枸杞多糖对_型糖尿病大鼠肾脏保护作用及其机制研究

营养学报 2006 年第 28 卷第 1期 47 枸杞多糖对Ⅱ型糖尿病大鼠肾脏保护作用 及其机制研究 孙桂菊，张 勇，黄 杰 1，王少康，孙子林 2，黄培林 3 （东南大学公共卫生学院营养与食品卫生系，1南京市卫生监督所，2东南大学附属中大医院内分泌科， 3东南大学基础医学院病理学与病理生理学系，南京 210009） 【摘 要】目的：观察枸杞多糖（LBP）对Ⅱ型糖尿病大鼠肾脏的保护作用及机制。方法：用链脲佐 菌素（STZ）结合高脂饲料建立Ⅱ型糖尿病大鼠模型，根据胰岛素敏感指数、糖耐量曲线下面积分为 模型组，LBP 低、中、高剂量组[20、40、80 mg/（kg bw∙d）]，同时设立正常对照及正常高剂量对照组， 试验期 1 个月。检测 LBP 对Ⅱ型糖尿病大鼠血清糖基化终产物-肽（AGEs-P）、糖基化血红蛋白（HbAlc） 及肾脏白介素-8 (IL-8)含量、肾脏病理变化的影响。结果：LBP 可降低Ⅱ型糖尿病模型大鼠血清 AGEs-P 及血浆 HbAlc 与肾脏中 IL-8 含量，肾脏病变明显改善。结论：LBP 可降低模型大鼠糖基化终产物的产 生，减少肾脏 IL-8 的分泌，从而预防糖尿病肾病的发生。[营养学报，2006，28（1）：47－50 ] 关键词：枸杞多糖；糖尿病肾病；糖基化终产物；白细胞介素-8 中图分类号：R587.1 文献标识码：A 文章编号：0512-7955(2006)01-0047-04 STUDY ON THE PROTECTIVE EFFECT OF LYCIUM BARBARUM POLYSACCHARIDES ON KIDNEY AND ITS MECHANISM IN TYPE Ⅱ DIABETIC RATS SUN Gui-ju，ZHANG Yong，HUANG Jie1，WANG Shao-kang，SUN Zi-lin2， HUANG Pei-lin3 (Department of Nutrition and Food Hygiene, School of Public Health, Southeast University; 1 Nanjing Health Inspection Bureau; 2 The Endocrine Section of Zhongda Hospital, Southeast University; 3 Department of Pathology and Pathophysiology, School of Basic Medical Science, Southease University, Nanjing 210009，China) 【Abstract】Objective： To study the protective effect of Lycium babarum polysaccharides (LBP) on kidney in type Ⅱ diabetic rats and its mechanism . Method：The animal model of type Ⅱ diabetes was established by injecting streptozotocin combined with feeding high-lipid ration to SD rats. According to serum insulin , the insulin sensitivity index (ISI) and the area under the curve of glucose tolerance, the model rats were divided into four groups, including model group, LBP low , medium and high dose groups [20, 40, 80 mg/(kg bw·d)]. At the same time, normal control group and normal LBP high dose group were alloted. The levels of advanced glycosylation endproducts-peptide (AGEs-P) in serum, hemoglobin A1c (HbA1c) in plasma, and interleukin-8 (IL-8) in renal cortex were detected after given LBP for 1 month. The histopathological picture of kidney was also observed. Results： Serum AGEs level, plasma HbA1c level and IL-8 secretion after given LBP in diabetic rats were reduced, and the kidney lesion was ameliorated. Conclusion： LBP can prevent diabetic nephropathy by reducing AGEs and the secretion of IL-8 in kidney of typeⅡ diabetic rats. [ACTA NUTRIMENTA SINICA, 2006, 28(1): 47－50] Key words ： Lycium barbarum polysaccharide (LBP) ； diabetic