高效液相色谱法同时测定二至丸中齐墩果酸和熊果酸的含量

·方药研究· 二至丸出自明代《医便》，由女贞子（为女贞子 Ligustrum lucidum Ait 的干燥成熟果实） 和墨旱莲 （为鳢肠 Eclipta prostrata L 的干燥地上部分）2 味 中药等量配伍组成，具有益肝肾、补阴血、乌须发 之功，是一滋补肾阴的名方 ［1］。 现代研究表明二至 丸可改善血液的高黏状态，延缓皮肤组织衰老，具 有抗骨质疏松等多种生物活性 ［2-5］。 《中国药典》 2005 年版一部采用薄层色谱扫描法对二至丸中的 齐墩果酸进行定量控制， 但因二至丸中还含有熊 果酸，为齐墩果酸的同分异构体，二者理化性质极 为相似，无法分离，在薄层板上只显示一个斑点， 无法同时测定二者的含量。 并且薄层扫描法受显 色、板间差异等诸多因素影响，导致稳定性、重复 性差，定量不准确。 已有文献报道，采用高效液相 色谱法测定二至丸中齐墩果酸含量， 但未对其熊 果酸进行定量 ［6］，而熊果酸亦是抗骨质疏松的有 效成分之一 ［7］。 因此，本试验采用高效液相色谱法 同时测定二至丸中齐墩果酸和熊果酸的含量，该 方法简便、可靠、重复性好，可更好的控制二至丸 的质量。 1 仪器与试药 1.1 仪器 Watters2695 型高效液相色谱仪，Wa- ters2996 型二极管阵列检测器 ，Sartorius CP225D 电子分析天平，RE-52 旋转蒸发仪（上海亚荣生化 仪器厂），索氏提取器。 1.2 试药 齐墩果酸对照品 （批号 110709 - 200505）、熊果酸对照品 （批号 110742-200516） 均购自中国药品生物制品检定所 ， 供含量测定 用。 女贞子药材（福建天人药业有限公司，批号： 20080601），墨旱莲药材（福建天人药业有限公司， 批号：20080710），色谱纯甲醇（国药集团化学试剂 有限公司，批号 T20090107），甲醇（天津市福晨化 学试剂厂，批号 20090410）、乙酸乙酯（天津市福晨 化学试剂厂，批号 20080717）为分析纯，娃哈哈纯 净水。 2 方法与结果 2.1 色谱条件 色 谱 柱 ：Alltima C18 柱 （250 mm×4.60 mm 5 μm），流动相：甲醇-水=87：13，流 速：0.7 mL ／min，检测波长：210 nm，柱温：30℃。 分 离图谱见图 1、图 2。在此条件下，齐墩果酸与熊果 酸能够基本分离（分离度，R＝1.48）。 2.2 对照品溶液的制备 精密称取对照品齐墩 果酸 25.06 mg， 熊果酸 12.50 mg 分别置于 25 mL 量瓶中， 以甲醇溶解并定容， 配置成浓度分别为 高效液相色谱法同时测定二至丸中齐墩果酸和熊果酸的含量 林雄浩 1，2，吴岩斌 2，高伟城 1，吴锦忠 1，2 （1. 福建中医学院药学系，福建 福州 350108；2. 福建中医学院中西医结合研究院，福建 福州 350108） 摘要： 目的 建立高效液相色谱同时测定二至丸中齐墩果酸和熊果酸含量的方法，为二至丸的 质量控制提供科学依据。 方法 色谱柱为 Alltima C18，柱温 30℃，流动相为甲醇-水（87：13），流速 为 0.7 mL ／min， 检测波长为 210 nm。 结果 齐墩果酸在 2.0～7.0 μg 范围内线性关系良好 ：r＝ 0.999 8；平均回收率为 101.1％，RSD 为 1.23％；熊果酸在 1.0～3.5 μg 范围内线性关系良好；r＝0.999 9； 平均回收率为 99.5％，RSD 为 1.41％。 结论 该方法简单、结果可靠、重复性好，可用于二至丸的质 量控制。 关键词：二至丸；齐墩果酸；熊果酸；HPLC 中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1004-5627（2009）06-0023－03 收稿日期：2009-05-29 基金项目：福建省高校中西医结合基础重点实验室开放课题基金（ZXY2008010），陈可冀中西医结合发展基金（CKJ2008014） 作者简介：林雄浩（1984—），男，硕士研究生，主要从事中药提取分离及其质量研究。 通讯作者：吴锦忠（1965—），男，博士，教授。 Tel：（0591）22861611，E-mail：jinzhongfj@126.com Journal of Fujian University of TCM December 2009，19（6） 福建中医学院学报 2009 年 12 月 第 19 卷 第 6 期 23 表 1 二至丸中齐墩果酸、熊果酸加样回收率（n＝9） 测定成分 齐墩果酸 熊果酸 样品中含量 ／mg 2.357 2.357 2.357 1.262 1.262 1.262 加入量 ／mg 2.0 2.0 2.0 2.5 2.5 2.5 3.0 3.0 3.0 1.0 1.0 1.0 1.25 1.25 1.25 1.5 1.5 1.5 测得量 ／mg 4.402 4.369 4.383 4.899 4.925 4.845 5.364 5.343 5.416 2.217 2.247 2.265 2.508 2.532 2.516 2.760 2.757 2.756 回收率 ／% 101.9 100.5 101.1 101.8 102.9 99.5 100.3 99.4 102.5 96.4 98.8 100.2 99.7 101.6 100.3 99.8 99.6 99.5 平均值 ／% 101.1 99.5 RSD ／% 1.23 1.41 1.0024 mg ／mL 和 0.5000 mg ／mL 的齐墩果酸 、熊 果酸对照品储备液。 