血红蛋白测定方法抗干扰能力的比较

重庆医科大学学报 2005年第31)卷第 4期 (Journal of Chongqing Medical University 2005 Vol 30 No 4) 文章编号：0253—3626(2005)04—0591—03 血红蛋白测定方法抗干扰能力的比较 程朝英 ，廖 蓉 ，夏 丽 ，李生兵。，郭 睿 ，赵利娜 ，廖 飞 (1．苇庆If 第八人民 院内科， 庆 400015；2．重庆 科大学附属第一医院；3．再庆医科大学牛物化学教研室，重庆 400016) 【摘 要】目的：探讨抗氧化体系干预物质和维生素C(vc)x~血红蛋白(Hb)测定的十扰。方法：兔红细胞溶血后为样品。比 较抗氧化酶抑制剂和 VC肘直接测定 Hb、测定碱化 、测定叠氮 Hb等的干扰。结果：直接测定 Hb吸收、测定叠氮 Hb都受 到VC、超氧化物歧化酶抑制剂、过氧化氢酶抑制剂等的干扰，碘乙酰胺和谷胱甘肽过氧化物酶抑制剂干扰较小。上述物质对 测定碱化 H略几 没有 {二扰。结论：测定碱化 H略用于评价高浓度 VC的溶血作用和机制更可靠。 【关键词】【f【L红蛋白测定；维生素c；抗氧化体系；碱化血红蛋白；溶血 【中国图书分类法分类号】Q5(}3 【文献标识码】A 【收稿日期】2005—03—02 Resistance of different methods of hemoglobin assay to common interference CHENG Chaosng，et al (The 8 Renming Hospital ofChongqing) 【Abstract】Obja'tive： Fo investigate the effects of common inhibitors of the antioxidation system and vitamin c on the me&surement of hemoglobin(Hb)．Meth(ds：Hemolyzed rabbit red blcxxt cell WSS used as the sample．The interferences of common inhibitors of the antioxidation system on as．say Of teo by its ab~)rbance at 540nm．alkalinized I-t10 by ab~)rbance at 575nm．the azide—Hb complex by abmrbance at 542nm were compared ．Results：Vitamin C and the inhibitors of superoxide dismutase，cataiase exhibited larger interfer— ence~s with direct assay of Hb by abmrbance at 540 nIn and the a&say of azide—Hb，and inhibitor of GSH and GSH peroxidase showed smaller effects． Fhe assay of alkalinized HI)exhibited the strongest resistance to all these chemicals．Conclusion：The assay of alkalin— ized Hb shows the strongest resistance t()common chemicals used to investigate the mechanism of peroxidative damage and can be ap— plicable tO the study of the mechanism of vitamin C—induced hemolysis． 【Key words】Hemoglobin a．'Ksay；Vitamin c；Antioxidation system；Alkalinized hemoglobin；Hemolysis 维生素 C(VC)是经典抗氧化剂。通常认为大 剂量 VC没有毒性。