nephropathy ； advanced glycosylation endproducts-peptide (AGEs-P)；interleukin-8 (IL-8) 收稿日期：2005-06-02 基金项目：南京市科技局社会发展基金(No. 200301093-2) 作者简介：孙桂菊（1963-），女，教授，博士，E-mail: gjsun@seu.edu.cn；jsun06@hotmail.com 48 Acta Nutrimenta Sinica, Feb., 2006, Vol.28 No.2 糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖 尿病慢性血管并发症之一，其发生机制尚无定论， 目前研究较多的是组织非酶糖基化终产物 (advanced glycosylation endproducts,AGEs)蓄 积[1]、醛糖还原酶（aldose reductase，AR）活性 改变[2]等。近年来又发现 IL-8 与 DN 发病有关[3]。 枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharides，LBP） 是枸杞子有效成分之一。我们曾报道 LBP 具有降血 糖作用，并可提高模型大鼠的胰岛素敏感指数 （ISI）。本研究主要观察 LBP 对Ⅱ型糖尿病大鼠肾 脏保护作用及其机制。 1 材 料 与 方 法 1.1 样品 LBP 按相关文献[5]进行提取。 1.2 主要试剂、仪器 链脲佐菌素（streptozotocin，STZ），Sigma 公司产品；DNA自动扩增仪，Techne Incorporated； EPS 604 稳压稳流电泳仪，南京科宝仪器研究所； 岛津-10A 高效液相色谱仪，日本岛津公司；IS-1001 凝 胶成像系统 , 上海复日科技有限公司。 1.3 Ⅱ型糖尿病大鼠模型的建立 据文献[4]建立Ⅱ型糖尿病动物模型，其条件为： （1）胰岛素敏感指数 ISI=ln[1/(空腹血糖值×血清 胰岛素水平)]，ISI≤正常大鼠 ISI 的均值减 1个标 准差；（2）葡萄糖耐量实验曲线下面积≥26；（3） 空腹胰岛素不小于正常大鼠的均值减一个标准差。 1.4 动物分组 将糖尿病模型大鼠随机分为 4组，分别为模型 组(model)，继续给予高脂饲料，灌胃蒸馏水；LBP 低、中、高剂量组，在给予高脂饲料的同时灌胃给 予 LBP 20、40、80 mg/kg bw。同时设正常对照组 和正常 LBP 高剂量组，喂普通饲料，后者灌胃给予 LBP 80 mg/kg bw。持续灌胃 1个月后，动物断尾取 血测定 HbAlc、血清 AGEs-P 含量，处死后取肾脏进 行病理学检查和用免疫组化及逆转录聚合酶链式反 应(RT-PCR)进行肾脏 IL-8 mRNA 含量测定。 1.5 指标测定 1.5.1 大鼠肾脏 IL-8 含量的测定：免疫组化法：试 剂盒购自福州迈新生物制剂公司，操作步骤按试剂 盒说明书进行。大鼠肾脏组织 50～100 mg，用异丙 醇-乙醇一步法离心提取 RNA，使用晶美生物工程公 司的试剂盒，采用RT-PCR技术对肾脏组织中的mRNA 进行逆转录扩增，以β-actin 作为内参对照，PCR 反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，在图像扫描仪下观 察并扫描入电脑，用统计软件处理，得出目的条带 与内参照条带的光密度比值。 1.5.2 血清 AGEs-P 的测定：流动注射分析法[6]。 1.5.3 血浆 HbAlc 的测定： 采用德国拜耳公司的 DCA 2000 型糖化血红蛋白分析仪测定。 1.6 统计方法 数据以 x ±s表示，采用 SAS 6.12 统计软件对 数据进行统计分析。 2 结 果 2.1 LBP 对血清 AGEs 和 HbAlc 含量的影响（表 1） Table 1 The effect of LBP on AGEs level in serum and HbAlc level in plasma in type Ⅱdiabetic rats（ x ± s） Group LBP (mg/ kg·bw) n HbAlc in Plasma (％) AGEs-P in serum (µg/ml) Model 7 7.7±1.3 5.22±0.80 Low LBP 20 8 6.3±1.3b 3.07±0.45a Med LBP 40 7 5.8±1.1b 3.01±0.84a High LBP 80 8 5.2±0.9b 2.73±0.84a NH 80 7 3.8±0.9a 2.84±0.80a NC 0 10 3.8±0.7a 2.87±0.56a Low=low dose，Med=medium dose，High=high dose，NH=high dose of LBP in normol，NC=normal control；△F=15.89,P<0.001；#F=12.69， P<0.001；a：compared with the model group (P<0.05) b：compared with the model group and the normal group (P<0.05) , the same in below LBP 低、中、高剂量组 HbAlc 水平明显低于模 型组，但仍高于正常对照组，差异有显著性（P＜ 0.05）。各实验组大鼠血清中 AGE-P 的水平，模型对 照组，显著高于其它各组（F =12.69，P＜0.05）。 