蛋白质3-09

null蛋白质的性质和分离纯化蛋白质的性质和分离纯化肌红蛋白晶体 第一节 蛋白质的理化性质 一 蛋白质分子的大小和形状 第一节 蛋白质的理化性质 一 蛋白质分子的大小和形状 测分子量的方法： ★化学组成法测定最低分子量 ★SDS-PAGE法 ★凝胶过滤法 ★渗透压法 ★扩散系数法 ★沉降系数法和沉降平衡法null 葡聚糖凝胶过滤法蛋白质分子量 null SDS—PAGE （十二烷基硫酸钠—— 聚丙烯酰胺凝胶电泳）二 两性解离性质及等电点二 两性解离性质及等电点 当蛋白质溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电点 （isoelectric point，pI）。null★ 等电点 ★ 等离子点： 中性盐（Ca2+、Mg2+、Cl-、HPO42+）影响滴定曲线形状 和等电点。 盐离子浓度为0时的等电点称等离子点 ★ 等电点测定 溶解度法 聚焦电泳法三 蛋白质胶体性质三 蛋白质胶体性质 蛋白质分子直径在1-100nm之间，在水溶液中具有胶体溶液的 性质（布朗运动，丁达耳现象，不能通过半透膜）。    稳定蛋白质胶体溶液的主要因素 ① 蛋白质表面极性基团形成的水化膜 ② 非等电状态时，同种电荷的互相排斥。 ③ 质点大小在1-100nm，可以进行布郎运动四 蛋白质的沉淀四 蛋白质的沉淀 如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层（消除相同电荷，除去水膜），蛋白质胶体溶液就不再稳定并将产生沉淀。 null 选择性沉淀蛋白质的方法 ① 盐析法: 大量的中性盐[（NH4）2SO4、Na2SO4、NaCl] 使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。 ② 有机溶剂沉淀法： 破坏水化膜，降低介电常数，PEG、丙酮、乙醇等 ③ 重金属盐沉淀：pH＞pI时带负电荷，与重金属离子（Hg2+. Pb2+. Cu2+ 等）结成不溶性沉淀 ④ 生物碱试剂和某些酸类沉淀法：pH小于等电时，蛋白质带正电荷， 易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。 生物碱试剂：单宁酸、苦味酸、钨酸。 酸类：三氯乙酸、磺基水杨酸。 ⑤ 加热变性沉淀。 ⑥ 等电点沉淀法null蛋白质受到某些理化因素的作用，其高级结构受到破坏、生物活性随之丧失的现象称为变性（ denaturation ）。 蛋白质变性以后，其理化性质发生一系列的变化。这些变化可以作为检测蛋白质变性的指标。 主要的变化包括：（1）溶解度降低。（2）粘度增加。（3）生物活性丧失。（4）更容易被水解。（5）结晶行为发生变化。 应用：变性灭菌、消毒；变性制食品；抗衰老…… 五 蛋白质的变性与复性null变性的因素：  强酸和强碱；  有机溶剂：破坏疏水作用；  去污剂：去污剂都是两亲分子，破坏疏水作用；  还原性试剂：尿素、-硫基乙醇；  盐浓度：盐析、盐溶；  重金属离子：Hg2+、pb2+，能与-SH或带电基团反应。  温度；  机械力：如搅拌和研磨中的气泡。null 变性的实质： 次级键（有时包括二硫键）被破坏，天然构象解体。 变性不涉及一级结构的破坏 可逆变性与不可逆变性 ★制备活性蛋白质时严防蛋白质变性。蛋白质的复性蛋白质的复性●蛋白质的变性作用如果不过于剧烈，则是一种可逆过程，变性蛋白质通常在除去变性因素后，可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复原有的理化性质和生物活性，这种现象成为复性（renaturation）。六 蛋白质的紫外吸收特性六 蛋白质的紫外吸收特性 蛋白质在远紫外光区（200-230nm）有较大的吸收，在280nm有一特征吸收峰，可利用这一特性对蛋白质进行定性定量鉴定。测定范围：0.1～0.5mg/ml七 蛋白质的水解 七 蛋白质的水解 蛋白质在强酸、强碱或蛋白酶的催化下均能够发生水解。 强酸：会破坏几种氨基酸，特别是Trp几乎全部被破坏，其次是三种羟基氨基酸。另外Gln和Asn在酸性条件下，容易水解成Glu和Asp。 强碱：会导致多数氨基酸遭到不同程度的破坏，并且产生消旋现象，但不会破坏Trp。 酶水解：效率高、不产生消旋作用，也不破坏氨基酸，但由于不同的蛋白酶对肽键特异性不一样，因此，由一种酶水解获得的通常是蛋白质的部分水解产物。null四种羧肽酶来源和特异性null几种蛋白酶特异性的比较null八 蛋白质的各种颜色反应第二节 蛋白质的分离，纯化和鉴定 一 蛋白质分离纯化的一般原则 第二节 蛋白质的分离，纯化和鉴定 一 蛋白质分离纯化的一般原则 纯化的实质： 增加制品(preparation)的纯度或比活性 null 二 准备工作 要解决三个问题： 1 纯化蛋白质的目的； 2 目标蛋白的测活方法； 3 纯化蛋白质的原料。null 三 蛋白质纯化的设计 1 破碎细胞或组织（混合和匀浆）， 2 去除残渣（离心）； 3 沉淀/浓缩（硫酸铵或聚乙二醇….）； 4 纯化（层析…..）