GBT 14926.56-2008 实验动物 狂犬病病毒检测方法

ICS65．020．30 B44 囝亘 中华人民共和国国家标准 GB／T14926．56—2008 代替GB／T14926．56—2001 实验动物 狂犬病病毒检测方法 Laboratoryanimal--MethodforexaminationofRabiesvirus 2008-12-10发布 2009-03-01实施 丰瞀粥鬻瓣警糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会仪1” 刖 置 GB／T14926．56—2008 GB／T14926((实验动物》共54个部分，为不同微生物和病毒检测技术方法。 本部分自实施之日起代替GB／T14926．56—2001《实验动物狂犬病病毒检测方法》。 本部分与GB／T14926．56—2001相比主要技术差异如下： a)删除原标准中“2引用标准”内容； b)对原标准中“3原理”中所有内容改为“在微孔板上预包被纯化狂犬病毒抗原，使免疫反应在 固相载体上进行。当被检血清中有狂犬病病毒抗体存在时，则与孔壁上的抗原形成抗原一抗体 复合物，再与抗犬IgG酶标记物反应，最后通过测定酶作用底物催化后的产物，进行定性 检测”； c) 删除原标准中所有关于血凝抑制试验的试剂、方法及结果判定； d)对原标准中所有关于酶联免疫吸附试验的内容进行修改，包括试剂、方法及结果判定等； e)对原标准中“6结果判定”中增加了“6．3基础级犬群体免疫抗体合格率：免疫抗体合格率一 (被检动物抗体阳性数／被检动物总数)×100％。基础级犬群体免疫抗体合格率达到70％以 上可判为该犬群免疫合格”内容。 本部分由全国实验动物标准化技术委员会提出并归口。 本部分由全国实验动物标准化技术委员会负责起草。 本部分主要起草人：田克恭、陈西钊、曹振、王传彬、何秀敏、汤汉文。 本部分所代替标准的历次版本发布情况为： ——GB／T14926．562001。 实验动物 狂犬病病毒检测方法 GB／T14926．56—2008 1范围 GB／T14926的本部分规定了狂犬病病毒(RV)的检测方法、试剂等。 本部分适用于犬RV的检测。 2原理 在微孔板上预包被纯化狂犬病毒抗原，使免疫反应在固相载体上进行。当被检血清中有狂犬病病 毒抗体存在时，则与孔壁上的抗原形成抗原一抗体复合物，再与抗犬IgG酶标记物反应，最后通过测定酶 作用底物催化后的产物，进行定性检测。 3主要试剂和器材 3．1试剂 犬狂犬病毒IgG抗体检测试剂盒(定性)，包括： a) 预包被狂犬病毒抗原的微孔板； b)狂犬病毒IgG酶标记物； c)狂犬病毒IgG阳性对照； d)狂犬病毒IgG临界对照； e)狂犬病毒IgG阴性对照； f)显色液A：磷酸氢一钠一柠檬酸缓冲液(o．05mol／L，pH5．o)1000mL，30％过氧化氢HzOz (MW34．0)3．5mL； g) h) i) j) 显色液B：柠檬酸1．052g，乙二胺四乙酸二钠(EDTA—Na：)0．186g，四甲基联苯胺(TMB) 0．25g，二甲基亚砜(DMsO)8．0mL，纯化水992mL； 终止液：98％硫酸27．8mL，纯化水972．2mL； 10倍浓缩洗涤液：PBS(0．1mol／LpH7．2～7．4)995mL，吐温一20，5mL； 样品稀释液：硼酸盐缓冲液(0．01mol／LpH8．O)956．0mL，甘油(MW92．09)40．0mL，酪蛋白 (casein)10％硫柳汞钠溶液2．0mL，吐温一20，1．0mL1％酚红溶液，1．0mL。 试剂在使用前应恢复至室温(18℃～25℃)。 3．2器材 器材包括： a) 精密移液器10pL～100tLL； b)一次性移液器吸头； c)振荡器； d)酶标仪(含450nm波长滤光片)； e)37℃恒温培养箱； f)蒸馏水或去离子水； g)100mL量筒； h)离心机； i)吸水纸。 GB／T14926．56—2008 4检测方法 4．1样品的准备 将采集到的待检犬血液样品离心，分离出待检犬血清或血浆。应避免使用染菌、溶血和高血脂的样 品；室温保存样品不应超过8h，若试验在8h以后进行，需将样品保存在2℃～10℃，如保存超过i周， 则应保存在一20℃并避免反复冻融。 4．2试剂配置 将10倍浓缩洗涤液恢复至室温，并振摇，然后用去离子水或蒸馏水作10倍稀释。 4．3稀释样品 将已分离好的犬血清或血浆用样品稀释液做1：10稀释，即取50止血清或血浆加入到500pL样 品稀释液中，并充分混匀。 4．4加样 取所需量的预包被微孔板条固定于板架上，依次加入稀释好的样品，lOOpL／孔，然后将阳性、阴性 对照各加1孔，临界对照加3孔，100pL／孔，另留一孔不加样品作为空白对照，在记录纸上记录各样品 和对照的次序或位置，剩余的板条放人密封袋中保存。 4．5孵育 加样完成后，用封板膜覆盖板条，置37℃恒温培养箱中孵育30min。 4．6洗板 甩净孔中液体，拍干，用稀释好的洗涤液加满每孔，停留lmin后甩净、拍干，如此重复洗涤3次。 4．7加酶 除空白对照外，其余各孔垂直滴加酶标记物1滴(50pL)，置37℃恒温培养箱孵育30min。 4．8显色 重复步骤4．6洗板3次，拍于后每孔(含空白对照孔)垂直滴加显色液A、B液各I滴，置37℃恒温 培养箱避光显色10min。 4．9终止 每孔(含空白对照孔)立即加入终止液1滴，混匀后以空白孔调零，用酶标仪450nm波长测定 A值。 5结果判定 5．1试验结果符合下列条件，方为有效：以空白孔调零，阴性对照值小于等于0．10，临界对照A值应在 0．15～o．40之间，证明试验成立。 5．2结果判定 5．2．1 待检样品A值大于等于临界对照A值的平均值，判为阳性； 5．2．2待检样品A值小于临界对照A值的平均值，判为阴性。 6结果解释 6．1基础级犬：接种疫苗后，经ELISA检测抗体效价达到阳性值判为合格。 6．2 SPF级犬，不应进行疫苗接种，对阳性检测结果，选用同一种方法或另一种方法重试。如为阳性 则判为阳性。 6．3基础级犬群体免疫抗体合格率： 免疫抗体合格率一(被检动物抗体阳性数／被检动物总数)×100％ 基础级犬群体免疫抗体合格率达到70％以上可判为该犬群免疫合格。 2 7结果报告 根据判定结果，作出报告。 GB／T14926．56—2008