2.2 LBP 对肾脏病理学改变的影响（图 1A-E） 、 A B 营养学报 2006 年第 28 卷第 1期 49 A：normal control；B：model；C：LBP low dose group D ：LBP medium dose group；E：LBP high dose group Fig. 1 The histopathological observation of kidney under microscope (HE staining) 实验结束时模型组光镜下可见肾小球明显增 大，肾小球毛细血管基底膜弥漫性增厚、系膜区增 宽，近端肾小管上皮细胞呈现大量空泡变性。LBP 低、中、高剂量组与模型组相比，肾小球系膜区增 宽、基底膜增厚均较轻，肾小管空泡变性较少。 2.3 LBP 对模型大鼠肾脏 IL-8 含量影响（图 2 A-E） A：normal control；B：model；C：LBP low dose group； D：LBP medium dose group；E：LBP high dose group Fig. 2 The histopathological observation of kidney under microscope (immune histochemistry staining) 2.3.1 免疫组化法检测：模型组的肾小球基底膜和 内皮细胞的胞浆中有 IL-8 免疫阳性物质沉积，LBPg 各剂量组的免疫阳性物质沉积率明显降低，肾小球 基底膜上的显色降低，正常对照组不显色。 2.3.2 RT-PCR：实验结束时 LBP 各剂量组肾脏皮质 IL-8 mRNA 含量明显低于模型组，差异显著(P＜ 0.05)，低、中剂量组仍高于正常对照组(P＜0.05)， 而高剂量组与正常对照组比，差异不显著(P＞0.05， 图 3，表 2)。 3 讨 论 DN 是糖尿病特别是非胰岛素依赖型糖尿病的 严重并发症之一。AGEs 是由蛋白质的游离氨基端与 还原糖(如葡萄糖)经过一系列非酶促反应形成的结 构多样的不可逆聚合物，研究发现小分子糖基化终 产物-肽(AGE-P)可与靶组织或蛋白(如胶原、低密度 脂蛋白)再次共价联结形成第二代 AGEs，从而在糖 尿病、尿毒症等慢性血管并发症中发挥更重要的作 用[7]。肾脏对小分子 AGEs-P 清除能力下降可明显 B C E A C D E D E B 50 Acta Nutrimenta Sinica, Feb., 2006, Vol.28 No.2 加重糖尿病患者血管病变的发生和程度[8]。糖尿病 人血清 AGEs 水平明显高于正常人，动物实验或临 床试验证明，运用 AGEs 抑制剂-氨基胍等可预防或 延缓 DN 等并发症的发生[9，10]。另外 Tashiro 等[11] 报道 DN 患者尿中 IL-8 含量明显升高，可通过尿中 IL-8 含量评估 DN 病人肾脏受损程度。IL-8 分泌上 调可使肾小管上皮细胞和间质细胞向肌纤维母细 胞的表型转化，基质产生增多，加速肾小管间质病 变病理过程。 1 2 3 4 5 6 7 1 and 7. molecular weight marker; 2.LBP high dose group; 3.LBP medium dose group; 4. LBP low dose group; 5.diabetic model group; 6.normal group Fig. 3 The comparison of IL-8 mRNA expression in the renal cortex Table 2 The effect of LBP on IL-8mRNA expression in the renal cortex Group n LBP Supplement (mg/kg bw) IL-8mRNA RT-PCR electrophoresis△ （gray scale） Model 7 － 0.80±0.22 Low LBP 8 20 0.52±0.18 Med LBP 7 40 0.41±0.12a High LBP 8 80 0.29±0.04a High in normal rats 7 80 0.23±0.03a NC 10 0 0.24±0.05a △F=78.42，P<0.0001，a：Dunnett’s T-test， compared with the model group (P<0.05) 本研究表明，各实验组大鼠血清中 AGEs-P 以 模型对照组最高，与我们以往报道的相同[12]，也与 孙子林等[1]的结果一致。LBP 各剂量组大鼠血清 AGEs-P与肾脏 IL-8含量均明显低于模型对照组(P ＜0.05)，说明 LBP 可降低糖尿病大鼠糖基化终产 物的产生，进而降低体内 IL-8 的分泌，从而减轻 糖尿病所引起的肾脏损害，从肾脏病理组织学的改 变也可得到证实。故 LBP 作为降血糖，预防 DN 的 保健食品与药品具有广阔的开发前景。 [参 考 文 献] [1] 孙子林，刘乃丰，孙桂菊，等. 糖尿病小鼠血清糖基 化终产物水平增高[J]．中国糖尿病杂志，2000，8： 315－316. [2] 冯玛莉，贾力莉，武玉鹏，等. 夏枯草醇提物对实验 性糖尿病肾脏病变的作用[J]．山西中医学院学报， 2000，1：7－10. [3] 付搏，陈香美. 细胞因子与肾脏疾病[J]. 中华医学杂 志，1998,12：1－18. [4] 张勇，孙桂菊，孙子林，等. 枸杞多糖降血糖及预防 糖尿病肾病作用的实验研究[J].江苏医药，2003，29： 157－160. 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