； 5 保存和鉴定nullnull 四 注意事项 1 尽可能在低温操作 2 浓度不要太稀 3 合适的pH 4 使用蛋白酶抑制剂，防止目标蛋白降解 5 避免反复冻融和剧烈搅动，防止蛋白变性 6 缓冲液成分尽量模拟细胞内环境 7 加DTT（或β－巯基乙醇），防氧化。 　8 加EDTA金属螯合剂,防重金属对蛋白的破坏。　 9 用灭菌溶液，防微生物污染。 　　null 五 蛋白质纯化常用技术方法 沉淀 离心 层析 透析和超滤 电泳 保存null 1 沉淀法 （NH4）2SO4分级沉淀法（盐析） 等电点选择性沉淀法 有机溶剂分级沉淀法 热处理选择性沉淀法 生物碱或三氯乙酸选择性沉淀法 PEG沉淀法 热处理沉淀法（铜锌SOD，65℃、15分钟、稳定） null蛋白质的盐溶与盐析 盐溶：低盐浓度时，蛋白质溶解度↑，称盐溶。 盐析：高盐浓度时，使pr溶解度↓析出，称盐析。 盐析多用溶解度大的中性盐，如(NH4)2SO4、NaCl、MgCl2、NH4Cl、 KCl等的饱和溶液离心机结构示意图离心机结构示意图转头转头腔沉降样品驱动马达真空冷冻2 离心法 沉降系数 （sedimentation coefficient） 沉降系数 （sedimentation coefficient） 生物大分子在单位离心力场作用下的沉降速度称为沉降系数。即沉降系数是微颗粒在离心力场的作用下，从静止状态到达极限速度所需要的时间。 沉降系数单位：由于蛋白质、核酸、病毒等的沉降系数介于1×10-13到500×10-13秒的范围，为方便起见，把1×10-13作为沉降系数的一个单位，用Svedberg单位，用即S表示。null沉降的速度与颗粒的重量、密度和形状有关。离心后按其沉降的速度不同，彼此分开形成区带。再进行光学定位，针刺或冰冻切片采样分析蔗糖密度梯度离心 聚蔗糖密度梯度离心nullnull交联葡聚糖（Sephadex）; 聚丙烯酰胺凝胶 （Bio-Gel P ，） 琼脂糖凝胶（Sepharose，Bio-Gel A）3 层析 1） 凝胶过滤法层析nullnull交联葡聚糖（Sephadex）nullnull2） 离子交换层析法： 离子交换纤维素： 离子交换交联葡聚糖：兼有分子筛效应 离子交换交联琼脂糖：nullnullnull交联葡聚糖离子交换剂null3） 疏水层析 层析介质：苯基琼脂糖（phenyl-sephadex) 辛基琼脂糖(octa-sephadex) 洗脱： 低盐高PH 非离子型去污剂（triton x-100) 脂肪醇（丁醇、乙二醇）null4） 亲和层析 配基： 酶的底物、辅酶、抑制剂、效应物及其结构类似物，激素 与受体蛋白，抗原与抗体，生物素与亲和素（抗亲和素蛋 白），凝集素。 ◆ 免疫亲和层析 ◆ 凝集素亲和层析 ◆ 金属螯和层析 ◆ 染料配体层析nullnull半透膜阻留pr分子，而让小的溶质分子和水通过，以达到除去蛋白质溶液中小分子（盐、低分子酸等）。4 透析和超滤法null施以一定的压力使小分子溶质通过一半透膜，而按半透膜的筛孔大小截留相应的蛋白质分子null5 电泳和等电聚焦法： 普通电泳、等电聚焦、双向电泳、脉冲电泳、毛细管电泳 从电泳结果分：自由界面电泳、区带电泳、盘状电泳 从装置上分：圆盘电泳（柱状）、水平板电泳、垂直板电泳。 从支持物分：自由界面电泳、纸电泳（或薄膜电泳）、凝胶电 泳（PAGE ，琼脂糖胶，淀粉胶等）null等电聚焦null等电聚焦电泳法测定蛋白质pInull垂直平板电泳nullnullnull6 保存 保存方法： ① 晶体保存： 结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。能否结晶不仅 是纯度 的一个指标，也是判断制品是否有活性的指标。 纯度越高，溶液越浓，越容易结晶。 结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温度、盐析、 加有机溶剂、调节pH、接入晶种。 ② 冻干粉保存： ③ 溶液保存： 加入抗冻剂（50%甘油）后-20~-70℃保存。null 六 蛋白制品的含量分析、纯度鉴定与活性分析 （一） 含量分析 总蛋白含量分析： 凯氏定氮法、Folin-酚法（Lowry法）、双缩脲法、 考马斯亮蓝法、紫外吸收法 特定蛋白组分的含量分析： 酶和激素等：酶活性或激素活性表示（比活性） 其它蛋白：抗原抗体反应(western blot)nullMOV : MCB4.0 \ IMMUNOBLOTINGnull（二）纯度鉴定（均一性） 基本手段： ◆ 电泳分析：单条带。 ◆ N端测定：n亚基蛋白有1-n个N端aa。 选用手段：沉降分析、溶解度分析 结晶分析（能结晶的一般比较纯，具有活性） null其它鉴定工作： 1）分子量的测定 2）等电点测定 3）C-末端AA的测定（肼解法） 4）分子中糖链 ① 血球凝集反应； ② 糖蛋白电泳（甲苯胺兰、R山兰、schiff试剂）； ③ 糖组分分析（层析、液相色谱） 5）含脂成分 苏丹黑预染、电泳。 6）光吸收 全波长扫描。找出它的吸收峰位置和最大吸则。 7）AA组分分析null（三）活性分析