但高浓度 VC离体 可促疲 劳⋯1，在体可造成 6一磷酸葡萄糖脱氧酶缺乏患者 急性溶血l2,3 J。已证实 VC和血红蛋[LI(Hb)等含铁 复合物的相互作用町使其成为促氧化剂l4， 。红细 胞富含 Hb，故大剂量 VC在体内可能有氧化溶血毒 性。测定溶血最简单而可靠的指标是血红蛋白的释 放。抗氧化体系干预物质常用于考察溶血机制l6一。 但这类干预物质和高浓度 VC对常用 Hb测定方法 有无干扰几乎没有报道。本文比较抗氧化体系干预 物质和VC对测定 Hb的干扰，为考察高浓度 VC可 能具有的诱发溶血作用和其机制奠定基础。 作者介绍：程朝英(1955一 )女，副主任医师， 主要研 究方向：药物性肝脏疾病．． 基金项目：重庆市教委高校首批优秀中青年骨干教师(廖飞)和重庆 市科委应用基础项目(2002—7305)。 1 材料和方法 1．1 试剂和材料 二乙基■硫代氨基 甲酸钠 (D『 )、N，N一二 (B一氯已 基)一N’一硝基脲 (Carmustine，( )、氨基三唑 (ATA)、碘 乙酰胺(IAA)等购 自sigma。其余试剂为国产纯。重蒸 水 。 1．2 方法 1．2．1 红细胞和血红蛋白的制备 健康家兔颈动脉取血， 生理盐水洗，TGL 80—2离心机 2000r／min离心 5mln洗 4 次得压积红细胞。压积红细胞按 1：4体积比用双蒸水稀释， 加0．1％的NP一40，漩涡振荡 10min，超声破碎 30min，412放 置 24h后 3000r／min离心 20min，取上层清液4℃储存备用。 1．2．2 血红蛋 白(Hb)测定方法 Hb吸 收直接 测定 法 (As40)：生理 盐水 lml加 0．20ml样 品，反应 10min测定 540nm吸收。碱化血红蛋白法(A575)【’]：0．12mol／L NaOH 1．0ml加 0．2ml样品，反应 10min后测 575rml吸收。叠氮高 维普资讯 http://www.cqvip.com 一 592 一 重庆医科大学学报 2005年第 3O卷第 4期 (Journal of Chongqing Medical University 2005．Vol 30 No 4) 铁血红蛋白法( )l ：试剂照文献。显色原液棕色瓶 4C 储存 ，用水以 1：9稀释后为测定液。1ml测定液加 200ttl样 品混匀，lOmin后测定 542nm吸收。其改进为测定液中叠氮 钠浓度增加 1倍 、铁氰化钾浓度增加 8倍 ，其余不变。 1．3 统计学分析 结果为均值 ±差( ± )。用 SAS 8．2作统计分 析，用 t检验比较均值，F检验比较标准差。 2 结 果 2．1 VC对不同方法测定 Hb的影响 测定碱化血红蛋白对VC抵抗性最强，5．0mn~l／L 的VC也无明显影响。VC浓度依赖性地降低血红 蛋白在 540nm的吸收。VC低于 0．050mmol／L对 测定叠氮高铁血红蛋白无十扰；但高浓度 VC造成 正干扰，10、0mmol／L,VC时反应体系出现沉淀。增 加叠氮离子和铁氰化钾可使 0．50mmol／L以下 VC 无干扰，但降低了灵敏度，且仍无法消除高浓度 VC 的干扰。 2．2 常见抗氧化干预物质的影响 超氧化物歧化酶抑制剂 (DDC)、封闭巯基的碘 已酰胺(IAA)、谷光甘肽还原酶抑制剂 (CAR)、过氧 化氢酶抑制剂氨基三唑(衄 )在常用有效浓度下对测 定碱化血红蛋白都无干扰。DDC对测定叠氮高铁血红 蛋白有明显正干扰，且增加高铁氰化钾浓度则更易出 现沉淀。但 可拮抗 VC造成的 Hb吸收降低。 IAA对直接测定Hb吸收无明显干扰，但使 VC造成的 叠氮高铁血红蛋白测定正干扰更显著。相对而言， CAR和ATA对常用方法测定 Hb的干扰最弱，与 VC 对测定Hb的干扰也无交叉影响。 4()表示直接测定 Hb吸收，A575表示测定碱化 Hb，A542表示测定叠氮 Hb。抑制剂终浓度分别为 DDC 10．0mn~l／L，衄 4(knrml／L，CAR 10．0taml／L，IAA 0、20mmol／L。全部为 3次重复测定。 2．3 不同方法测定 Hb的响应曲线比较 直接测定 Hb吸收灵敏度最高。叠氮高铁血红 蛋白测定方法线性关系最好，灵敏度也高。相反，碱 化血红蛋白测定灵敏度最低。但在 VC和其它各种 干扰物质同时存在下，测定碱化血红蛋白响应曲线 的斜率和截距依然没有明显变化(表 2)。 