ROS指标在保健食品抗氧化功能检测中的应用及灵敏性比较

1772 堡 亟堕医堂 堡笫33卷第1O期 Modem Preventive Medkine，2006，v。1．33．No．1O ROS指标在保健食品抗氧化功能 检测中的应用及灵敏性比较 李文立，杨杏芬，黄俊明，谭剑斌 【论著】 [摘 要] 目的：将ROS指标应用于保健食品抗氧化功能检测中，并进行敏感性比较。方法：SPF级昆明种雄性小 鼠，12月龄，按体重随机分为老龄组对照组、大豆异黄酮低、中、高剂量组 (分别为0．08 g／kg BW、0．17 g／kg BW、0．50 g／kg BW)，每组 10只动物。连续灌胃给予受试物42 d后，断头处死动物，取肝脏。以胶原酶和胰蛋白酶联合酶解肝组织， 制备肝组织单细胞悬液；以流式细胞术测定肝细胞ROS水平；同时制备肝组织匀浆，以分光光度法测定肝细胞 MDA含量 及SOD、GSH—Px活性。结果：流式仪直方图分析显示，随着受试物给予剂量的增加，各剂量组肝细胞 ROS水平均明显 降低 (P<0．05)；低、高剂量组肝细胞内 MDA含量明显减少 (P<0．05)，中、高剂量组 GSH—Px活性明显增加 (P< 0．05)，高剂量组 ,SOD活性亦明显增加 (P<0．05)；其余剂量组各指标差异无统计学意义 (P>0．05)。结论：大豆异黄酮 通过降低肝细胞自由基水平而起到抗氧化作用，以FCM检测肝细胞ROS水平可更好地对保健食品的抗氧化功能进行筛选 与。 [关键词] 大豆异黄酮；流式细胞术；活性氧；MDA；SOD；GSH—Px [中图分类号]R155．5 [文献标识码]A [文章编号]1003—8507(2006)10—1772—03 APPLICATION AND SENSI 兀VE COMPARISION OF ROS INDEX ON ANrlOX1DArrION EVALUATION OF HYGIENE 00D． LI Wen-li，YANG Xing-fen，HUANG Jun．ruing，et a1．C~lter fo,‘llhsease Control and Prev~ztion ofGuangdong Provime， Guangzhou，510300． Abstract：Objective：To apply ROS index in the antioxidation evaluation of hygiene foM，and compare its sensitivity with oth- er induces．Methods：12一month KM male mice of SPF were randomly grouped into aging controlled group and low，middle，high soy isoflavones groups(0．00 mg／kg b．w、0．08 rng／kg b．w、0．17 mgAg b．w、0．50 mg／kg b．w separately)．Each group had ten mice．After being given the sample for 42 days．hepatocytes’ROS was nleasured by FC through staining hepatocytes with IX2FH～DA，and MDA content，SO1)activity，GSH—Px activity were measured by spectrophotometry．Results：Hitogram anal— ysis of FC showed that hepatocytes’ROS level in each dose group d~reased sigmifieantly(P<0．05)，MDA content in the low and high dose group d~reased(P<0．05)，the activity of GSH—Px in the middle and high group increased (P<0．05)，the activity of SO D in the high group increased(P<0．05)，But the index in the rest groups has no significant change(P>0．05)．Conclu- sion：Soy isoflavones had the effect of antioxidation by decreasing free radical level， hepatocytes’ROS level measured by FC could better appraise the antioxidation system of hygiene food． Key words：Soy isoflavones；Flow cytometry；ROS；MDA：SO D；GSH—Px 随着对机体内过氧化自由基与健康、疾病关系认识的 发展，人们对具有抗氧化功能保健食品的需求不断增长。 通过快速、可靠评价体系的建立，以对具有抗氧化功能的 保健食品进行筛选与评价，是促进我国保健食品j干发与生 产，保证人群健康的重要手段。目前，我国对保健食品抗 氧化功能筛选与评价的标准是 《保健食品检验与评价技术 [基金项 目]广东省重点医学科技攻关课题 (粤卫 [2003]246 号)：广东省医学科学技术研究基金 (A2002087)。 [作者单位]J 东省疚病预防控制rlIJ ，J 州。510300 [作者简介]李文立 (1967--)，女。硕士，副主任医师，主要工作 方向：健康卡“关产品，毒理学及功能学评价． 规范》(卫生部2003年版)中 “抗氧化功能检验方法”，检 测指标为机体组织或血液中的过氧化脂质水平，常以过氧 化脂质降解产物丙二醛 (MDA)含量及超氧货物歧化酶 (SO D)、谷胱甘肽过氧化物 (( SH—Px)活性示⋯。该 评价 的评价指标及方法在促进保健食品业的健康发展上具 有积极的意义。但是，随着 自由基理论及检测技术的发展， 如何选择更为灵敏、快速、可靠的评价指标及评价方法来 建立更为科学的评价体系，已成 为保健食品可持续发展的 重要基础。 本研究在 目前 自由基理论发展的基础上，采用灵敏的 荧光探针技术，利用荧光探针 2’，7’一二氯双氢荧光素 维普资讯 http://www.cqvip.com 现代预防医学2006年第 33卷第 10期 Moderll Preventive Medieine，2006，Vo1．33，No．10 (2’，7’一dichlorofluorescin diacetate，I3CFH—DA)进入细 胞后 ，经过一定反应变化可发射荧光的特性，以近年来广 为应用及发展的流式细胞术 (Flow cytometry，FCM)，检 测实验 动物肝细胞 内活性氧 (ROS)水平，并与卫生部 “抗氧化功能检验方法”技术规范中以肝细胞内MDA含量 和 SOD、GSH—Px活性来反应机体 自由基水平的方法进行 比较，从而建立更为可靠、灵敏并适用于保健食品抗氧化 功能筛选与评价的实验指标和方法。 1 材料和方法 1．1 实验材料 1．1．1 实验试 剂：胰 蛋 白酶 (AInresco产 品)，胶原 酶 (Sigma产品)，2’，7’一二氯双氢荧光素 (Cayman chemi一 产品)，RPMII640培养基 (GIBCO产品)，EDTA(分 析纯，AR级，上海生化试剂厂生产)，中山医科大学分子 生物学试剂部提供；总蛋白测定生化试剂，日本和光纯药 工业珠式会社产品，广州市科盈科技有限公司提供；新生 小牛血清 (四季青生物材料有限公司产品)，广州展晨 生物科技公司提供；MDA、SOD、GSH—Px检测试剂盒， 南京建成生物工程所提供。 1．1．2 实验受试物：大豆异黄酮，批号040524，深圳索芙 特公司提供。 1．1．3 实验动物：SPF级昆明种雄性小鼠，12月龄，第一 军医大学实验动物中心提供，动物合格证号：粤检证字 2003A061，颗粒饲料由第一军医大学实验动物中心提供。 1．1．4 动物实验室：SPF级，使用许可证号 SYXK (粤) 2003—0011，室温 (22±2)℃；湿度 60％～80％。 1．1．5 实验仪器：美国 BD公司流式细胞仪 删 ibur、 日立 7600自动生化仪、SHELLAB co2培养箱、SHELLAB 恒温水浴箱。 1．2 实验方法 1．2．1 实验分组⋯：实验小鼠均按体重随机分为老龄对照 组、大豆异黄酮低、中、高剂量组 (分别为0。08 g／kgBW、 0．17 g／kg BW、0．50 g／kg BW)，每组 l0只动物。剂量组 1773 每日灌胃给予受试物，老龄对照组每日灌胃给予相应体积 的纯净水 ，灌胃量为 0．2 ml／10 g b．w。连续给予 42 d后， 断头处死动物，取肝脏，进行指标检测。 1．2．2 肝组织单细胞悬液制备【 J：取肝组织，D—Hank’s 液清洗，无菌手术刀切成约 l删112大小组织块，含0．5％ EDTA的 D—Hank’S液清洗两遍后，以 0．1％胶原酶和 0．5％胰蛋白酶37℃条件下联合酶解40 m{n，400目丝网过 筛，600 r／rain离心 5 min，去上清，PBS清洗两遍后，含 l0％小牛血清RPMII640制备成浓度为5×i05 cells／ml的单 细胞悬液。 1．2．3 肝细胞 ROS水平的检测_3 J：以终浓度 i0 umol／L EGFH—DA与肝细胞避光孵育 30 min后，流式细胞仪二维 散点图上，根据肝细胞前角散色光 (forward light scatter， FSC)及侧向散色光 (side light scatter，SSC)强度，选定 实验细胞群；流式仪直方图分析 2’，7’一二氯荧光素 (2’，7’ 一dichlorofluorescin，DCF)的 平 均 荧 光 强 度 (mean fluorescence intensity，MFI)。流式仪氩激光激发波长 为488 nrn。 1．2．4 肝细胞总蛋白含量、MDA含量和 SO D、GSH—Px 活性的检测 制备肝组织匀浆后，以日立7600自动生化仪 进行肝细胞总蛋白含量测定；以分光光度法进行 MDA含量 (TBA法)、SOD活性 (黄嘌呤氧化酶法)、GSH—Px活性 (DTNB法)的测定。具体操作方法均按试剂盒使用说明书 进行。 1．3 统计学方法 采用CELL Quest软件及 SPSS 11．0统 计软件中单向方差分析 (ANOvA)方法进行分析。 2 结果 2．1 大豆异黄酮对实验小鼠肝细胞 R06水平影响的流式 细胞术分析 流式义直方图分析可见 (图1)，随着大豆异 黄酮给予剂量的增加，DCF荧光强度峰值呈左移趋势，各 剂量组ROS的MFI值低于老龄对照组，表明大豆异黄酮具 有降低肝细胞内ROS水平的作用。 老龄对照组 0．08g／kg BW N~．tff 0．17g／kg BW剂量组 0．