SNT 0423-2010 出口冻兔肉中兔出血病病毒检验 免疫学方法

书书书 中华人民共和国出入境检验检疫行业 犛犖／犜０４２３—２０１０ 代替ＳＮ０４２３—１９９５ 出口冻兔肉中兔出血病病毒检验 免疫学方法 犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳狉犪犫犫犻狋犺犪犲犿狅狉狉犺犪犵犻犮犱犻狊犲犪狊犲狏犻狉狌狊犻狀犲狓狆狅狉狋犻狀犵犳狉狅狕犲狀 狉犪犫犫犻狋狊—犐犿犿狌狀狅犾狅犵狔犿犲狋犺狅犱 ２０１０１１０１发布 ２０１１０５０１实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局 发 布 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 书书书 中华人民共和国出入境检验检疫 行　业　标　准 出口冻兔肉中兔出血病病毒检验 免疫学方法 ＳＮ／Ｔ０４２３—２０１０  中 国 标 准 出 版 社 出 版 北京复兴门外三里河北街１６号 邮政编码：１０００４５ 网址 ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ 电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８ 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷  开本 ８８０×１２３０ １／１６　印张 ０．７５　字数 １７ 千字 ２０１１年４月第一版　２０１１年４月第一次印刷 印数１—１６００  书号：１５５０６６·２２１５９４　定价 １６．００ 元 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 书书书 前　　言 　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。 本标准代替ＳＮ０４２３—１９９５《出口冻兔肉中“兔出血病”病毒方法》。 本标准与ＳＮ０４２３—１９９５相比，主要技术变化如下： ———修改标准的中英文名称，增加副标题； ———增加前言； ———将原标准的主题内容与适用范围改为范围； ———增加性引用文件； ———增加术语、定义和缩略语； ———增加抽验标准、方法； ———流程图、试剂的配制调整到附录Ａ、附录Ｂ。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国连云港出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：孙晓斌、王维志、于维军、张敬友、潘荣生。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： ———ＳＮ０４２３—１９９５。 Ⅰ 犛犖／犜０４２３—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 出口冻兔肉中兔出血病病毒检验 免疫学方法 １　范围 本标准规定了出口冻兔肉中兔出血病病毒样品的采集、检测方法和结果判定。 本标准适用于出口冻兔肉中兔出血病病毒的检验。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 ＧＢ／Ｔ１８０８８　出入境动物检疫采样 ３　术语、定义和缩略语 下列术语和定义及缩略语适用于本文件。 ３．１　术语和定义 ３．１．１ 兔出血病病毒　狉犪犫犫犻狋犺犲犿狅狉狉犺犪犵犻犮犱犻狊犲犪狊犲狏犻狉狌狊 是导致兔发生兔出血病的病原，兔出血病是兔高度接触传染性、致死性疫病，世界动物卫生组织 ＯＩＥ和我国分别将之列入ＯＩＥ疾病名录和二类动物疫病。 ３．２　缩略语 ＥＬＩＳＡ　（ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓｙ）　酶联免疫吸附试验 ＨＡ　（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ）　血凝试验 ＨＩ　（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）　血凝抑制试验 ＩＨＡ　（ｉｎｄｉｒｅｃｔｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ）　间接血凝试验 ＩＨＩ　（ｉｎｄｉｒｅｃｔｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）　间接血凝抑制试验 ４　器材与试剂 ４．１　器材 ４．１．１　分析天平（千分之一）。 ４．１．２　普通离心机（离心力５０００×犵）。 ４．１．３　微型高速离心机（离心力１７０００×犵）。 ４．１．４　均质器。 ４．１．５　持针器。 ４．１．６　玻璃研磨器。 １ 犛犖／犜０４２３—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ４．１．７　微型振荡器。 ４．１．８　培养箱。 ４．１．９　微量移液器。 ４．１．１０　血凝反应板。 ４．１．１１　酶标反应板。 ４．１．１２　酶标测定仪。 ４．２　试剂 ４．２．１　鞣酸（分析纯）。 ４．２．２　磷酸氢二钾（分析纯）。 ４．２．３　磷酸二氢钾（分析纯）。 ４．２．４　磷酸氢二钠（分析纯）。 ４．２．５　柠檬酸（分析纯）。 ４．２．６　四甲基联苯胺（分析纯）。 ４．２．７　过氧化脲（分析纯）。 ４．２．８　硫酸（分析纯）。 ４．２．９　硫酸铵（分析纯）。 ４．２．１０　聚乙二醇６０００。 ４．２．１１　三氯甲烷（分析纯）。 ４．２．１２　氯化钠（分析纯）。 ４．２．１３　氯化钾（分析纯）。 ４．２．１４　吐温２０。 ４．２．１５　小牛血清蛋白（ＢＳＡ）。 ４．２．１６　卵清蛋白（ＯＶＡ）。 ４．２．１７　乙酸钠（分析纯）。 ４．２．１８　乙酸（分析纯）。 ４．２．１９　１％人血红细胞悬液，见附录Ａ．１。 ４．２．２０　２％经致敏的双醛化绵羊红细胞悬液，见附录Ａ．２。 ４．２．２１　包被液（ＣＢ），见附录Ａ．３。 ４．２．２２　ＰＢＳ液，见附录Ａ．４。 ４．２．２３　洗涤液（ＰＢＳＴ），见附录Ａ．５。 ４．２．２４　稀释液（保温液），见附录Ａ．６。 ４．２．２５　底物液，见附录Ａ．７。 ４．２．２６　醋酸钠柠檬酸缓冲液，见附录Ａ．８。 ４．２．２７　终止液，见附录Ａ．９。 ４．２．２８　兔出血病病毒阳性血清，见附录Ａ．１０。 ４．２．２９　ＲＨＤＶＩｇＧ，见附录Ａ．１１。 ４．２．３０　酶标记第二抗体，见附录Ａ．１２。 ５　样品采集 ５．１　抽样标准 按ＧＢ／Ｔ１８０８８的规定采样。 ２ 犛犖／犜０４２３—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ５．２　抽样方法 以同一检验检疫批为单位抽样，按规定的抽样件数，根据样点分布均匀化的原则，按棋盘式或对角 线随机抽取。抽取的样品需在实验室进行如下处理： ａ）　冻带骨兔肉：每只被采集样品的兔体取胫骨两支，装入清洁的塑料袋中； ｂ）　去骨兔肉：每件中剪取同一兔体肌肉２０ｇ～３０ｇ，作为原始样品，混合后置于清洁容器内，作为 混合原始样。混合原始样的质量不少于３００ｇ。 ５．