2-氨基丁酸的酶拆分

第31卷第3期 2009年03月 武汉工程大学学报 J． WuhanInst．Tech． V01．31 Mar． No．3 2009 文章编号：1674—2869(2009)03—0026—04 2一氨基丁酸的酶拆分 奚 强，丁友友，林丫丫，李 俊 (武汉工程大学化工与制药学院，湖北省新型反应器与绿色化工重点实验室，湖北武汉430074) 摘 要：为了得到右旋的2一氨基丁酸，对2一氨基丁酸的拆分进行了研究．通过从猪肾中提取的氨基酰化酶选 择性地水解(R，S)一2一N一乙酰氨基丁酸，得到了(S)一2一氨基丁酸，旋光度一+21．58。(C=2，5mol／LHCI)，收 率为71．8％．试验结果明最佳拆分条件为：底物浓度为0．1tool／L；底物与酶质量比为100，1；pH6．8～ 7．0；温度为37℃；反应时间为24h． 关键词：酶拆分；酰基转移酶；选择性水解；(S)一2一氨基丁酸 中图分类号：0629．71 文献标识码：A 0 引 言 2一氨基丁酸(2一amino—butyricacid)具有氨基 酸的通性，能发生酯化、酰化和氧化脱氨等反应， 其分子结构中含有一个手性中心．不同构型的2一 氨基丁酸在化学性质上几乎没有区别，在物理性 质上有些许差异，2一氨基丁酸是抑制人体神经信息 传递的天然氨基酸，也是一种重要的化工原料和 医药中间体，已广泛应用于药物合成[1]．(S)一2一氨 基丁酸经酯化和加氢还原可以制备出(S)一2一氨基 丁醇，(S)一2一氨基丁醇则用于抗结核药物盐酸乙胺 丁醇的合成比j． 氨基酸的拆分方法有很多，L一氨基酸的生物 合成可采用完整的微生物细胞或从微生物中提取 的酶作为生物催化剂进行生物转化．生物催化剂 的区域选择性强、反应条件温和、操作简便、成本 较低、公害少，且能完成一些化学合成难以进行的 反应，因此该领域的研究引起了广泛的关注L3。5J． 在氨基酸的生物拆分方法中，以氨基酰化酶为催 化剂进行生物拆分是最常见的方法之一[6。]，该酶 具有立体选择性强、底物专一性的优点，能立体选 择性地将N一乙酰一L一氨基酸水解，适合于多数外消 旋氨基酸的拆分．还有文献报道了利用米曲霉氨 基酰化酶阻93和固定化青霉素酰化酶[1叮对氨基酸 或类似物进行了拆分，都得到了较好的效果．拆分 的方法还有化学拆分法¨1]和高效液相色谱法[12] 等，相对这些方法而言，酶法拆分具有反应条件温 和，易于工业化等诸多优点．拆分后的乙酰化氨基 酸可以进行消旋／．13-14]，消旋后可再次投入拆分，从 而提高了产率．虽然酶法制备手性氨基酸较为成 熟，但用它来制备手性的2一氨基丁酸则没有见诸 报导．本实验首次采用从猪肾中提取出的水解 酶¨5|，制备具有重要工业价值的(S)一2一氨基丁酸， 主要的路线为：将混旋的氨基丁酸(1)经乙酰 化得到酰化2一氨基丁酸(2)，然后用酶法拆分酰化产 物(2)，最后采用7328强酸性阳离子交换树脂分离 得到(S)-2一氨基丁酸(3)，实验路线如图1所示． 3 ‘ ^／C00H NHAc 4 图1 (S)一2一氨基丁酸的合成路线 Fig．1Synthesisroutefor(S)一aminobutyricacid 1实验部分 1．1仪器与试剂 RY一1熔点仪，天津市分析仪器厂生产；精密 pH计(PHS-3C)，上海雷磁仪器厂生产；TD5一II低 速多管架自动平衡离心机，长沙平凡仪器仪表有 限公司生产；RE一52C旋转蒸发仪，巩义市予华仪 器有限责任公司生产；油浴锅，郑州长城科工贸业 有限公司生产；SHB-m循环水真空泵，郑州长城科 工贸业有限公司生产；WZZ一2A型自动旋光仪，上 海精密科学仪器有限公司生产． 冰乙酸，分析纯，天津市博迪化工有限公司生 产；乙酸酐，AR，湖北大学化工厂生产；猪肾，超市 收稿日期：2008—09—19 作者简介：奚强(1964一)，男，湖北浠水人，副教授，博士，硕士研究生导师．研究方向：医药中间体和功能材料的合成 一1一≮一叫蝥 万方数据万方数据 第3期 奚强，等：2一氨基丁酸的酶拆分 27 购买，新鲜；无水乙醇，分析纯，天津博迪化工有限 公司生产；硫酸铵，分析纯，上海试一化学试剂有 限公司生产；氯化钴，分析纯，重庆化学试剂厂生 产；丙酮，分析纯，天津市博迪化工有限公司生产； 氨水，分析纯。信阳市化学试剂厂生产；盐酸，分析 纯，信阳市化学试剂厂；茚三酮，分析纯，国药集团 化学试剂有限公司生产；7328强酸性阳离子交换 树脂，国药集团化学试剂有限公司生产． 1．2 (R，S)一2一N一乙酰氨基丁酸的合成 称取(R，S)一2一氨基丁酸41．