D-氨基葡萄糖盐酸盐体外对人淋巴细胞的增殖和细胞内钙浓度的影响

356 Acta Nutrimenta Sinica．Au2．．20o7． 01．29 No．4 D一氨基葡萄糖盐酸盐体外对人淋巴细胞的增殖和 细胞内钙浓度的影响 曹秀明 ，刘万顺 ，于 ( 中国海洋大学生命科学学院， 蕾 ，李 惠 青岛 266003； 2 哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心药物所，哈尔滨 150076) 【摘 要l目的：研究D一氨基葡萄糖盐酸盐对淋巴细胞增殖作用和细胞内钙的浓度影响。方法：采 用人外周血淋巴细胞为实验材料，通过 MTT法，流式细胞仪法研究了D一氨基葡萄糖盐酸盐对人外周 血淋巴细胞增殖和细胞周期分布的影响。同时采用荧光探针 Furo一3／AM对细胞内的 ca 进行标记，激 光共聚焦扫描显微镜扫描细胞的荧光强度。结果：D一氨基葡萄糖盐酸盐能够诱导淋巴细胞增殖，促使 淋巴细胞由G ／G 进入 s期 ，并且可以使淋巴细胞内的钙 离子浓度升高。结论：D一氨基葡萄糖盐酸盐 能够通过ca2+信号通路激活人外周血淋 巴细胞，促使淋巴细胞增殖。[营养学报，2007，29(4)：356--358】 关键词：D一氨基葡萄糖盐酸盐； 淋巴细胞增殖； 中图分类号：R151 文献标识码：A 细胞周期； 细胞 内ca 文章编号：0512—7955(2007)04—0-0356—03 EFFECTS 0F D—GLUC0SAM I NE HYDR0CHL0R I DE 0N LYMPH0CYTES PROL I FERAT 1 0N AND I NTRACELLULAR Ca CONCENTRAT 1 0N I N V I TRO CAO Xiu—ming ’ 。， LIU Wan—shun ， YU Lei ，LI Hui (i College ofLife Science and Technology,Ocean University ofChina．Qingdao 266003 China,"2Harbin University ofCommerce Center of Research on Life Sciences and Environmental Sciences，Harbin 150076，China) 【Abstract 1 0bjective：To investigate the effects of D—glucosamine hydrochloride(GAH)on lymphocyte proliferation．cel1．cycle distribution and intracelluar Ca concentration in vitro． Method：The effects of GAH on lymphocytes proliferation in vitro were observed by MTT．PI staining and flOW cytometry were used to detect the cell—cycle distribution of lymphocytes after stimulated by GHA f，2 vitro．Laser scanning microscopy was used to study the intracelluar Ca in human lymphocytes．Results：GHA stimulated lymphocyte proliferation when the concentration of GHA were 200．1 00，50 mg／L in substrate． GHA changed the cell—cycle distribution of lymphocytes and increased the proportion of S—phase cells．GHA induced intracelluar Ca increase．Conclusion：GAH stimulates lymphocyte proliferation by inducing intracelluar Ca concentration increase．[ACTA NUTRIMENTA SINICA，2007，29(4)：356--358】 Key words： D-glucosamine hydrochoride； lymphocyte proliferation； cel1．cycle； intracelluar Ca D一氨基葡萄糖盐酸盐 (D—glucosamine hy— drochloride，GAH)是壳寡糖的衍生物。壳聚糖、 壳寡糖体内对小鼠特异性体液免疫和细胞免疫功 能有调整作用 n， 。壳寡糖可增强体外培养的小 收稿日期：2007—0i一06 基金项目：黑龙江省青年基金 (No．