３　样品的标识和保存 取代表性样品应保持冷冻状态，保证样品不受外界的污染，加贴标签和官方封识。样品应立即送到 实验室进行检测，存查样品应存放在－１８℃的温度下保存，保存期至索赔期满为止。 ６　操作步骤 ６．１　试样的制备 ６．１．１　匀浆 ６．１．１．１　骨髓试样 以持针器夹碎胫骨取出骨髓。装入小型塑料离心管，称量。用５倍量的０．０１ｍｏｌ／ＬｐＨ７．４ＰＢＳ 稀释。用玻璃研磨器研磨匀浆后装入玻璃瓶内。 ６．１．１．２　肌肉试样 称量１０ｇ肌肉，加入５０ｍＬ０．０１ｍｏｌ／ＬｐＨ７．４ＰＢＳ。高速匀浆机匀浆１ｍｉｎ～３ｍｉｎ，匀浆后装入 三角烧瓶。 ６．１．２　冻融 匀浆后试样置低温冰箱内反复冻融三次后，３５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ取上清液。 ６．１．３　浓缩 在所得上清液中，加入上清液量６％的聚乙二醇６０００，并加氯化钠至３％，置４℃冰箱过夜。 ６．１．４　悬浮 浓缩过的样品液３５００ｒ／ｍｉｎ～４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ去上清液，沉淀物以少量０．０１ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．４ＰＢＳ悬浮，成混悬液（肌肉样用１ｍＬ，骨髓样用０．３ｍＬ）。 ６．１．５　去杂 在所得混悬液中加入四分之一体积的三氯甲烷，摇匀４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ取水相，置冰箱冻结 保存备用。 ６．２　犎犃、犎犐试验 ６．２．１　血凝试验（犎犃试验） ６．２．１．１　在９６孔Ｖ型微量血凝反应板上，从第一孔至第十一孔，每孔加入ＰＢＳ２５μＬ。然后在第一孔 ３ 犛犖／犜０４２３—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 加入待检样品的浓缩液２５μＬ，从第一孔开始用移液器，作等量稀释至第十孔，最后一孔弃去２５μＬ。第 十一孔是ＰＢＳ对照，第十二孔加入１∶１０正常兔肝悬液２５μＬ对照。 ６．２．１．２　每孔各加入１％人“Ｏ”型红细胞２５μＬ，立即在微型混合器上摇匀，置室温。待对照孔血细胞 完全沉积后观察结果。 ６．２．１．３　血凝效价表示方法，其中血凝程度以＋＋＋＋、＋＋＋、＋＋、＋、－表示： ａ）　“＋＋＋＋”：红细胞均匀铺于孔底； ｂ）　“＋＋＋”：红细胞基本同上，但边境不整齐，有下垂趋向； ｃ）　“＋＋”：红细胞于孔底形成一个环状，四周有小凝结块； ｄ）　“＋”：红细胞于管底形成一个小团，但边缘不光滑，四周有凝结块； ｅ）　“－”：红细胞于孔底形成小团，边缘整齐，光滑。 注：出现＋＋＋＋为其凝集终点。 ６．２．２　血凝抑制试验（犎犐试验） ６．２．２．１　在９６孔Ｖ型微量血凝反应板上，待检样品浓缩液稀释方法同上。一个样品做相同的两排。 ６．２．２．２　第一排每孔加ＰＢＳ２５μＬ，第二排每孔加阳性血清２５μＬ摇匀，３７℃温箱放置１０ｍｉｎ。 ６．２．２．３　各孔加入１％人“Ｏ”型红细胞２５μＬ，立即在微型混匀器上摇匀，置室温。待对照孔红细胞完 全沉淀后观察结果。 ６．２．２．４　结果判定中，血凝效价表示方法同６．２．１．３。ＨＡ与 ＨＩ试验两排孔的血凝效价相差两个滴 度以上者则为阳性。 ６．３　犐犎犃及犐犎犐试验 ６．３．１　间接血凝试验（犐犎犃试验） ６．３．１．１　反应在９６孔Ｖ型微量血凝反应板上进行。根据被检的份数，按每份材料一排孔安排， 在反应板上依顺序编号。 ６．３．１．２　于各排的每孔中加ＰＢＳ稀释液２５μＬ。 ６．３．１．