SNT 2754.14-2011 出口食品中致病菌环介导恒温扩增(LAMP)检测方法 第14部分：假结核耶尔森氏菌

书书 中华人民共和国出入境检验检疫行业 犛犖／犜２７５４．１４—２０１１ 出口食品中致病菌环介导 恒温扩增（犔犃犕犘）检测方法 第１４部分：假结核耶尔森氏菌 犔狅狅狆犿犲犱犻犪狋犲犱犻狊狅狋犺犲狉犿犪犾犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀犱犲狋犲犮狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱犳狅狉狆犪狋犺狅犵犲狀狊 犻狀犲狓狆狅狉狋犳狅狅犱—犘犪狉狋１４：犢犲狉狊犻狀犻犪狆狊犲狌犱狅狋狌犫犲狉犮狌犾狅狊犻狊 ２０１１０２２５发布 ２０１１０７０１实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局 发 布 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 书书书 前　　言 　　ＳＮ／Ｔ２７５４《出口食品中致病菌环介导恒温扩增（ＬＡＭＰ）检测方法》共分为１５个部分： ———第１部分：金黄色葡萄球菌； ———第２部分：大肠杆菌Ｏ１５７； ———第３部分：志贺氏菌； ———第４部分：单核细胞增生李斯特菌； ———第５部分：副溶血性弧菌； ———第６部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌； ———第７部分：空肠弯曲菌； ———第８部分：肺炎克雷伯氏菌； ———第９部分：溶血性链球菌； ———第１０部分：产气荚膜梭菌； ———第１１部分：产霍乱毒素的霍乱弧菌； ———第１２部分：溶藻弧菌； ———第１３部分：创伤弧菌； ———第１４部分：假结核耶尔森氏菌； ———第１５部分：阪崎肠杆菌。 本部分为ＳＮ／Ｔ２７５４的第１４部分。 本部分按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。 请注意本文件的某些可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫 局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国江门出入境检验检疫局、广州华峰生物科 技有限公司。 本部分主要起草人：郑文杰、张宏伟、张霞、刘伟、侯丽萍、王志强、蔡国瑞、张海英、李正义、孙慈惠、 易敏英、李志勇、曹以诚、高东微。 Ⅰ 犛犖／犜２７５４．１４—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 出口食品中致病菌环介导 恒温扩增（犔犃犕犘）检测方法 第１４部分：假结核耶尔森氏菌 １　范围 ＳＮ／Ｔ２７５４的本部分规定了检测出口食品中假结核耶尔森氏菌的环介导恒温核酸扩增 （ＬＡＭＰ）法。 本部分适用于出口食品中假结核耶尔森氏菌的筛选检测。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 ＧＢ／Ｔ４７８９．８　食品卫生微生物学检验　小肠结肠炎耶尔森氏菌检测方法 ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 ＧＢ１９４８９　实验室　生物安全通用要求 ＧＢ／Ｔ２７４０３　实验室质量控制规范　食品分子生物学检测 ３　生物安全措施 为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测假结核耶尔森氏菌，所有培养物和废弃 物应按照ＧＢ１９４８９中的有关规定执行。 ４　防污染措施 防止污染措施应符合ＧＢ／Ｔ２７４０３的规定。 ５　缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Ｂｅｔａｉｎｅ：甘氨酸三甲内盐 犅狊狋酶［犅狊狋ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ｌａｒｇｅｆｒａｇｍｅｎｔ）］：犅狊狋ＤＮＡ聚合酶（大片段） ＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）：脱氧核糖核酸 ｄＮＴＰ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）：脱氧核苷三磷酸 ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）：乙二胺四乙酸 ＬＡＭＰ（ｌｏｏｐｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）：环介导恒温核酸扩增 ＴｒｉｔｏｎＸ１００：聚乙二醇辛基苯基醚 １ 犛犖／犜２７５４．