SNT 2663-2010 贝类中失忆性贝类毒素检验方法 酶联免疫吸附法

书书 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 !" ! #!""# " !$%$ 贝类中失忆性贝类毒素检验方法 酶联免疫吸附法 $%&%'()*+&),*,-+(*%.)/.0%11-).0 2 ,).,*)*.0%11-).0 " 3*4 5 (%61)*7%8)((9*,.,':%*&+..+ 5 !$%$6%%6$% 发布 !$%%6$&6$% 实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局 发 布 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 书书书 中华人民共和国出入境检验检疫 行　业　标　准 贝类中失忆性贝类毒素检验方法 酶联免疫吸附法 ＳＮ／Ｔ２６６３—２０１０  中 国 标 准 出 版 社 出 版 北京复兴门外三里河北街１６号 邮政编码：１０００４５ 网址 ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ 电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８ 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷  开本 ８８０×１２３０ １／１６　印张 ０．５　字数 ９ 千字 ２０１１年４月第一版　２０１１年４月第一次印刷 印数１—１６００  书号：１５５０６６·２２１７４８　定价 １４．００ 元 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 书书书 前　　言 　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国云南出入境检验检疫 局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：王秋艳、曹际娟、王刚、赵昕、郑惠芳、于兵、黄大亮、吴振兴、徐维加、郑秋月、 徐君怡。 Ⅰ 犛犖／犜２６６３—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 贝类中失忆性贝类毒素检验方法 酶联免疫吸附法 １　范围 本标准规定了贝类及其制品中失忆性贝类毒素检验的酶联免疫吸附法。 本标准适用于贝类及制品中失忆性贝类毒素的检测。 ２　术语、定义和缩略语 ２．１　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 ２．１．１ 失忆性贝类毒素　犪犿狀犲狊犻犮狊犺犲犾犾犳犻狊犺狆狅犻狊狅狀；犃犛犘 化学结构以软骨藻酸为代，摄食后可产生头晕目眩，定向力障碍及持续性短期记忆缺失等症状的 存在于贝类体内的海洋生物毒性物质的总称，它是一类具有神经兴奋的氨基酸类物质。 ２．１．２ 软骨藻酸　犱狅犿狅犻犮犪犮犻犱；犇犃 主要由拟菱形藻属硅藻产生的一种谷氨酸和红藻酸的类似物，能够污染鱼贝类等海洋生物，是引起 人类记忆缺失性中毒的致病因子。 ２．２　缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ＡＳＰ（ａｍｎｅｓｉｃｓｈｅｌｌｆｉｓｈｐｏｉｎｓｏｎ）：失忆性贝类毒素。 ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）：酶联免疫吸附试验。 ３　样品保存和制备 ３．１　样品的保存 ３．１．１　样品要有充分的代表性并尽可能没有个体差异，且至少要１０个以上。