第18卷第8期
2008年4月
中国现代医学杂志
ChinaJoumalofModemMedicine
V01.18No.8
Apr.2008
文章编号: 1005—8982(2008)08—1018一03
·论著·
人参总皂苷对造血细胞红细胞生成素受体表达的影响木
黄永t,王建伟t.-,王亚平-,一,姜蓉1’2
(重庆医科大学1.组胚教研室,2.重庆市生物化学与分子药理学重点实验室,重庆400016)
摘要:目的研究人参总皂苷(TsPG)对脐血造血细胞(ucB)红细胞生成素受体(EPoR)表迭的影响。
方法以25、50、75和100mg/LTsPG刺激脐血单个核细胞24h,采用流式细胞仪检测细胞膜EPoR表达的
变化;细胞E‰实验检测细胞膜EPoR表达量的改变;免疫细胞化学观察细胞EPoR阳性率的变化。结果
流式细胞仪检测显示50mg/LTsPG均能提高脐血细胞膜表面EPoR的表达;细胞Eh站实验结果显示50
mg/LTspG能够提高脐血造血细胞膜表面EPoR的表达量;免疫细胞化学观察显示TsPG50rIlg/L组单个
核细胞的EPoR表达阳性率较对照组显著增高(P
分析,
免疫组化染色观察各组脐血单个核细胞膜表面E—
POR受体表达变化。
1.2.2流式细胞仪检查在重庆医科大学儿童医院
流式细胞仪检查室检查,直接荧光法标记,PBS洗去
荧光抗体,悬浮后以冰盒送检。
1.2.3细胞Elisa实验于96孔微孔板上进行,一抗
兔抗人EPOR抗体稀释度为l:500,二抗羊抗兔
I舡稀释度为l:300,TMB显色,硫酸终止显色,每
组复种3孔,以自动酶标读数仪(Bio—RadE2550
型,入=450nm)测定OD值。相同实验重复3次。
1.2.4免疫细胞化学收集各组细胞进行离心涂
片,按免疫组化染色试剂盒操作说明进行染色。一
抗为EPOR,按l:400稀释。以苏木素复染细胞核。
1.3统计学分析
数据以均数±标准差(互±s)表示,组间比较用
方差分析,P<0.05为差异有显著性。
2结果
余各药物分组平均荧光强度(Fn)除以对照组荧光
值得相对于对照组读数,可有效清除各样本之间的
随机误差,公式:相对对照组读数=FIl/】m。鸭PG
25~75mg,L均能提高EPOR脐血细胞膜表面的表达
量,以髑PG50mg/L提高幅度最明显,P=0.048,见
表l。
表1流式细胞学数据 (n=3)6±s)
,IsPG(蝉皿) 相对于对照组读数(道数)
l-oD00±0.oooo
l-2248±O.4528
1.3608±O.2858
1.4013±o-3376
1.2154±0.2439
注:流式细胞仪测得7网PG和脐血造血细胞膜表面EPOR数量
的关系,结果用sPss统计软件进行方差分析,50mg/L组的EPOR表
达数量较对照Omg几组相比有明显增强,P=o.048。
2.2细胞EIjsa分析
酶标仪设定吸光滤镜波长为450nm,E1isa所得
OD值通过以下公式校正,设髑PGO耻皿浓度下
的(OD值一O.032)/细胞数为一个基数l,其他各组
实验数据=(每孔OD值一0.032)/每孔的细胞数,0
mg,L浓度下实验数据值,见表2,实验结果显示
,I’SPG50~75mg/L作用脐血造血细胞24h后,细胞
膜表面的EPOR表达量较对照组显著增高。
表2 E|isa数据(n:3)在±s)
TsPG(mg几) 实验数据(单位:og)
L0000±O.OOoo
1.5572±O.9460
14.1731±7.1346
43999±3.4689
2.0038±O.4694
注:1sPG剂量和单个核细胞膜表面EPOR数量的关系,结果用
SPss统计软件进行方差分析,50mg几组0D值较0m学儿组显著增
大,P=o.Ol。
2.3免疫组化染色
2.1 流式细胞仪检测TSPG对脐血造血细胞E—
POR表达的影响
应用流式细胞术测定脐血造血细胞的平均荧光强度。以对照组的平均荧光强度(Fo)为基数l,其‘附f:釜墨耄薏筢墨黑嚣篙嚣‘毒器毛表达
·1019·
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万方数据
中国现代医学杂志 第18卷
选来自不同产妇的单个核细胞分组后培养24
h,每张玻片选取3个视野(×1000)计数单个核细
胞数和免疫反应阳性细胞数,细胞核被苏木素染成
蓝色的单个核细胞计为一个,其边缘有黄色沉淀物
的为免疫反应阳性细胞,见表3、附图。结果显示:
1'SPG50m蜀/L组单个核细胞的EPOR表达阳性率
较对照组显著增高(P=O)。
表3TSPG0mg,L和50mg,L诱导的造血细胞EPOR表
达的阳性率(n=9)反±s)
髑PG(m舡) 阳性率
O
50
43.87%±4.09%
65.31%±6.87%
注:经sPss软件分析,用F检验,F=64.889,P=o,50mg几组阳
性率较对照组0m∥L显著加大。
‘
’L
3讨论
造血干/祖细胞膜上存在着造血生长因子的受
体,它接受相应因子的调节而定向增殖分化,机体的
造血调控主要在此阶段进行。就红系血细胞发生来