QC04C) 作者简介：曹秀明 (i964一)，女，副研究员，通讯作者：刘万顺 鼠巨噬细胞 IL一18基因的达，使细 录翻译水平增高 ，对治疗风湿性关 疡有 良好的疗效 。壳寡糖的衍生物 配方乳的一种重要微量糖类成分，还 胞因子的转 节炎和胃溃 GAH是婴儿 是合成 VB。 维普资讯 http://www.cqvip.com 营养学报 2007年第 29卷第 4期 和 vB 中间体的起始原料哺 。GAH还有抗肿瘤和增 加荷瘤小鼠淋巴细胞转化率的作用 C6]o本研究旨 在观察 GAH对于人外周血淋巴细胞的增殖、细胞 周期分布以及淋巴细胞内 Ca 浓度的影响。 1 材 料 与 方 法 1．1药品与试剂 GAH由中国海洋大学海洋活性物质研究室提 供，硫酸蒽酮法测 GAH纯度，大于 98％。MTT、 PI、Rnase酶、Fura一3／AM、TritonXlO0、ConA 购 自美国Sigma公司，RPMI1640培养基购 自GIBCO 公司，人血清购 自哈尔滨市血站。淋 巴细胞分离 液购 白天津灏洋生物公司。 1．2实验仪器 激光扫描共聚焦显微镜 (LEICA SP2德 国)，流式细胞仪 (EPICS XL BACKMAN COULTER 公司)，CO。恒温培养箱 (三洋公司)，恒温水浴箱 (厦门医疗电子仪器厂)。 1．3方法 1．3．1人外周血淋巴细胞增殖实验：采血，分离淋 巴细胞，离心洗涤得单个核细胞，调整浓度，实 验组：空白对照组：i00 1细胞悬液+i00~i 1640 培养液；阳性对照组：与对照组同条件下加入 ConA，使终浓度为 10 mg／L；加药组：与对照组 同条件下加 GAH，使最终浓度分别为 200、100和 50 mg／L。每组设 6个复孔，37℃，5％c0 细胞培 养箱中培养 72 h，MTT法 ⋯测定结果。 1．3．2对人外周血淋 巴细胞周期分布影响的实 验：淋巴细胞如上分离，调整浓度，加入 24孔细 胞培养板，每孔 300~i。 空白对照组：每孔加 300 1含人血清的 1640培养基。阳性对照组： 每孔加300 1含ConA的培养基，终浓度 10 mg／L。 GAH组：每孔加 300 1含 GAH的培养基，终浓度 i00 mg／L。加药 48 h后收获细胞，洗涤，70％冷 乙醇固定过夜，4~C下 PI染色 30 min，流式细胞 仪收集细胞 10 000个进行周期分析，重复 3次。 1．3．3对人外周血淋巴细胞内 ca 浓度的影响的 实验：淋巴细胞如上分离，调整浓度，将细胞加 入 24孔细胞培养板。空白对照组：每孔加 300 LL1 1640培养基；GAH组：每孔加 300 1含 GAH的 培养基，终浓度为 i00 mg／L。分别在加药 2、4、 6和 24 h后将各组细胞吸出，用无钙台氏液离心 357 洗涤 3次，用 1倍体积的 1O0~mol／L的Fura一3／AM 与 3倍体积的细胞培养基混合，细胞与此混合物 37℃下孵育 30 min。PBS离心洗涤 3次。将标记 后的细胞用激光共聚焦扫描显微镜对其进行扫描 观察，用 488 nm波长的激光作为激发波长，515 nm 处探测荧光发射，每组选取20个择贴壁良好的细 胞进行检测，用 Leica confocal software lite version软件对扫描图像进行分析。 1．4统计分析 用 SPSS 11．5软件对实验数据进行方差分析。 2结 果 2．1 GAH对人外周血淋巴细胞增殖的影响 GAH浓度 200、i00、50 mg／L有显著促进淋 巴细胞增殖的作用 ( 0．01)，以 100 mg／L最强 (表 1)。 Table 1 Effects of GHA on proliferation of human lymphocytes( ± S，n=6) a： P< 0．01 compared with control group 2．2 GAH对人外周血淋巴细胞周期分布的影响 加入 GAH 48 h后人外周血淋巴细胞 Go／／G 期的比例由 97．81％降至 85．01％，S期细胞由 1．85％上升到 14．91％。表明 GAH有诱导淋巴细胞 由G。／／G期进入 S期的作用 (表 2)。 Table 2 Effects of GAH on cell-cycle distribution of human lymphocytes( ±S) a：P<0．01 compared with control group 2．3 GAH对人外周血淋巴细胞内ca 浓度的影响 加入 GAH 2、4、6和 24 h后淋巴细胞内ca 浓度与对照组比显著升高。其中加药 6 h后最高。 24 h后有所下降。(表 3) Table 3 Effects of GAH on intracellular flurescence intensity(FI)of[Ca2 】in human lymphocytes ( ± S，n=20) a： P< 0 01 GAH VS control group； b： P< 0 05 2h VS 4h，24h 维普资讯 http://www.cqvip.com 358 3 讨 论 淋巴细胞只有在某些活化剂的作用下才增 殖，如破伤风毒素等抗原、刀豆蛋白 (ConA)、脂 多糖 (PAS)等有丝分裂原、钙导游剂等药物。