化学检验原理

nullnull临床生化实验技术临床生化实验技术 临床生化实验技术是临床生化检验工作的重要基础，是临床生化检验工作能够顺利进行的技术保障。临床生化实验室技术较多，本章主要介绍光谱检验技术、色谱检验技术、电泳技术、免疫学检验技术、电化学分析技术、生物传感技术等在临床生物化学中的应用及有关的注意事项。其目的在于巩固基础，加强新技术的学习，提高基础水平。为进一步做好临床生化检验工作打好基础。 光谱检验技术 光谱检验技术 光谱检验技术利用各种化学物质具有发射、吸收或散射光谱谱系的特征，以此来确定物质性质、结构或含量的技术。根据物质对光谱响应特征的不同，可把光谱检验技术分为发射光谱分析技术、吸收光谱分析技术和散射光谱分析技术三大类。在临床生化检验中，光谱分析是一类十分重要的技术，应用极为广泛。它既可以研究物质的结构，也可以对特定物质进行定性或定量分析。 吸收光谱分析法 发射光谱分析法 散射光谱分析法 吸收光谱分析法 吸收光谱分析法 吸收光谱是指波长连续分布的光透过物质时，某些波长的光被物质吸收而产生的暗线或暗带组成的光谱。利用吸收光谱对物质进行定量的技术称为吸收光谱分析法，是实验室最常用的分析技术之一。它操作简便、快速，线性范围较宽，应用广泛。目前最常应用的技术有可见－紫外分光光度法和原子吸收分光光度法。 可见－紫外分光光度法 原子吸收分光光度法 可见－紫外分光光度法 可见－紫外分光光度法 检测原理和方法 可见－紫外分光光度法的理论基础基于朗伯－比尔定律。可见－紫外光区一般是指波长从200nm 至760nm 范围内的光，其中小于400nm 的是紫外光，该分析是根据物质的分子对光的吸收特性进行成分分析或分子结构分析的方法。在可见－紫外分光光度法中，通常在测定未知样品浓度的同时，与已知浓度的标准物作比较，可以利用公式As = K CsL，Ax = K CxL 来计算结果，即比较法。其中A 为吸光度， C 为溶液的浓度，其下标s、x 分别表示属标准物、待测物，k 为常数，L 为比色杯的光径。或将一系列浓度不同的标准溶液按照一定操作过程显色后， 分别测吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，从标准曲线找出相对应的待测。 原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法 基于光源辐射出具有待测元素特征谱线的光，通过原子化器，被其中待测元素的基态原子所吸收，根据吸收而导致辐射特征谱线光被减弱的程度来测定待测元素的含量。与其它分析方法比较，它具有灵敏、准确、操作简便、分析速度快、干扰少、无需化学反应和测量元素含量范围较广等优点，由于其检测灵敏度较高，操作也比较复杂，而且每种元素需要一种光源，因此在临床实验室一般应用较少，主要用于测定钙、镁、铜、铅、锌等机体微量元素，是目前这些元素测得的参考方法。在原子吸收分光光度法中，定量分析常用的方法有标准曲线法、直接比较法和标准加入法。其基本原理都是利用吸光度与浓度之间的线性函数关系，由已知浓度的标准溶液求得样品的浓度。 发射光谱分析法发射光谱分析法 临床生物化学检验常用的有荧光分析法（fluorometry）和火焰光谱法。由于火焰光谱法操作麻烦，影响因素多，现已被简便可靠的离子选择电极法所取代，故这里主要介绍荧光分析法。 散射光谱分析法散射光谱分析法 散射光谱分析法主要测定的是光线通过溶液混悬颗粒后的吸光度或光散射程度的一类定量方法。常用的方法有透射比浊法和散射比浊法两种。目前，在临床生化检验中主要用于免疫比浊法 散射免疫比浊分析 透射免疫比浊分析透射免疫比浊分析透射免疫比浊分析 透射比浊法（turbidimetry）的基本原理是测定一定体积的溶液通过的光线量（光通量），当光线通过时，由于溶液中存在抗原一抗体复合物粒子对光线的反射和吸收，引起透射光的减少， 测定的光通量和抗原抗体复合物的量成反比。在透射比浊中，测量的是透过不溶性复合物到达探测器而未被散射或吸收的光线，测定角度与正前方夹角为0°。 该方法的测定原理：试验中设计检测抗体过量，待测样品中的Ig 在反应介质中与相应的检测抗体发生抗原一抗体反应，形成可溶性复合物，在聚乙二醇（PEG）的作用下，加速抗原一抗体复合物的形成和稳定性，使反应介质的浊度发生改变，利用分光光度计测定光线被吸收的量，待测样本的抗原含量与吸光度成正比，光通量与抗原含量成反比。利用标准品做出标准曲线，待测样本的浊度变化可在标准曲线上计算出来。 免疫比浊分析的临床应用 免疫比浊分析的临床应用 临床主要用于检测血浆、体液中的特定蛋白系列，如免疫球蛋白IgG、lgA、IgM 反应抗体的体液免疫功能；k、L用于M 蛋白病的诊断； 补体C3、C4 反应补体的消耗情况；前白蛋白可作为营养不良和肝功能不全的指标；α1－抗胰蛋白酶缺乏者可发生年青人肺气肿、新生儿和成人肝损害；转铁蛋白用于贫血的鉴别诊断；炎性反应蛋白SAA、C-反应蛋白、载脂蛋白、尿微量蛋白系列和一些小分子量的治疗性药物浓度等。这些特定蛋白成分的定量检测，可为临床诊断与治疗提供有效的病理生理指标，而且是临床诊断，判断治疗效果，分析预后的依据。因此，散射比浊分析 保证检测结果准确性的同时，应对一些指标的临床应用价值，与疾病发生发展之间的关系，标本采集时可能影响正确检测的因素等有较全面的了解，才能更好的利用这些病理生理指标，为疾病诊断和协助治疗提供更好的服务。 透射免疫比浊法 （transmission turbidimetry 透射免疫比浊法 （transmission turbidimetry原理抗原与抗体在一定缓冲液中形成IC，当光线透过反应溶液时，由于溶液内IC粒子对光线的反射和吸收，引起透射光减少，IC越多透射光越少，可用吸光度表示。透射免疫比浊法透射免疫比浊法 溶液中形成的复合物分子应足够大(35-100nm)溶液中形成的复合物分子要足够多，控制抗原抗体反应的温度和时间，加增敏剂，提高复合物形成速度，缩短检测时间，应选择亲和力好、效价高的抗体，保证抗体过量，将标准品稀释至少5个浓度测定，以吸光度值(A)为纵坐标，浓度为横坐标，在半对数纸上绘出标准曲线。反应要求透射免疫比浊法透射免疫比浊法【缺陷】 灵敏度较低。要求抗原－抗体复合物分子应足够大、足够多，分子太小则入射光直接通过。加增敏剂。 直线光路，灵敏度有先天缺陷。设计散射比浊 透射比浊是依据透射光减弱的原理来定量的，因此只能测定抗原－抗体反应的第二阶段，检测仍需抗原－抗体温育反应时间，检测时间较长。null