说,大量的研究表明,EPO与EPOR结合后,EPOR
形成同源二聚体,激活细胞质中蛋白酪氨酸激酶
JAK2(JanusKinase),活化后的JAK2诱导EPOR
和其他蛋白酪氨酸残基磷酸化,如Shc,SH一阴Pl
(SH2domaincontainingproteintyrosinephos—
phatase,含SH2功能区的蛋白酪氨酸磷酸酶),
STAT5(si印al缸ansducerarIdactivatoroftmsc邱一
tion,信号传导和转录激活因子)等,EPORC一末端
酪氨酸残基磷酸化为胞质中含SH2(srcHomolo—
g)r)功能区的蛋白质提供SH2泊位,进一步活化其
他信号分子,实现EPOR介导的促进红系祖细胞增
殖和分化的作用田。EPO导致的信号转导经30一60
min下降到基础水平,膜上与EP0结合的EPOR以
每分钟6%的速度内陷经泛素蛋白标记后被分子伴
侣引导至溶酶体和蛋白酶体中降解,还有一部分又
重新循环到细胞膜上来【4】。
EPOR在正常或转化的红系细胞表面含量极
低,表达量大约为1000个/细胞,而99%的EPOR
存在于造血细胞的细胞浆内四。EPOR主要表达于
CFU—E阶段,并随红细胞的成熟而递减,网织和成
熟红细胞表面缺乏EPOR嘲。笔者选择人脐血造血细
胞为研究对象,提取细胞总蛋白进行westemblot,
结果表明:不同剂量的,ISPG作用造血细胞24h后,
并没有明显改变EpoR的表达量阴,分析其原因,实
验观察到的这一现象是在提取细胞总蛋白后进行
West咖blot得出的结果,而起关键作用的细胞膜上
是否存在EPOR“量”和“质”的变化尚不能确定。
NEUMANN等【8】报道红细胞表面EPOR至多为每个
细胞1000个,大部分存在于细胞内。对白血病细胞
株EPOR表达的研究发现,白血病细胞株能表达功
能性的EPOR,但EPOR阳性率不与增殖反应相一
致,提示细胞对EPOR的敏感性是依赖于能将信号
从EPoR转导到细胞核的细胞内转导系统的存在与
否,而不单纯依赖于细胞表面EPOR的阳性率刚0】。
据此,笔者推测出现上述现象可能存在的因素有:①
EPOR位置重塑:EPOR总量不变的情况下,位置发
生变化,胞浆中的EPOR转移到胞膜表达。②胞浆中
的EPOR转移到胞膜的同时,功能性EPOR数量增
加。③胞膜上功能性EPOR数量增加或活性增强,
EPOR分布、数量不变。因此,要想弄清楚俗PG作用
于造血细胞表面功能性EPOR的分子事件,尚需笔
者更深入地研究。
本实验结果显示,造血细胞与鸭PG共培养24h
后,免疫组化显示造血细胞膜上EPoR表达阳性率
增高,流式细胞仪和细胞Elisa检测均显示在适当的
药物剂量(50mg,L)刺激下造血细胞膜表面的E—
POR的表达量有显著增加,结合上述笔者以往的实
验结果,推测1’sPG可促使细胞内的EPOR转移到
细胞膜表面或者抑制细胞膜表面的EPOR内陷入细
胞内。细胞膜表面EPOR受体数量增加导致转导人
细胞内信号的增加,引起后续信号放大,从而提高造
血细胞的增殖分化能力。
因此,本实验从探讨人参总皂苷对造血细胞膜
表面EPOR表达变化的角度,来研究了人参提取物
促进血发生的现代生物学机制,并为其提供了新的
证据。
参考文献:
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(下转第1023页)
·1020·
万方数据
第8期 伍校琼,等:人静脉移植物eNOs和hN0s的表达
3讨论
在再狭窄的静脉移植物中,常常可观察到中膜
有毛细血管的出现【6J。笔者以前也曾对此作了报
道【7】。在正常大的静脉血管,其外膜上有小的血管,
营养物质可通过这些小血管弥散到中膜以营养中
膜。当静脉移植到动脉通路时,外膜小血管的连接遭
到破坏,中膜因而相对缺氧缺血。一般认为这种状
况是诱导中膜毛细血管生成的原因。大量研究表明
组织缺血、缺氧刺激eNOS的表达,提高和促进
eNOS的表达能使缺血组织毛细血管增多【81。笔者在
本实验中观察到中膜新生的毛细血管表达较高的
eNOS,同时具有生物活性。这些结果提示eNOS可
能在静脉移植物中膜毛细血管的生成过程中起了重
要作用。
笔者也观察到了在静脉移植物发展过程中
eNOS在管腔内皮细胞的表达变化,eNOS的表达模
式和新内膜的形成有一定的关系,内膜厚度增加的
部位,eNOS的表达呈低水平,由于NO能抑制平滑
肌细胞的增殖和移动,因此笔者推测eNOS表达的
下降可能参与了新内膜的形成。eNOs表达的变化
可能受血流切应力变化的调节。当静脉连接到高血
流的动脉通路上时,增强的血流切应力诱导静脉内
皮细胞表达高水平的eNOS,而长时问持续的血流
切应力又会使内皮细胞受损,因而内皮细胞功能受
到损害导致eNOs的表达下降。
本实验笔者揭示了eNOS在静脉移植物的表达
模式,提示eNOS在中膜毛细血管的生成和新内膜
形成过程中扮演了重要角色。
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