枸杞多糖对糖尿病小鼠模型免疫功能的影响

3 云南省教委应用基金资助项目(9612117 ) ①昆明医学院物理学教研室 ; ②昆明医学院第二附属医院内分泌 科 ; ③北京中国医学科学院动物所生殖生物学实验室 文章编号 : 100122478 (2000 ) 0320159204 枸杞多糖对糖尿病小鼠模型免疫功能的影响 3 王 　玲 , 李维波① , 邓学端 , 张才军 , 谢蒲伶 , 蒋绿芝② , 赵 　羽中 ③ 昆明医学院微生物学与免疫学教研室 　昆明 　650031 摘要 : 利用静脉注射四氧嘧啶 (100mg/ kg ) 诱导制备糖尿病小鼠模型 , 观察 LBP2D 对四氧嘧啶致糖尿病小鼠免疫功能的影 响。研究表明 , 小鼠在注射四氧嘧啶后 72h , 灌胃 (ig )给予 LBP2D , 连续 10d , 糖尿病小鼠 NS对照组免疫功能明显降低 , 而 LBP2D 组显示 LBP2D 具有明显促进小鼠淋巴细胞增殖、调节 T淋巴细胞亚群及提高 IL21 和 IL22 水平的功能 , 使四氧嘧啶糖 尿病小鼠免疫功能恢复接近正常。研究结果显示 , LBP2D 对糖尿病模型小鼠有免疫调节治疗效应。 关键词 : LBP2D ; 四氧嘧啶 ; 糖尿病 ; 淋巴细胞增殖 ; T淋巴细胞亚群 ; IL21 ; IL22 中图分类号 : R39216 　　文献标识码 : A The Effects of LBP2D on Immune Functions in Alloxan2Induced Diabetes Mice Wang Ling , Li Weibo , Deng Xueduan , Zhang Caijun , Xie Pulin , Jiang Luzhi , Zhao Chong ( Department of Microbi2 ology and Immunology , Kunming Medical College , Kunming 650031 ) Abstract 　An experiment diabetes mouse model was induced by intravenous injections of alloxan monohydrate (100mg/ kg ) , and LBP2D was administrated 72 hours after injections of alloxan for 10 successive days1 It was found that LBP2D had a remarkablly enhancing effects on the immune functions including the enhancement of lymphocyte proliferation , up2 regulation in the numbers of T lymphocyte subsets , elevations of the IL21 and IL22 levels , and recovery of the immuno2 compromised functions of the alloxan - induced diabetes mice near to normal1 These experimental results implicate that LBP2D appears to have a immuno2regulatory effect on the alloxan2induced diabetes mice1 Key words 　LBP2D ; alloxan monohydrate ; diabetes ; lymphocytes proliferation ; T lymphocytes subpopulations ; IL21 ; IL22 　　糖尿病是一种常见的多发的内分泌代谢性疾 病 , 近年来发病率处于上升趋势 , 其死亡率仅次于 肿瘤和心血管病。高血糖还可诱发冠心病和动脉粥 样硬化 , 严重危害人类的生命健康。新近研究表 明[1 ] , 糖尿病患者可出现多种免疫功能的紊乱。采 用环孢霉素、硫唑嘌呤等免疫疗法治疗有严重的副 作用[2 ] , 而降糖药长期使用会失效[3 ] 。因此从天然 药物中筛选和研究降糖药 , 已为世界各国工作者所 嘱目。近年来国内外对具有降糖作用的植物多糖的 化学和药理研究进展迅速[4 ] , 多糖类成分不仅是一 种非特异免疫增强剂 , 而且还起到抗菌、抗病毒、 抗肿瘤等功能 , 并具有降血糖、降血脂、降血压等 多种作用 , 且无毒副作用。