2g(0．4t001)溶于 200mL的冰醋酸中，升温至65℃直至其完全溶 解，待反应体系澄清后，用恒压滴液漏斗匀速滴加 乙酸酐66．6mL(约0．7m01)，继续升温至80℃， 恒温反应2h．反应完成后，将反应液减压蒸馏除 去冰乙酸和过量的乙酸酐，加蒸馏水数次，每次约 10mL，抽干至出现大量的白色粉状固体．然后加 入100mL丙酮，回流溶解后冷却结晶，抽滤后用 少量丙酮洗涤滤饼，将滤饼烘干后得到产品．将滤 液减压蒸馏后，重复以上的操作步骤两次．所得固 体烘干后混合，产物重量47．2g，收率为81．3％． 1．3 (R，S)一2一N一乙酰氨基丁酸的拆分 1．3．1，猪肾氨基酰化酶的提取取新鲜去髓质的 猪肾两个，洗净后切片，铺盘，漓干，质量约200g，放 入一10℃的冷冻箱内冷冻，约1h后将冷冻的猪肾 解冻，加入1．5倍于猪。肾重量的稀乙醇水溶液 (30％)，并加入少许氯化钴(研究证明C02+是酰化 酶的激活离子[1阳)，在组织捣碎机内捣成匀浆，超声 波处理10min．将匀浆用离心机离心20rain(转速 3500r／min)，取上层清液，约350mL，再向清液中 加人2倍于清液体积的95％乙醇及少量(约1g)硫 酸铵，静置沉淀，然后再离心20rain(转速 3500r／rain)得到灰色沉淀物．向沉淀物中加入 100mL丙酮脱水，抽滤，得到灰褐色粉末状颗粒约 20g，即为粗酶制品，置于一10℃条件下保存备用． 1．3．2(R，S)一2一N一乙酰氨基丁酸的拆分称取 (R，S)一2一N一乙酰氨基丁酸4．35g(0．03t001)溶于 300mL的蒸馏水中，用2mol／LNaOH调节PH= 6．7，升温至35℃，加入自制的猪肾酰在酶 0．435g，恒温反应24h．反应结束后抽滤，酶用适 量的丙酮洗涤后放人冰箱中冷藏．将滤液调节pH 至5．6，升温至100℃后自然冷却，抽滤除去白色 絮状物．将滤液浓缩至100mL，通过732。强酸性 阳离子交换树脂分离纯化，收集含(S)一2一氨基丁酸 的溶液[173(茚三酮[18])，浓缩至5mL，用 2mol／L的HCI调节pH=5．56，5℃结晶，抽滤，于 60℃烘干，将白色固体用50％乙醇水溶液重结晶， 所得产品重量为1．11g，收率为71．8％，旋光= +21．58。(C=2，5mol／LHCI)(值：[口]智= +21-6。)． 2结果与讨论 2．1 N一乙酰化反应 2一氨基丁酸与乙酸酐的反应属于双分子亲核 取代反应，pH值呈碱性有利于氨基酸类物质的乙 酰化反应，在酸性条件下则易生成一NH+形式， 不利于亲核试剂的进攻．反应液的0H一浓度过高 会加速乙酸酐的水解，反应会不断地产生乙酸和 放出大量的热，因此反应液的pH值不宜过高．实 验中曾采取了加入氢氧化钠使反应体系为弱碱性 的方法[1引，加入两倍于氨基酸摩尔质量的乙酸酐 才使得反应完全，且生成了大量的盐，经处理后得 到的产物收率仅为48．3％．同时还尝试了用乙酸 钠的水溶液提供碱性环境，在常温下滴加乙酸酐 的方法，效果也较差．以上两种方法都存在一些缺 陷，且产率较低．后来利用乙酸作溶剂，丙酮结晶 的方法制得了较高收率的(R，S)-2-N一乙酰氨基丁 酸，熔点133～135℃(文献值129～130℃)． 2．2影响酶拆分的因素 2．2．1 底物浓度和酶用量对酶拆分的影响 猪 肾酰化酶具有一般酶的通性，即底物浓度对反应 速率的影响符合米氏方程．根据文献[7-8]的报道，酶 拆分过程中所用的底物的浓度一般为0．1mol／L， 并且做过底物浓度为0．05mol／L，0．1mol／L和 0．5mol／L的试验，结果发现酶拆分的最佳底物浓 度为0．1mol／L．增加酶的用量会提高反应速度， 但是反应速度过快又不利于(R。S)一2一氨基丁酸拆 分的分布进行，影响产物的光学纯度，经研究发现 增加酶的用量对收率的影响不明显．底物与酶的 质量比对酶拆分的影响如图2所示，当m(底物)／ m(酶)=100：1时光学纯度最高．(S)-2嘻￡基丁酸 的光学纯度¨](OpticalPurity，O．P)：O．P= m(底物蜘(酶) 圈2 底物与酶的质量比对酶拆分的影响 Fig．2Effectoftheweightratioofsubstanceand enzymeone皿ymeresolution2 万方数据万方数据 28 武汉工程大学学报 第31卷 2．2．2PH值对酶拆分的影响在相同条件下， 考察反应体系的pH值对酶拆分结果的影响．结果 如图3所示，当pH在酸性范围内，随pH值的增 加，产物的收率增加．