１４—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ６　技术概要 根据假结核耶尔森氏菌属特有的靶序列犻狀狏基因序列（参见附录Ａ）设计的内、外引物及环状引物 各一对，特异性识别靶序列上的八个独立区域，利用犅狊狋酶启动循环链置换反应，在犻狀狏基因序列启动 互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎环ＤＮＡ混合物；从ｄＮＴＰ 析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的 Ｍｇ２＋结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，加入显色 液，即可通过颜色变化观察判定结果。 ７　试剂和材料 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水的要求。 ７．１　引物：根据假结核耶尔森氏菌特有的靶序列犻狀狏基因序列设计一套特异性引物，包括外引物１，外 引物２和内引物１，内引物２及环状上游引物和环状下游引物。 外引物扩增片段长度：２３０ｂｐ。 外引物１（Ｆ３，５’３’）：ＣＴＣＧＴＣＧＣＧＴＧＡＴＴＴＣＴＴＣＣ 外引物２（Ｂ３，５’３’）：ＧＡＴＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＡＧＴＧＡＧＴ 内引物１（ＦＩＰ，５’３’）：ＣＣＡＧＴＴＧＴＧＧＧＡＧＴＧＣＡＧＧＴＡＡＣＴＡＴＡＡＡＧＡＧＣＧＣＣＣＡＧＣＣ 内引物２（ＢＩＰ，５’３’）：ＣＡＣＣＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＴＴＧＣＴＴＴＧＴＧＴＡＡＴＴＧＡＴＣＣＣＧＧＣＡＧＴ 环状上游引物（ＬＦ，５’３’）：ＣＡＴＴＣＧＣＧＣＧＣＡＡＡＴＣＣ 环状下游引物（ＬＢ，５’３’）：ＧＣＡＡＣＧＣＡＡＣＣＣＴＴＡＴＧＣ ７．２　犅狊狋ＤＮＡ聚合酶。 ７．３　ｄＮＴＰ：ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ。 ７．４　ＤＮＡ提取试剂：细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒。 ７．５　ＴＥ缓冲液：１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）。 ７．６　ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ缓 冲 液：２００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＴｒｉｓＨＣｌ、１００ ｍｍｏｌ／Ｌ 氯 化 钾、２０ ｍｍｏｌ／Ｌ 氯 化 镁、 １００ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸铵、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００（ｐＨ８．８）。 ７．７　硫酸镁：１０ｍｍｏｌ／Ｌ。 ７．８　显色液：ＳＹＢＲＧｒｅｅｎⅠ荧光染料，１０００×。 ７．９　阳性对照：假结核耶尔森氏菌标准菌株，或含目的片段的ＤＮＡ亦可。 ７．１０　１．５ｍＬ塑料离心管。 ８　仪器和设备 ８．１　移液器：量程０．５μＬ～１０μＬ；量程１０μＬ～１００μＬ；量程１００μＬ～１０００μＬ。 ８．２　高速台式离心机：≥７０００犵。 ８．３　水浴锅或加热模块：６３℃±１℃和１００℃±１℃。 ８．４　计时器。 ９　检测程序 食品中假结核耶尔森氏菌ＬＡＭＰ检测程序见图１。 ２ 犛犖／犜２７５４．１４—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 图１　食品中假结核耶尔森氏菌犔犃犕犘检测程序 １０　操作步骤 １０．１　样品制备及增菌培养 按照ＧＢ／Ｔ４７８９．８的方法进行样品制备和增菌。 １０．２　模板犇犖犃提取 １０．２．１　增菌液模板犇犖犃的制备 对于１０．１获得的增菌液，采用如下方法制备模板ＤＮＡ： ａ）　直接取该增菌液１ｍＬ加到１．５ｍＬ无菌离心管中，７０００犵离心２ｍｉｎ，尽量吸弃上清液； ｂ）　加入８０μＬＤＮＡ提取液，混匀后沸水浴１０ｍｉｎ，置冰上１０ｍｉｎ； ｃ）　７０００犵离心２ｍｉｎ，上清液即为模板ＤＮＡ；取上清液置－２０℃可保存６个月备用。 １０．２．２　可疑菌落模板犇犖犃的制备 对于１０．１分离到的可疑菌落，可直接挑取可疑菌落，再按照１０．２．１ｂ）步骤制备模板ＤＮＡ以待 检测。 １０．３　环介导恒温核酸扩增 １０．３．１　反应体系 假结核耶尔森氏菌ＬＡＭＰ反应体系见１。 １）　采用下述方法，也可使用等效的商品化的ＤＮＡ提取试剂盒并按其说明提取制备模板ＤＮＡ。 ３ 犛犖／犜２７５４．