去壳贝肉、带壳的或罐装 的等，均应采取足够的个数并使贝肉达２００ｇ以上。 ３．１．２　远离实验室不能及时送检的样品，除了在常温下品质不会发生变化的，应将样品置于保温盒中 冷冻送检。如为带壳样品，应按３．２的方法开壳，去除水分后冷冻送检。 ３．２　样品的制备 ３．２．１　生鲜带壳样品的前处理 用清水将贝壳外表彻底洗净，切断闭壳肌，开壳，用重蒸馏水淋洗内部去除泥沙及其他外来物。将 闭壳肌和连接在胶合部的组织分开，仔细取出贝肉，切勿割破肉体。开壳前不要加热或用麻醉剂。收集 １００ｇ贝肉置于筛子中沥水５ｍｉｎ（不要使肉堆积），检出碎壳等杂物，将贝肉均质，备用。 １ 犛犖／犜２６６３—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ３．２．２　冷冻样品的前处理 在室温下，使冷冻样品呈半冷冻状态。带壳冷冻样品，按３．２．１方法清洗、开壳、淋洗取肉，此时的 贝肉仍呈冷冻状态，除去贝肉外部附着的冰片，轻轻抹去水分后；事先已去除水分的冷冻去壳样品，室温 缓化。将１００ｇ上述贝肉均质，备用。 ３．２．３　贝类罐头 将罐头内容物沥干水分，倒入均质器充分均质，备用。 ３．２．４　贝肉干制品 称取１００ｇ干制品放入足量清水中浸泡２４ｈ～４８ｈ（４℃冷藏），沥干、备用。 ３．２．５　盐渍品 用清水洗涤，流水脱盐，沥干，备用。 ４　测定方法 ４．１　测定原理 本方法的测定基础是竞争性酶联免疫反应，酶标板上包被有针对软骨藻酸抗体的捕捉抗体，加入抗 软骨藻酸抗体、标准液或样品溶液及软骨藻酸酶标记物，游离的失忆性贝类毒素与软骨藻酸酶标记物竞 争软骨藻酸抗体，同时软骨藻酸抗体与捕捉抗体连接。没有结合的酶标记物在洗涤步骤中被除去。将 酶基质和显色剂加入到孔中并且孵育。结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应 终止液后使颜色由蓝转变为黄色。在４５０ｎｍ测量微孔溶液的吸光度值，样品中的失忆性贝类毒素溶 液与吸光度值成反比，按绘制的标准曲线定量计算。 ４．２　试剂和材料 除另有规定外，所有化学试剂均为分析纯或生化试剂，水为重蒸馏水。 ４．２．１　无水甲醇。 ４．２．２　半对数坐标纸。 ４．２．３　ＤＡ标准物质。 ４．２．４　ＤＡ酶标记物。 ４．２．５　抗ＤＡ抗体。 ４．２．６　包被有捕捉抗体的微孔板。 ４．２．７　基质（过氧化氢）／发色剂（四甲基联苯胺）。 ４．２．８　洗脱液：０．５％吐温２０ＰＢＳ。 ４．２．９　反应终止液：６ｍｏｌ／Ｌ硫酸。 ４．２．１０　商业化试剂盒如比利时ＣＥＲ和挪威Ｂｉｏｓｅｎｃｅ公司生产的失忆性贝类毒素检测试剂盒１），若测 定低限和回收率达到本标准的要求则也适合于本标准。 １）　给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则 可使用这些等效产品。 ４．３　仪器和设备 ４．３．１　酶标仪（４５０ｎｍ）。 ２ 犛犖／犜２６６３—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ４．３．２　均质器。 ４．３．３　离心机。 ４．３．４　微量加样器：５０μＬ，１００μＬ，２００μＬ，１０００μＬ。 ４．３．５　微量多通道加样器：５０μＬ～３００μＬ。 ４．３．６　天平（感量０．０１ｇ）。 ４．３．７　０．４５μｍ滤器。 ４．４　试样的提取 称取第３章均质的贝类组织１０．０ｇ（精确至０．０１ｇ），加入１０．０ｍＬ水，涡旋振荡１ｍｉｎ，加入 ２０．０ｍＬ１００％甲醇，涡旋振荡１ｍｉｎ。３０００犵离心１０ｍｉｎ，用０．４５μｍ滤器过滤上清液，得到样品提 取液。用稀释缓冲液将样品提取液稀释１００倍（如吸取１０μＬ样品与９９０μＬ稀释缓冲液混合）。取 ５０μＬ按４．５方法进行酶联免疫测定。