本文首次研究了枸杞多 糖2D 组份 (Lycium barbarum Polysaccharides2D , LBP2D )对四氧嘧啶糖尿病小鼠免疫功能的影响。 1 　材料和方法 111 　主要试剂　RPMI1640 培养基、脂多糖 (LPS ) 、 刀豆蛋白 A (Con A ) 、四氧嘧啶、methy1α2D2man2 noside (α2MM ) 和噻唑蓝 (MTT) 均为美国 Sigma 产 品。三 联 细 胞 裂 解 液 : 10 % SDS25 % 异 丁 醇2 01012mol/L HCl (w/ v/ v ) , 小牛血清为中国医学科 学院血液研究所产品。小鼠 T淋巴细胞亚群检测试 剂盒 , 购于北京医科大学免疫系。 112 　药品 　LBP2D 按文献 [5 ]方法从枸杞子中提 取。实验时用生理盐水 (NS )配成所需浓度。 113 　实验动物 　ICR 小鼠 , 体重 18～24g , 雌雄兼 用 , 云南省天然药物研究中心动物室提供。BALB/ c 小鼠 , 23 ±2g , 雄性 , 上海实验动物中心供应。 114 　主要仪器 　荧光显微镜 , 日本产 Olympus (昆 明医学院第一附属医院中心实验室免疫室提供) 。 722 型光栅分光光度计 , 上海第三分析仪器厂出品 ·951·《上海免疫学杂志》2000 年第 20 卷第 3 期 (Q/ YXLH4292 型) 。ELISA 仪 (美国产 Biotek EL2340 型 , 云南省天然药物药理重点实验室提供) 。 115 　动物模型 　实验性四氧嘧啶糖尿病动物模型 的制备参见文献[6 ] , 四氧嘧啶由小鼠尾静脉注入 , 剂量为 100mg/ kg。正常对照组小鼠血糖为 5189 ± 0121mmol/ L , 模型组小鼠用药前血糖为 18144 ± 0181mmol/ L , 用药后血糖在 8160 ±0138mmol/ L～ 9181 ±0182mmol/ L。LBP2D 对四氧嘧啶糖尿病小鼠 血糖的影响另文发表。 116 　给药方法 　ICR 小鼠随机分成 5 组 (每组小鼠 数见结果表中) , 正常对照组和四氧嘧啶动物模型 组。后者在四氧嘧啶注射后 72h , 开始灌胃给药 (ig ) 。正常对照组和四氧嘧啶动物模型的 NS 对照 组 : NS 每只鼠 015ml/ 次 ; LBP2D 三个剂量给药组 (200、400、800mg/ kg1d )连续用药 10d , 第 11 天检 测免疫学功能。 117 　淋巴细胞增殖实验 　胸腺细胞和脾细胞增殖 实验按文献[7 ]进行。 118 　T 淋巴细胞亚群的检测[8 ] 　大鼠抗小鼠 CD4 及Lyt22 单克隆抗体 (McAb ) 和 FITC2兔抗大鼠 IgG McAb 用 0101mol/ L PBS 按 1∶10 稀释。取 ICR 小鼠 的脾细胞 (1 ×107/ ml ) 50μl 移入 40 孔塑料培养板 中 , 离心沉淀弃上清后 , 加 CD4 或 CD8 McAb 40μl/ 孔。非特异染色对照加等量的 RPMI1640 液混匀 , 4 ℃反应 30min , 洗涤三次 , 弃上清 , 每孔加入 FITC2兔抗大鼠 IgG 40μl , 混匀 , 4 ℃反应 30min , 洗 涤三次后加 100μl Hanks 液混匀 , 吸取 10μl 置血球 计数板上 , 在荧光显微镜 (激发光 490nm , 屏障滤 板透光范围 520nm～530nm ) 下观察计数。每个样 品共计数 200 个细胞 , 其中阳性荧光细胞数换算成 阳性百分率 ( %) 。 119 　IL21 的测定 11911 　小鼠腹腔巨噬细胞 (MΦ )的制备 : 取 ICR 小 鼠 , 无菌收集腹腔渗出细胞 (PEC ) , 同组合并后用 RPMI1640 培养液洗二次 , 将细胞悬浮于含 10 %小 牛血清 RPMI1640 完全培养基中 , 调整细胞浓度到 2 ×106/ ml , 接种至培养板上 , 于 37 ℃、5 %CO2 饱 和湿度条件下培养 2～3h , 然后洗去未贴壁细胞 , 得到 MΦ单层。 11912　IL21 的诱生与检测[9 ] : 将上述 PEC 悬液 , 按每孔 1ml 加到 24 孔培养板上 , 得到 MΦ单层 , 于各孔中加入 LPS (终浓度为 10μg/ ml ) , 培养 24h 后收获上清 , 作为 IL21 样品。IL21 活性的测定用 Con A (215μg/ ml ) 活化的 BALB/ c 小鼠胸腺细胞增 殖 MTT法。 1110 　IL22 的测定 111011 　脾细胞的制备 : BALB/ c 小鼠 , 摘除眼球 取血 , 断颈处死后 , 无菌取脾 , 制备单个细胞悬 液 , 将细胞用 Hanks 液洗两次 , 将细胞重悬于 RP2 MI1640 培养液 , 活细胞率 > 90 %。 