当反应体系在碱性范围时， 随pH值的增加，产物的收率减少．从实验结果(图 3)可以看出pH值对酶促反应的影响很大，当pH 值过高或过低时，不但影响最终产品的收率，还影 响产品的纯度，所得产品的旋光度达不到要求，这 可能是因为在过酸或过碱的条件下，酶活性降低， 并且旋光性物质有一定程度上的消旋．因此采用 猪肾酰化酶拆分(R，S)一2一氨基丁酸最适合的pH 值为6．8～7．0． 图3 pH值对酶拆分的影响 Fig．3EffectofpHvalueonenzymereso[ution2 2．2．3温度对酶拆分的影响考察不同反应温 度下酶拆分的效果，结果如表1所示．由表1可 知，当温度较低时，由于酶活较低，反应速度缓慢， 升温可加快酶的水解速度，使(S)-2-氨基丁酸的收 率增加．当温度进一步升高时会使酶蛋白变性失 活，使得催化效率降低．酶促反应速度到达最大值 时的速度即为该酶的最适温度，在实验条件下，较 适合的反应温度为37℃．另外，温度对产品质量 的影响不如pH值对产品质量的影响显著，最终产 品的旋光度较接近标准值． 表1 温度对酶拆分的影响 Table1 Effectofreactiontimeonenzymeresolution2 乙酰氨基丁 酶用量／g f／'C 产率／％ [。]静 酸用量／g 0．0435 25 0．0435 28 0．0435 30 0．0435 35 0．0435 37 0．0435 40 56．4 57．1 60．3 72．3 73．5 62．5 2．2．4反应时间对酶拆分的影响 考察不同反 应时间下酶拆分的效果，结果如表2所示．由表2 可知，当反应时间增加时，产物的光学纯度和产率 也升高，但超过24h，产物的光学纯度和产率却随 之下降．时间过短，酶的拆分反应不充分，使得产 率和旋光度均达不到要求，而时间过长会发生正 向和逆向的竞争反应，使得产率和旋光度都有所 下降，因此最佳拆分时间为24h． 表2反应时间对酶拆分的影响 Table2 Effectofreactiontemperatureonenzyme resolution2 乏竺T M,睡lt／gf／'C产率／％[口]分 酸用量／g 一一 16．26 16．61 17．86 18．96 20．00 21．45 21．51 20．97 3 结 语 本实验首次用猪肾氨基酰化酶成功地拆分了 混旋的2一氨基丁酸，具体研究了影响酶拆分的因 素．通过对酶拆分方法的改进，在温度为37℃，pH 值为6．8～7．0，底物浓度为0．1mo[／I。，底物与酶 的质量比为100：1，反应时间为24小时，得到了 比旋光度[a]苗=+21．58。，收率为71．8％的(S)一 2一氨基丁酸． 参考文献： [1]奚强，林丫丫，王冲，等．2一氨基丁酸的合成研究[J]． 武汉工程大学学报，2007．29(4)：15—17． [2]白国义，陈立功，邢鹏，等．乙胺丁醇的合成[J]．精细 化工，2004，21(12)：943—945． [3]MamoruW，KazuakiY，YoshihikoH，eta1． Productionofd-aminoacidsbyN——acybd—-aminoacid aminohydrolaseanditsstructureandfunction[J]． JournalofMolecularCatalysisB：Enzymatic，2003， 23：71—85． [4]HidenobuK，NaoyoshiI，YasuhisaA．Enhancement ofthethermostabilityandcatalyticactivityofd- stereospecificamino-acidamidasefromOchrobactrum anthropiSV3bydirectedevolution[J]．Journalof MolecularCatalysisB：Enzymatic，2003，21：283— 290． [53BaekD，SongJ，LeeS，eta1．Newthermostabled- methionineamidasefromBrevibacillusborstelensis BCS-1andits applicationford-phenylalanine production[J]．EnzymeandMicrobialTechnology， 2003，32：131—139． [63何仕国，俞一军，许文松．DL-苯丙氨酸的酶法拆分研 究[J]．