表 1 vc和常见抑制剂对 Hb测定的干扰 P<0．05 versus that without 2 0 mmol／L VC，a P<0．05 versus that without the specified inhibitor(s)．b In the presence of DDC，IAA，ATA，CAR plus 2．0 mmol／L VC． 表 2 不同方法测定血红蛋白的响应曲线比较 (血红蛋白浓度 x 【)～27．8mg／m1)。 3 讨 论 测定体系含 2．0mmol／L VC，DIN；，Carmustine，ATA和 碘乙酰胺等：f：扰物质。有无干扰时测定碱化血红蛋白响应 曲线的截距和斜率都无差异(P>0．48)。r。为决定系数。 VC可还原血红蛋白为亚铁血红蛋白，降低其在 540nm吸收。增加铁氰化钾降低了低浓度 VC对测 定叠氮高铁血红蛋白的正干扰，却增加高浓度 VC 的正干扰，故 VC干扰可能来 自其还原性。SOD抑 制剂 DIN；对测定叠氮高铁血红蛋白的干扰也可能 来自其所含负二价硫的还原性。氨基三唑高浓度下 维普资讯 http://www.cqvip.com 重庆医科大学学报 2005年第30卷第4期 (Journal of Chongqing Medical University 2005 Vol 30№ 4) -—— 593 -—— 才有效。其 所』{j浓度 卜埘 VC造成的 Hb测定f 扰的改变机制 清。琉 封闭利干¨ 胱甘肽还原嗨 抑制剂所川浓度最低，化 ：反成活 H-弱，干扰也最 小。 总休Ifl ’i‘，只 r测定碱化血宝J：堡门才基本不受 VC和抗氧化体系 h颂物质的影响：其它常用测定 Hb方法都不寅用于考察离浓度 VC的促溶血作用 和机制。VC促溶I『ll_前较长作川时IhJ。乳酸脱氧酶 稳定性仃限，其释放不能- f谨反映溶 。因此，常 用方法【}】只仃测定碱化 红蛋门 丁¨考察高浓度 VC 的溶血fi-；tJ和机制。用此方法发现，内源性抗氧化 能力是高浓度 VC埘健康人红细胞没有毒副作用的 关键原l天】(待发表结果)。 (本文通讯作者：廖飞(重庆医科大学生物化学教研 室， 重庆 400016． Fel：86 23 —68485073，Fax：86 23 68485111．E mail liaofeMl(r』vip． iⅢ1．COIl1) 同 时 对本 校 2001级七年制学生李生兵和郭睿表示感谢 ) 参 考 文 献 [1] 廖 飞，郧荣梁，陈富裕．高浓度维生素 C抑制离体蟾 蜍腓肠肌收缩能力[J]．1f1吲 用生婵学杂志，2000；16(3)： 230—234 [2] Campbell G D，Steinberg M H，Pk)wer J D．Ascorbic acid induced homolysis in G一6一PI)deficiency[J]．Annals Intern Med，1975；82(6)：810． 3] 唐志浩 ，程琼俊，卢佳森，等．大剂最维生素 (：致葡萄糖 6 磷酸脱氰酶缺乏患者发生急性溶血 1例[J]．中华血液 学杂志 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作用。采用该心率变异分析软件埘纯心脏 vvI起 搏病人30rain心电信号分析 尔 ULF和 VLF均为 0，提示其有很好的准确性干¨有效性。 参 考 文 献 1 j Berntson( ，Bigger JT，Eckberg DL，et a1．HRV：Ori— gins，methods，and interpretive caveats[J]，Psychophysiology． 1997；34(6)：623 648． [2] 中国心血管病杂志编委会心率变异性对策专题组 ，心 率变异性 检测 临床应用 的建议 [J]，中华心血管病杂志， 1998；26(4)：252 255， [3] 陆再英，心率变异分析方法学的标准化及结果的正确 评价[J]，中围心脏起搏与心电生理杂志，1996；10(4)：222 224， [4] 陈运贞，雷 寒，谢 杨 ，等．检测心脏植物神经活性的 定量方法[J]中华心血管病杂志，1992；20(2)：101 103． 维普资讯 http://www.cqvip.com