３　取被检材料２５μＬ，对号加入该排第一孔，逐孔向后做倍比稀释至倒数第二孔为止，最后一孔 为稀释液对照。 ６．３．１．４　每板设已知阳性、阴性抗原对照各一排。 ６．３．１．５　每孔加致敏血球２５μＬ，移反应板于混匀器上中速摇振至红细胞分散均匀（约１ｍｉｎ），然后将 反应板置３７℃温箱，经８０ｍｉｎ～９０ｍｉｎ后观察结果。 ６．３．１．６　ＩＨＡ凝集效价表示方法： ａ）　“＋＋＋＋”：红细胞均匀铺于孔底； ｂ）　“＋＋＋”：孔内凝结团大于孔面积５０％，未遍及全孔者； ｃ）　“＋＋”：红细胞少许沉积孔底，周围有混浊带约占孔面积５０％； ｄ）　“＋”：红细胞大部分沉积孔底，沉淀边缘模糊者； ｅ）　“－”：红细胞于孔底形成小团，边缘整齐，光滑。 注：结果以“＋＋＋＋”为凝集终点。 ６．３．２　间接血凝抑制试验（犐犎犐试验） ６．３．２．１　每份样品按两排孔安排，操作同前，唯ＩＨＩ排每孔加１∶５０的阳性血清２５μＬ，而ＩＨＡ排每 孔增加稀释液２５μＬ，振荡均匀后，将反应板置３７℃温箱中经８０ｍｉｎ～９０ｍｉｎ判定结果。 ６．３．２．２　结果判定中，ＩＨＩ与ＩＨＡ试验两排孔的血凝价相差两个滴度以上者为阳性。 ４ 犛犖／犜０４２３—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ６．４　犈犔犐犛犃试验 ６．４．１　将提纯抗体用包被液作１∶６４０稀释后加入酶标反应板，每孔１００μＬ。包被后置４℃冰箱 过夜。 ６．４．２　取出包被的反应板用洗涤液洗三次，每次３ｍｉｎ（每次加洗涤液后，放置３ｍｉｎ再倾去），将板甩 干拍净。 ６．４．３　用稀释液将待检浓缩液作１∶２和１∶４稀释，每个检样的两种稀释液分别各加入两个孔，每孔 １００μＬ，每块板同时加阳性，阴性样品各两孔，作对照用，每块板同时加两孔稀释液留作空白对照，置 ３７℃温箱９０ｍｉｎ。 ６．４．４　取出反应板用洗涤液洗三次，方法同６．４．２。 ６．４．５　各孔加酶标第二抗体１００μＬ，置３７℃温箱９０ｍｉｎ。 ６．４．６　取出反应板用洗涤液洗三次，每次３ｍｉｎ，将板甩干拍净。 ６．４．７　每孔加底物液１００μＬ，置３７℃温箱１５ｍｉｎ。要求避光。 ６．４．８　取出反应板，每孔加终止液５０μＬ终止反应。 ６．４．９　测定光密度值或目测。 ６．４．１０　结果判定以酶标测定仪测定ＯＤ值。若待检样品ＯＤ值与已知阴性样品ＯＤ值之比（犘／犖）≥ ２时，判定为阳性，否则为阴性。若目测，凡是待检孔的颜色比阴性孔深者为阳性，否则为阴性。 如果采用商品化试剂盒按试剂盒规定的方法检测。 ７　报告结果 报告阳性结果。ＨＡ、ＨＩ试验，ＩＨＡ、ＩＨＩ试验及ＥＬＩＳＡ试验。三者任选一种检测方法进行检测， 凡出现阳性者均可报告阳性结果。否则判为阴性结果。 ８　检验流程 见附录Ｂ。 ５ 犛犖／犜０４２３—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 附　录　犃 （规范性附录） 试 剂 配 制 　　 犃．１　１％人血红细胞悬液 新鲜人血红细胞（Ｏ型）用２０倍量生理盐水洗涤三次，最后以２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，吸取压积 细胞用生理盐水配成１％悬液。 犃．２　０．０１犿狅犾／犔狆犎７．４犘犅犛溶液 称取氯化钠（ＮａＣｌ）８．５ｇ，氯化钾（ＫＣｌ）０．２ｇ，磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ）２．９ｇ，磷酸二氢钾 （ＫＨ２ＰＯ４）０．２ｇ，定容至１０００ｍＬ双蒸水中，保存于室温或４℃冰箱中。 犃．３　２％经致敏的双醛化绵羊红细胞悬液 以１ｍＬ双醛化绵羊红细胞的致敏为例。