111012 　Con A 活化小鼠脾细胞的制备[7 ] : 取上述 小鼠脾细胞 5 ×106/ ml 加 Con A 10μg , 1ml/ 孔分装 于24 孔组织培养板个孔中 , 置 CO2 孵箱内培养 48h。收集培养细胞用α2MM洗液 (含α2MM 20mg/ ml 的 RPMI1640 培养液) 洗三次以除去 Con A , 然后重 悬于 RPMI1640 培养液中作为 IL22 活性的检测细 胞。 111013 　小鼠 IL22 活性测定[7 ,9 ] : MTT 比色法测定 IL22 的水平。将 5 ×106/ ml Con A 活化的小鼠脾细 胞 100μl 分别加入 96 孔板中 , 再加入 100μl 1∶8 稀 释的待检样品 , 设培养液对照孔。经 4h 培养后 , 加入 MTT 溶液 20μl/ 孔 ; 继续培养 4h 后 , 加入三 联液 100μl , 于 37 ℃放置过夜 , 用 ELISA 仪 , 选择 检测波长 570nm , 参考波长 630nm 测定 A 值。 1111 　统计学分析 　实验数据以 €x ±s 表示 , 组间 比较采用 t 检验。 2 　结果 211 　LBP2D 对小鼠淋巴细胞增殖的影响 　小鼠在 注射四氧嘧啶后 72h , ig 给药 , 模型 NS 对照组和 正常对照组均给等量 NS。连续用药 10d , 第 11 天 检测小鼠胸腺和脾脏淋巴细胞增殖实验 , 结果见表 1。由结果可见 , 模型 NS 对照组与正常对照组比 较 , 小鼠淋巴细胞增殖明显降低 ( P < 0101 ) , 模型 LBP2D 三个剂量给药组均不同程度促进淋巴细胞增 殖 , 800mg/ kg1d 组能使小鼠胸腺淋巴细胞增殖基 本恢复至正常。 表 1 　LBP2D 对四氧嘧啶糖尿病小鼠淋巴细胞增殖的影响 组别 鼠数(N ) 剂量 (mg/ kg1d ) A570nm( €x ±s )胸腺细胞增殖实验 脾细胞增殖实验 正常对照组 10 - 015628 ±010717 015304 ±011518 模型 NS对照组 10 - 012883 ±010106 △△012695 ±010080 △△ 模型LBP2D 组　 10 200 014093 ±010335 33 013891 ±010335 33 10 400 014205 ±010312 33 013944 ±010232 33 10 800 015824 ±010622 333 013627 ±010316 33 模型 NS对照组与正常对照组比较 , △△P < 0101 用药组与 NS对照组比较 , 33 P < 0101 ; 333 P < 01001 ·061· 《上海免疫学杂志》2000 年第 20 卷第 3 期 212 　LBP2D 对四氧嘧啶糖尿病小鼠 T 淋巴细胞亚 群的影响　结果见表 2。实验表明 , LBP2D 主要是 对 CD4 + T淋巴细胞亚群具有上调作用 , 使其数值 接近正常 , 而对 CD8 无影响 , 因而使 CD4/ CD8 比 值也接近正常。由此可见 , LBP2D 具有明显的调节 T淋巴细胞亚群的作用。 表 2 　LBP2D 对四氧嘧啶糖尿病小鼠 T淋巴细胞亚群的影响 　　组别 鼠数(N ) 剂量 (mg/ kg1d ) 阳性细胞 ( % , €x ±s )CD4 CD8 CD4 + / CD8 +( €x ±s ) 正常对照组 10 - 87182 ±1104 74134 ±2102 1118 ±0104 模型 NS对照组 10 - 65125 ±2171 △△△ 71193 ±1165 0191 ±0104 △△△ 模型LBP2D 组 10 200 79185 ±2179 333 71112 ±2108 1113 ±0105 333 10 400 80183 ±2173 333 71129 ±2125 1101 ±0108 333 10 800 81164 ±1190 333 72158 ±2109 1113 ±0105 333 模型 NS对照组与正常对照组比较 , △△△P < 01001 ; 模型LBP2D 用药组与模型 NS对照组比较 , 333 P < 01001 213 　LBP2D 对四氧嘧啶糖尿病小鼠 IL21 水平的影 响 　将小鼠 MΦ用LPS (10μg/ ml ) 孵育 18～24h 后 , 测定各组小鼠 IL21 水平 , 结果 (表 3) 。模型 LBP2 D 用药组培养上清 IL21 水平均比模型 NS 对照组增 加 , 以 400mg/ kg1d 最为显著 ( P < 01001 ) , 表明 LBP2D 对 MΦ合成和释放 IL21 明显促进作用。 　　