１４—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 表１　假结核耶尔森氏菌犔犃犕犘反应体系 组　　分 工作液浓度 加样量 μＬ 反应体系终浓度 ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ缓冲液 １０× ５．０ １× 外侧上游引物（Ｆ３） １０μｍｏｌ／Ｌ １．０ ０．２μｍｏｌ／Ｌ 外侧下游引物（Ｂ３） １０μｍｏｌ／Ｌ １．０ ０．２μｍｏｌ／Ｌ 内侧上游引物（ＦＩＰ） ２０μｍｏｌ／Ｌ ４．０ １．６μｍｏｌ／Ｌ 内侧下游引物（ＢＩＰ） ２０μｍｏｌ／Ｌ ４．０ １．６μｍｏｌ／Ｌ 环状上游引物（ＬＦ） ２０μｍｏｌ／Ｌ ２．０ ０．８μｍｏｌ／Ｌ 环状下游引物（ＬＢ） ２０μｍｏｌ／Ｌ ２．０ ０．８μｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ １０ｍｍｏｌ／Ｌ ２．０ ０．４ｍｍｏｌ／Ｌ 硫酸镁 １０ｍｍｏｌ／Ｌ １．０ ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ 犅狊狋ＤＮＡ聚合酶 ８Ｕ／μＬ ２．０ ０．３２Ｕ／μＬ ＤＮＡ模板 — ２．０ — 去离子水 — ２４ — １０．３．２　反应过程 １０．３．２．１　按表１所述配制反应体系。 １０．３．２．２　于６３℃恒温扩增６０ｍｉｎ。 １０．３．３　空白对照、阴性对照、阳性对照设置 每次反应应设置阴性对照、空白对照和阳性对照。 空白对照设为以水替代ＤＮＡ模板。 阴性对照以ＴＥ缓冲液代替模板ＤＮＡ。 阳性对照制备：将假结核耶尔森氏菌标准菌株接种于营养肉汤中３６℃±１℃培养过夜，用无菌生 理盐水稀释至约１０６ＣＦＵ／ｍＬ～１０８ＣＦＵ／ｍＬ（约麦氏浊度０．４），按１０．２．１提取模板ＤＮＡ作为ＬＡＭＰ 反应的模板。 １０．４　结果观察 在上述反应管中加入１μＬ显色液，轻轻混匀并在黑色背景下观察。 １０．５　结果判定和 在空白对照和阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下： ａ）　待检样品反应管液体呈绿色，该样品结果为假结核耶尔森氏菌初筛阳性，对样品的增菌液或可 疑纯菌落进一步按ＧＢ／Ｔ４７８９．８中操作步骤进行确认后报告结果； ｂ） 待检样品反应管液体呈橙色则可报告假结核耶尔森氏菌检验结果为阴性。 若与上述条件不符，则本次检测结果无效，应更换试剂按本方法重新检测。 ４ 犛犖／犜２７５４．１４—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 附　录　犃 （资料性附录） 假结核耶尔森氏菌靶基因序列 犃．１　假结核耶尔森氏菌靶基因序列（犪犮犮犲狊狊犻狅狀狀狅．犕１７４４８．１） １１４１ａｔｔｔｇａｃｃｇｇｃｃａｃａａｃｃａｃｃｇｔａｔｃｇｇｔｃｔｔｇｇｔｇｃｃｇａｇｇｃｃｔｇｇａｃｃｇａｔｔａｔｔｔａｃ １２０１ａｇｔｔｇｇｃｔｇｃｃａａｔｇｇｇｔａｔｔｔｔｃｇｃｃｔｃａａｔｇｇａｔｇｇｃａｃｔｃｇｔｃｇｃｇｔｇａｔｔｔｃｔｃｃｇ １２６１ａｃｔａｔａａａｇａｇｃｇｃｃｃａｇｃｃａｃｔｇｇｇｇｇｇｇａｔｔｔｇｃｇｃｇｃｇａａｔｇｃｔｔａｔｔｔａｃｃｔｇｃａｃ １３２１ｔｃｃｃａｃａａｃｔｇｇｇｇｇｇｇａａｇｔｔｇａｔｇｔａｔｇａｇｃａａｔａｃａｃｃｇｇｔｇａｇｃｇｔｇｔｔｇｃｔｔｔａｔ １３８１ｔｔｇｇｔａａａｇａｔａａｔｃｔｇｃａａｃｇｃａａｃｃｃｔｔａｔｇｃｃｇｔｇａｃｔｇｃｃｇｇｇａｔｃａａｔｔａｃａｃｃｃ １４４１ｃｃｇｔｇｃｃｔｃｔａｃｔｃａｃｔｇｔｃｇｇｇｇｔａｇａｔｃａｇｃｇｔａｔｇｇｇｇａａａａｇｃａｇｔａａｇｃａｔｇａａａ １５０１ｃａｃａｇｔｇｇａａｃｃｔｃｃａａａｔｇａａｃｔａｔｃｇｃｃｔｇｇｇｃｇａｇａｇｔｔｔｔｃａｇｔｃｇｃａａｃｔｔａｇｃｃ 注：阴影所示部分为假结核耶尔森氏菌靶基因序列。 犃．２　组成引物中碱基构成 ５ 犛犖／犜２７５４．１４—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 书书书 １１０２— ４１４５７２ 犜／ 犖犛 中华人民共和国出入境检验检疫 行　业　标　准 出口食品中致病菌环介导 恒温扩增（犔犃犕犘）检测方法 第１４部分：假结核耶尔森氏菌 ＳＮ／Ｔ２７５４．１４—２０１１  中 国 标 准 出 版 社 出 版 北京复兴门外三里河北街１６号 邮政编码：１０００４５ 网址 ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ 电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８ 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷  开本 ８８０×１２３０ １／１６　印张 ０．７５　字数 １１ 千字 ２０１１年６月第一版　２０１１年６月第一次印刷 印数１—１６００  书号：１５５０６６·２２２０３０　定价 １６．００ 元 版权所有 · 禁止翻制、电子发售