50g／kg BW剂量组 图 1 大豆异黄酮对实验动物肝细胞 ROS影响的流式细胞术分析 2．2 不同机体自由基水平检测指标灵敏性的比较 大豆异 黄酮低、中、高剂量组 ROS水平均明显低于老龄对照组， 差异均有统计学意义 (P<0．05)；大豆异黄酮可明显减少 低、高剂量组肝细胞内MDA含量 (P<0．05)，增加中、 维普资讯 http://www.cqvip.com 1774 现代预防医学2006年第33卷第 10期 Modem Preventive Medicine，2oo6，、 1．33，No．10 高剂量组GSH—P)【活性 (P()．05)。表明在反 映肝细胞自由基水平方面，ROS指标较 MDA、SOD、GSH — Px指标具有更好的灵敏性，见表 l。 表 l 受试物对实验小鼠肝细胞 ROS水平、MDA含量及 90D、GSH—Px活性的影响 注：与对照组比较， P<0．05，一 表示 P<0．叭 3 讨论 生物体内的自由基是指含有一个或多个未配对电子的 任何分子或离子，主要为活性氧族，包括超氧阴离子 (02一·)、羟自由基 (OH·)、氢过氧货物 (H202等)、单线 态氧等。自由基理论是保健食品抗氧化功能筛选与评价的 理论基础，MDA含量及 SOD、GSH—PX活性是保健食品 抗氧化功能筛选与评价的公认指标。MDA为机体细胞内因 自由基水平升高而导致的生物膜发生脂质过氧化的产物； SOD、GSH—Px是机体内重要的酶性抗氧化系统，SOD的 唯一生理功能是歧化超氧阴离子 (02一·)，而 GSH—Px通 过特异催化谷胱甘肽对过氧化物的还原反应，阻断脂质过 氧化的连锁反应l4j。因此，这3个指标均为反映机体自由 基水平较为间接的指标。 目前，检测机体自由基水平的方法主要有分光光度法、 化学发光法、电子自旋共振法、激光扫描共聚焦显微镜法 等。分光光度法因所用检测设备经济、方便而成为普遍应 用的一种检测方法，但需对细胞进行破碎处理，重复性差 ； 化学发光法对细胞新生成的ROS无法进行检测；电子自旋 共振法、激光扫描共聚焦显微镜法可直接检测细胞内ROS 水平，但对样本的制备要求高，同时设备昂贵，操作复 杂【6 J。流式细胞术是近年来迅速发展的一种现代细胞分析 技术 ，它在单细胞水平上检测 ROS水平 ，结果稳定可靠， 重复性好，是一种较为直观、方便、快速的检测方法【6j。 流式细胞术检测 ROS的关键在于选择正确的 ROS捕获剂。 DCFH—DA为新一代ROS捕获剂，可迅速通过细胞膜 进入细胞，在细胞内酯酶作用下脱去二脂生成不发荧光的 2’，7’一二氯双氢荧光素 (2’，7’一dichlorofluorescin， DCFH)，当细胞内存在 H202、02一、OH·等 ROS时，即 被氧化成发荧光的 DC 引，通过流式细胞仪测定细胞内 DCF的荧光强度，即可对单个细胞为基础的细胞内ROS进 行原位实时检测，从而根据荧光强度直接反映细胞内自由 基的变化程度【引。本研究表明，以肝细胞 ROS评价大豆异 黄酮的抗氧化功能时，实验各剂量组与老龄对照组比较差 异均有统计学意义 (P<0．05)，而以肝细胞 MDA含量和 SOD、GSH—Px活性为评价指标时，则低剂量组 SOD、 GSH—Px活性和中剂量组 MDA含量、SOD活性与老龄对 照组未检出统计学差异 (P>O．05)。可见，通过较为直接、 灵敏反映自由基水平的ROS指标的检测，可更好地对保健 食品的抗氧化功能进行筛选与评价。 [参考文献] [1]中国卫生部．保健食品检验与评价技术规范 [S]．2003． [2]余日安，陈学敏．硒对镉诱导的在体大 鼠肝细胞 DNA损伤、 细胞凋亡和细胞增殖的影响 [J]．中华预防医学杂志．2004， 38(3)：155—158． [3]Shen H M，Ong C N，Shi C Y．Involvement of reactive oxygen species in aflatoxin BI—induced cell injury in culture rat hepato— cytes．Toxicology．1995，99(1—2)：115—120 [4]张桥．卫生毒理学基础 [M]．第 3版．北京：人民卫生出版 社。2000：58—63． [5]史桂英，高飞，石学耕，等．流式细胞术检测细胞内活性氧的 方法 [J]．上海第二医科大学学报，2001(2)：122—124 [6]myl~e O，Andersen JM，Ames H，et a1．Evaltmtion of the probes 2’．7’ 一diehlomfluorescin diacetate，luminal， and luei— genin as indieato~ of reactive species formation [J]．Biochem Plmmmco1．2003，65：1575—1582． [7]Rothe G，Valet G．flow cytometric analysis of respiratory burst activity in phagocytes with hydroethidine and 2’。 7’ 一 diehlo· mfluorescin[J]．J Leukoe Bio1．1990，47(5)：440—448． [8]HeYY，HaderDP．Uv～b—inducedformationof reactiveoxygen species and 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