本 实验中发现 GAH在体外能促使人外周血淋巴细胞 由Go／G期进入 S期，诱导淋巴细胞增殖。 淋巴细胞内钙离子 (Ca )作为细胞激活、增 殖过程中的信使分子，在传递抗原等刺激、启动 相关基因转录及其后续过程中，发挥重要作用。 细胞 内 Ca 浓 度 在 细 胞 未激 活 状 态 时 只 有 10-1mol／L ，其改变是细胞生理功能的重要环 节。我们用与 Ca 有高度亲和力的钙荧光指示剂 Fura一3／AM标记淋巴细胞内 Ca ，用激光共聚焦 扫描显微镜观察到，在 GAH作用不同时间的淋巴 细胞内 Ca 浓度都明显高于同期的对照组，表明 Ca 在加 GAH 2 h后就对淋巴细胞增殖进行调控。 因此 GAH可成为一种良好的免疫增强剂应用于相 关领域。 [参 考 文 献] [1 3窦江丽，谭成玉，白雪芳，等．壳寡糖对小鼠免疫 (上 接 355页) [9] Gardner EM，RosS AC．Dietary vitamin A restric— tion produces marginal vitamin A status in young ratS ＼．J Nut r’1993，123：1435—1443． [10]Dupe V，Davenne M，Brocard J，et a1．In vivo functional analYSi S of the Hoxa-1 3’retinoic acid response element(3’RARE)[J]．Develop— meilt， 1997， 124： 399—41O． [ii]Valentine Jw，Jablonski D．Morphological and deVe1opmenta1 macroevolution：a paleontologi— cal perspective[J]．Int Dev Biol，2003，47： 517— 522． [12]谢妮．同源盒基因与神经系统发育异常[J]．中国 医师杂志，2004，6：858—859． Acta Nutfimenta Sinica．Au旦．．2O07．Vo1．29 No．4 系统的调节作用[J]．中国海洋药物杂志，2005，24： 33—35． [2]吕中明，石根勇，陈新霞，等．壳聚糖免疫调节作用 的研究[J]．实用预防医学，2001，5：330—332． [3]柯海萍，赵鲁杭．壳寡糖对体外培养的巨噬细胞 IL218基因表达的影响[J]．海军医学杂志，2004， 2： 97— 99． [4]Prudden JF，Nyack U．Method and agent for trea— ting inf1ammatory di sorders of the gastrointes— tinal tract[P]．US Patent，1977．4006224． [5]Ingle TR．Vaidya SH，Pal MU．Production of D— glucosamine hydroch1oride(GAH)from fi sh can— ning waste[J]．Res 017 Industry,1993，18：54—56． [6]张莉，刘万顺，韩宝琴．D一氨基葡萄糖及其衍生物抗 肿瘤活性的初步研究[J]．中国海洋药物杂志，2006， 25： 26— 31． [7]徐淑云 (主编)．药理实验方法学[M]．北京：人民 卫生出版社，1992．1208—1244． [8]G．克劳斯 (著)．信号转导与调控 的生物化学[M]．北 京：化学工业出版社，2005．181—196． [13]White JC，Highland M，Kai ser M，et a1．Vitamin A deficiency resu1tS in the dose—dependent ac— qui Sition of anterior character and shortening of the caudal hindbrain of the rat embryo[J]． Dev Biol。2000．220t 263—284． [14]Whi te jc，Shankar VN，Margaret H，et a1．Defects in embryonic hindbrain development and fetal resorption resulting from Vitamin A deficiency in the rat are prevented by feeding pharmaco— logical level S of al1一trans—retinoic acid[J]． Proc Natl Acad Sci，1998，95：l3459— 13464． (续 完) 维普资讯 http://www.cqvip.com