2.3 供试品溶液的制备 二至丸按 2005 年版 《中国药典》制备。女贞子 500 g 粉碎，研细，过 100 目筛；墨旱莲 500 g 加水煎煮 2 次，每次 1 h，合并 煎液，滤过，滤液浓缩至适量，与女贞子粉末泛丸， 干燥，即得。 取本品研细，取约 0.5 g，精密称定，置 索氏提取器中，加乙酸乙酯适量，加热回流提取 6 h，提取液回收乙酸乙酯至干，残渣加甲醇使溶解， 转移至 25 mL 量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，作为 供试品溶液。 2.4 线性关系考察 取齐墩果酸和熊果酸对照品 储备液，配成每 1 mL 含齐墩果酸 0.50 mg，熊果酸 0.25 mg 的混合溶液。 精密吸取4，6，8，10，12，14 μL，进样，色谱图，以对照品的进样量为横坐 标（X），峰面积的积分值为纵坐标（Y），求得标准 曲线的回归方程，齐墩果酸：Y＝13775X－1429.3， r＝0.999 8，在 2.00～7.00μg 的范围内线性关系良 好 ； 熊果酸 ：Y＝6045X－864.23，r＝0.999 9，在 1.00～3.50 μg 的范围内线性关系良好。 2.5 精密度试验 精密吸取含齐墩果酸 0.50 mg ／mL 和熊果酸 0.25 mg ／mL 的混合溶液，在选定 的色谱条件下测定色谱峰的峰面积， 分别计算齐 墩果酸的峰面积平均值 68148.37，RSD＝0.12％ （n＝6）；熊果酸的峰面积平均值 14357.38，RSD＝ 0.13％（n＝6），表明仪器精密度良好。 2.6 重复性试验 精密称取同一批次二至丸样 品 6 份，每份 0.5 g，按 2.3 方法制备供试品溶液， 结果测得齐墩果酸的峰面积平均值 63517.77， RSD＝0.17％ （n＝6）； 熊果酸的峰面积平均值 14349.59，RSD＝0.88％（n＝6）。 2.7 稳定性试验 吸取同一供试品溶液，隔一定 时间进样 1 次。 结果表明，供试品在 24 h 内稳定 性良好 ， 齐墩果酸的峰面积平均值 64436.38， RSD＝0.16％ （n＝6）， 熊果酸的峰面积平均值 14483.35，RSD＝0.31％（n＝6）。 2.8 回收率试验 准确称量已知含量的二至丸 0.25 g 9 份，分为 3 组。第 1 组加入齐墩果酸、熊果 酸混合对照品 （质量浓度分别为 0.50，0.25 mg· mL-1）4.0 mL， 第 2 组加入上述混合对照品 5 mL， 第 3 组加入上述对照品 6 mL，按照 2.3 方法处理， 制得二至丸加样回收率样品液，0.45 μm 微孔滤膜 过滤，测定过程同样品测定，结果见表 1。 福建中医学院学报 第 19卷24 Simultaneous Determination of Oleanolic Acid and Ursolic Acid in Erzhi Pill by HPLC LIN Xiong-hao1，2, WU Yan-bin2, GAO Wei-cheng1, et al （1. Department of Pharmacy, FUTCM, Fuzhou, Fujian 350108, China; 2. Fujian Academy of Integrative Medicine, FUTCM, Fuzhou, Fujian 350108, China） ABSTRACT： Objective To establish a HPLC method for simultaneous determination of oleanolic acid and ursolic acid in Erzhi pill and provide some bases for its quality control. Methods The analysis was carried on Alltima C18 with mobile phase consisted of methanol-water solution （87∶13） at a flow rate of 0.7 mL ／min, and the detective wavelength was 210 nm. Results The linear range of oleanolic acid was 2.0～7.0 