１ｍＬ双醛化绵羊红细胞离心，去上清液，用ｐＨ７．４， ０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ洗一次，５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，去上清液，加入４．９ｍＬ生理盐水，０．１ｍＬ１％鞣酸， ３７℃水浴１０ｍｉｎ，５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，去上清液，加入ｐＨ４．３，０．２ｍｏｌ／Ｌ乙酸缓冲液５ｍＬ， ＲＨＤＶＩｇＧ０．０５ｍＬ，３７℃水浴３０ｍｉｎ。５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，去上清液，用５ｍＬ生理盐水洗三 次，用ｐＨ７．４，０．０１ｍｏｌ／Ｌ的ＰＢＳ配制成２％血球悬液备用。 犃．４　包被液（犆犅，狆犎９．６，０．０５犿狅犾／犔碳酸盐缓冲液） 碳酸钠（Ｎａ２ＣＯ３）１．５９ｇ、碳酸氢钠（ＮａＨＣＯ３）２．９３ｇ加双蒸水溶解至１０００ｍＬ。 犃．５　洗涤液（犘犅犛犜，狆犎７．４磷酸盐缓冲液－０．５％吐温２０） 氯化钠（ＮａＣｌ）８．０ｇ、磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ）２．９ｇ、磷酸二氢钾（ＮａＨ２ＰＯ４）０．２ｇ、氯化 钾（ＫＣｌ）０．２ｇ、吐温－２００．５ｍＬ加双蒸水溶解至１０００ｍＬ。 犃．６　稀释液（保温液犘犅犛犜犗犞犃） 于ＰＢＳＴ内加入卵清蛋白使其浓度为０．１％。 犃．７　底物液 犃．７．１　６０ｍｇＴＭＢ（四甲基联苯胺）溶于１０ｍＬ二甲亚砜中，４℃避光保存，备用（可保存３个月）。 犃．７．２　１４０ｍｇ过氧化脲溶于１００ｍＬ，ｐＨ５．６，１ｍｏｌ／Ｌ的醋酸钠柠檬酸缓冲液中，４℃避光保存，备 用（可保存３个月）。 ６ 犛犖／犜０４２３—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 犃．７．３　临用前取按Ａ．７．１要求所制溶液２５０μＬ，溶入到２ｍＬ按Ａ．７．２要求所制溶液中，随即加入 １８ｍＬ双蒸水混匀。 犃．８　狆犎５．６，１犿狅犾／犔醋酸钠柠檬酸缓冲液 ５００ｍＬ１ｍｏｌ／Ｌ醋酸钠加１７ｍＬ１ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸缓冲液。 犃．９　终止液 于５００ｍＬ双蒸水中缓慢加入７６ｍＬ浓硫酸（９８％），混匀。 犃．１０　兔出血病病毒阳性血清（犚犎犇犞）的制备 取健康兔，肌肉注射本病毒疫苗１ｍＬ。然后分别在第１５天、第３０天时注射强毒１ｍＬ，最后一次 注射后１０ｄ试血，当ＨＩ效价达到１∶１２８时采血清即得。 犃．１１　犚犎犇犞犐犵犌的制备与纯化 取ＲＨＤＶ阳性血清用等量的饱和硫酸铵盐析沉淀三次后，再以三分之一量的饱和硫酸铵盐析沉淀 两次，最后再经ＤＥ５２或ｓｅｐＨａｄｅｘＧ２００层析后得到较纯化的ＲＨＤＶＩｇＧ。 犃．１２　酶标记第二抗体（市售） 酶标记羊抗兔ＩｇＧ，工作效价１∶４０００或酶标记葡萄球菌Ａ蛋白，工作效价１∶４０。 犛犖／犜０４２３—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 书书书 犛犖／犜０４２３—２０１０ 附　录　犅 （规范性附录） 出口冻兔肉中兔出血病病毒检验流程图 图犅．１　出口冻兔肉中兔出血病病毒检验流程图 ０１０２— ３２４０ 犜／ 犖犛 书号：１５５０６６·２２１５９４ 定价： 　　１６．００ 元 版权所有 · 禁止翻制、电子发售