表 3 　LBP2D 对四氧嘧啶糖尿病小鼠 MΦ产生 IL21 水平的影响 ( IL21 样品 1∶8 稀释) 　　组别 鼠数 (N ) 剂量 (mg/ kg1d ) 　　A570nm( €x ±s ) 正常对照组 11 - 013168 ±01024 模型 NS 对照 组 11 - 01109 ±010046 △△△ 模型LBP2D 组 11 200 011377 ±010087 33 11 400 012101 ±010064 333 11 800 012884 ±01011 33 模型 NS对照组与正常对照组比较 , △△△P < 01001 用药组与 NS对照组比较 , 33 P < 0101 ; 333 P < 01001 214 　LBP2D 对四氧嘧啶糖尿病小鼠 IL22 水平的影 响 　结果 (表 4) 。模型 NS 对照组与正常对照组比 较 , 小鼠 IL22 水平明显降低 ( P < 0101 ) , 模型 LBP2D 三个剂量给药组可使 IL22 明显增高 ( P < 0101 ) , 基本恢复至正常。 表 4 　LBP2D 对四氧嘧啶糖尿病小鼠 IL22 水平的影响 组别 鼠数 (N ) 剂量 (mg/ kg1d ) 　　A570nm( €x ±s ) 正常对照组 10 - 014724 ±010259 模型 NS对照组 24 - 011435 ±01138 △△ 模型LBP2D 组 10 200 014414 ±010864 33 10 400 014776 ±010214 33 10 800 014786 ±010478 33 模型 NS对照组与正常对照组比较 , △△P < 0101 模型LBP2D 组与模型 NS对照组比较 , 33 P < 0101 3 　讨论 四氧嘧啶能选择性地破坏胰岛β细胞 , 实验表 明LBP2D 对四氧嘧啶引起的免疫功能的紊乱有明 显的调节作用 , 可试用于糖尿病患者 , 以提高糖尿 病患者的免疫功能。 实验研究表明 , 四氧嘧啶糖尿病小鼠的免疫功 能明显降低 , 而 LBP2D 具有促进四氧嘧啶糖尿病 小鼠淋巴细胞增殖 , 调节 T 淋巴细胞亚群及提高 IL21 和 IL22 水平的功能 , 使四氧嘧啶糖尿病小鼠免 疫功能接近正常。研究结果显示 , LBP2D 对糖尿病 模型小鼠有免疫调节治疗效应。 IL21 是一种作用非常广泛的细胞因子 , 体内至 少有 20 多种细胞能分泌 IL21 , 但 MΦ是 IL21 产生 的主要来源 , LPS可诱导体外培养的MΦ产生 IL21。 本文研究结果表明 , LBP2D 可明显促进 LPS 活化的 四氧嘧啶糖尿病小鼠腹腔 MΦ产生 IL21。IL21 具有 多种生物学效应 , 作用于多种免疫细胞 , 可辅助 T 细胞活化 , 分泌 IL22、IL26 及表达 IL22R ; IL21 不 仅是 B 细胞增殖及分化因子 , 也是 MΦ趋化因子。 IL21 可直接使血糖水平降低 , 而不需要胰岛素的参 与 , 起降血糖因子的作用[1 ] , LBP2D 的降糖作用与 此密切相关。 文献报道[4 ] , 多种植物多糖成分不仅是一种非 特异性免疫增强剂 , 尚有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、 抗辐射、抗衰老的功能 , 且有降血糖 、降血压、 降胆固醇、抗炎和抗血凝等多种作用。由于多糖无 毒副作用 , 将有可能作为一种口服降糖药的辅助药 物用于临床。LBP2D 是从传统中药枸杞子中提取的 有效成分 , 免疫增强作用是其主要药理活性 , 在神 经内分泌免疫网络中具有免疫增强功能[10 ] , 且具 有前述植物多糖降血压、降胆固醇、抗应激及抗衰 老等药理学作用[11 ,12 ] , 这对糖尿病并发症具有防 治作用。LBP2D 可明显从细胞水平和因子水平调节 ·161·《上海免疫学杂志》2000 年第 20 卷第 3 期 四氧嘧啶糖尿病小鼠的免疫功能紊乱 , 这样可纠正 糖尿病患者的免疫功能紊乱。LBP2D 对四氧嘧啶引 起的糖尿病的免疫治疗作用 , 在临床上有广阔的应 用前景 , 这对于结合祖国医学理论去研究开发降糖 新药开辟了一条新的途经 , 但其构效关系有待于深 入研究。 参考文献 [1 ] 　王　玲 ,蒋绿芝. 免疫细胞及细胞因子在胰岛素依赖型糖尿病 致病机制的研究进展. 国外医学·免疫学分册 ,1997 ;20 :190 [2 ] 　张　强 ,于德民. 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