μg（r＝0.9998）, the average recovery was 101.1%，and RSD was 1.23％. The linear range of ursolic acid was 1.0～3.5 μg （r＝0.9999）, the average recovery was 99.5％, and RSD was 1.41％. Conclusion The method is simple, accurate and reproducible, and suitable for the quality control of Erzhi pill. KEY WORDS： Erzhi pill; oleanolic acid; ursolic acid; HPLC 2.9 样品测定 精密称取 10 批次的二至丸样 品，每份约 0.5 g，按 2.3 方法提取，分别定溶于 25 mL 量瓶中，得 10 个供试品溶液，每个样品分别进 样 3 次，每次进样 20 μL，测定齐墩果酸、熊果酸 峰面积积分值，面积取其平均值，用外标法计算含 量，测定结果见表 2。 3 讨 论 3.1 流动相及流速的确定是基于齐墩果酸和熊 果酸是同分异构体，两者不易分离，根据文献报道 曾采用乙腈－水作为流动相， 发现分离效果不好， 后改用甲醇－水作为流动相，并考察了（90∶10；88∶ 12；85 ∶15；80 ∶20）多种比例和 （1 mL ／min；0.8 mL ／ min；0.5 mL ／min）多个流速，发现甲醇比例过大或 流速过大， 则分离效果不好， 甲醇比例或流速过 小，出峰时间较长。 经试验用甲醇－水（87∶13）作流 动相，流速为 0.7 mL ／min 时，分离效果最佳。 3.2 HPLC 法检测齐墩果酸和熊果酸的含量，采 用紫外检测器时， 需正确选择波长。 检测波长太 小，溶剂系统的截止波长接近检测波长，造成基线 噪音大，平衡基线所需时间长，流动相的本底吸收 高，从而影响组分的检测；检测波长太大，齐墩果 酸和熊果酸的吸收值太低，响应因子小，同样影响 组分的检测。 因此，HPLC 法检测齐墩果酸和熊果 酸含量时，选择 210 nm 作为检测波长较适宜。 3.3 所建立的方法具有简便，快速，结果准确，可 靠等优点，同时也可用于制备工艺的的控制，可用 于该样品的分析。 致谢： 本项目在国家中医药管理局中药生药 学三级实验室、 福建省卫生厅中药生药学重点研 究室和福建省中西医结合老年性疾病重点实验室 完成。 参考文献： ［1］ 国家药典委员会． 中华人民共和国药典［S］． 北京：化学工业 出版社，2005：293-294. ［2］ 赵雪莹，李胜志，李冀 . 二至丸对衰老大鼠血液流变学影响 的实验研究［J］. 辽宁中医杂志，2008，35（6）：945-946. ［3］ 丁玉琴， 周红梅. 二至丸延缓皮肤组织衰老的实验研究［J］. 河南中医，2005，25（10）：28-30. ［4］ 邢薇薇，张宏，吴锦忠，等. 二至丸对肾阴虚骨质疏松大鼠的 影响［J］. 福建中医药，2008，39（6）：45-47. ［5］ ZHONG HONG，XING WEI WEI，WU JIN ZHONG，et al. Ef- fects of a traditional chinese herbal preparation on osteoblasts and osteoclasts ［J］. Maturitas，2008，61（4）：334-339. ［6］ 李梦 . HPLC 法测定二至丸中齐墩果酸的含量 ［J］. 中国药 师，2009，12（1）：129-130. ［7］ LEE SU UI，PARK SANG JOON，KWAK HAN BOK，et al. Anabolic activity of ursolic acid in bone：Stimulating osteoblast differentiation in vitro and inducing new bone formation in vi- vo ［J］. Pharmacol Research，2008，58（5-6）：290-296. 表 2 不同批次二至丸中齐墩果酸和熊果酸的含量 NO. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 平均含量 样品质量 ／ g 0.5012 0.5015 0.5019 0.5016 0.5008 0.5015 0.5018 0.5016 0.5017 0.5014 齐墩果酸 ／mg·g-1 11.759 11.850 12.722 11.414 11.165 11.896 12.176 11.518 11.770 11.668 11.794 熊果酸 ／mg·g-1 6.277 6.412 6.735 5.938 5.642 6.232 6.620 6.015 6.249 6.269 6.239 第 6期 林雄浩等：高效液相色谱法同时测定二至丸中齐墩果酸和熊果酸的含量 25