国内外 应用均受到了一定的限制。因此，复制一种周期短、与人类发 病机制相似的Ⅱ型糖尿病动物模型是研制、开发防治 Ⅱ型糖尿 病及其并发症药物急需解决的难题。 参考文献 1 翁建平．对糖尿病流行病学、循证医学及基础研究的探索[J]． 2010，31(2)：166— 172． 2 Karasawa 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