此时的稀释倍数是３００。高浓度的样品，如超出标准曲线范围， 可进一步用缓冲液稀释，直至样品浓度在标准曲线范围以内。 ４．５　酶联免疫测定 将足够数量的已包被捕捉抗体的微孔条插入微孔架（空白对照、标准液和样液分别做复孔），记录空 白对照、标准液和样液的位置。向空白对照孔加入１５０μＬ稀释缓冲液，向标准液和样液孔分别加入相 应的５０μＬ５个～７个失忆性贝类毒素标准液或样液到各自的微孔，每个标准液和样液应使用新的吸 头。向上述所有的微孔中加入１００μＬＤＡ酶标记物工作液，向除空白对照孔之外的所有微孔中加入 １００μＬＤＡ抗体工作液，迅速充分混合１ｍｉｎ，用粘胶纸封住微孔以防溶液挥发，４℃孵育２ｈ。孵育结 束后，倒去孔中液体，每个微孔注入３００μＬ洗液冲洗，翻转微孔板，倾去孔内液体，再重复以上洗板操作 ２次，在吸水纸上拍干。每孔加１５０μＬ底物／显色剂溶液，充分混合，室温避光孵育３０ｍｉｎ。每孔加入 ５０μＬ终止液迅速混匀后，在３０ｍｉｎ内测量并记录４５０ｎｍ波长下的吸光度值。 ４．６　结果的计算和表述 ４．６．１　计算百分比吸光度值 标准液和样液的平均吸光度值（ＯＤ值）减去空白对照孔的平均ＯＤ值作为标准液和样液的平均校 正ＯＤ值。按式（１）分别求得每个失忆性贝类毒素标准液和样液的百分比吸光度值： 犃＝犛－犛１犛０－犛１× １００％ …………………………（１） 　　式中： 犃———百分比吸光度值； 犛———失忆性贝类毒素标准液或样液的平均ＯＤ值； 犛１———空白对照孔的平均ＯＤ值； 犛０———０μｇ／Ｌ的失忆性贝类毒素标准液的平均ＯＤ值。 ４．６．２　绘制标准曲线 以百分比吸光度值为纵坐标，以失忆性贝类毒素溶液浓度（ｎｇ／ｍＬ）的对数值为横坐标，绘制标准 曲线。每次试验均应重新绘制标准曲线。或通过软件计算出浓度与百分比吸光度值间的标准曲线公 式，得到回归方程［见式（２）］： 犢＝犃ｌｏｇ犡＋犅 …………………………（２） 　　式中： 犢———百分比吸光度值； 犛犖／犜２６６３—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 书书书 !" ! #!""# " !$%$ !! ! !!!失忆性贝类毒素浓度"单位为纳克每毫升# ! " $ #$ %& " 和 # 为根据标准液计算出的常数' &%"%# ! 结果的计算 在 &%'%( 绘制的标准曲线上读取待测液百分比吸光度值所对应的失忆性贝类毒素浓度"即为待测 液中失忆性贝类毒素的含量# ! " $ #$ %'为了获得样品中失忆性贝类毒素的实际浓度# ! " $ " %"从标准曲 线上读出的浓度值应乘以相对应的稀释系数'或通过式# ( %即可求出待测孔的 )*+ 浓度"再乘以样品 稀释倍数即为原始样品失忆性贝类毒素浓度' &%"%& ! 结果的表述 &%"%&%% ! 当测定值 " (, ! " $ " 时"则报告失忆性贝类毒素含量 " (, ! " $ " ' &%"%&%! ! 当测定值 # (, ! " $ " 时"则报告实际测定数值' &%' ! 测定低限和回收率 &%'%% ! 测定低限 本方法的测定低限为 - ! " $ " ' &%'%! ! 回收率 本方法的回收率为 ./0 " 1,0 ' &%( ! 健康和安全 &%(%% ! 任何失忆性贝类毒素含量值大于 (, ! " $ " 的样品即被认为是有害的"对人类食用不安全' &%(%! ! 标准液含有失忆性贝类毒素"应特别小心"避免接触' &%(%# ! 甲醇对人体有害"建议有条件的实验室在通风橱中操作' &%(%& ! 反应终止液为 '#23 $ $ 硫酸"避免接触皮肤' $ % $ ! " # " " ! # ! " ! 书号( -//,'' ) (4(-5&. 定价( !! %&%$$ 元 版权所有 · 禁止翻制、电子发售