化学反应工程与工艺，2004，20(1)：64—69． [7]黄冠华，夏仕文．酶法拆分DL-苯丙氨酸制备n苯丙 氨酸[J]．合成化学，2007，15(1)：69—72． 2 5 8他．强加弘缱 5 5 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 O 0 0 O O O 0 0 ● ● ● ● ● ● ● ● O 0 0 O O 0 O O 万方数据万方数据 第3期 奚强，等：2一氨基丁酸的酶拆分 29 [8]曹军卫，高春东．产氨基酰化酶米曲霉高产菌株的选 育[J]．氨基酸和生物资源，1999，21(3)：20—22． [9]王燕，张凤宝，宋正孝，等．米曲霉菌体光学拆分N一乙 酰一DL-苯甘氨酸的动力学研究[J]．化学工程，2004， 32(2)：33—37． [10]FadnavisNW，SharfuddinM，VadivelS K． Resolutionof2-amino-1一butanolwithimmobilised ’penicillinGacylase[J]．Tetrahedron：Asymmetry． 1999，10(4)：495—500． [11]YajimaT，AizawaY，NishidaM，eta1．Preparation ofopticallyactive2-aminobutanoicacidviaoptical resolutionby replacingcrystallization[J]． BioscieneeBiotechnologyandBiochemistry．2007， 71(5)：1338—1341． [12]颜世利，巴杭，阿吉，等．手性药物拆分方法的研究 口]．新疆师范大学学报(自然科学版)，2004，23(1)： 36—39． [133 [14] [15] [16] [17] [18] [19] 张清玉，谭欣，赵林，等．乙酰一口蛋氨酸消旋工艺的 研究[J]．化学工业与工程，2004，21(2)：91—95． 何俭，蒋岚，张亚静，等．氨基酸的消旋研究[J]．氨基 酸和生物资源，2005，27(3)：55—57． 邵友元，谭圣君，邓冰，等．酶法拆分DL一蛋氨酸工艺 条件的优化控制[J]．食品科技，2006，8：157—159． 张彤。周海梦．锌离子对氨基酰化酶构象及其稳定 性的影响[J]．生物物理学报，1994，10(2)：198— 202． 邹建辉，翁连进，王士斌，等．732阳离子交换树脂吸 附L一组氨酸的特性[J]．化学工程，2006，34(2)：卜 3． 王海龙．崔智慧．岳秀兰．氨基酸薄层层析茚三酮显 色改良[J]．包头医学院学报，2003，19(4)：312— 313． 史黎黎，秦凡．正交设计优化N一乙酰一L_亮氨酸的合 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Qiang， DING You-you， LIN Ya-ya， LI Jun 作者单位： 武汉工程大学化工与制药学院,湖北省新型反应器与绿色化工重点实验室,湖北,武汉,430074 刊名： 武汉工程大学学报 英文刊名： JOURNAL OF WUHAN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 年，卷(期)： 2009,31(3) 参考文献(19条) 1.王燕;张凤宝;宋正孝 米曲霉菌体光学拆分N-乙酰-DL-苯甘氨酸的动力学研究[期刊论文]-化学工程 2004(02) 2.曹军卫;高春东 产氨基酰化酶米曲霉高产菌株的选育 1999(03) 3.黄冠华;夏仕文 酶法拆分DL-苯丙氨酸制备D-苯丙氨酸[期刊论文]-合成化学 2007(01) 4.何仕国;俞一军;许文松 DL-苯丙氨酸的酶法拆分研究[期刊论文]-化学反应工程与工艺 2004(01) 5.Baek D;Song J;Lee S;et a1 New thermostable d-methionine amidase from Brevibacillus borstelensis BCS-1 and its application for d-phenylalanine production[外文期刊] 2003(1) 6.Hidenobu K;Naoyoshi I;Yasuhisa A Enhancement of the thermostability and catalytic activity of d- stereospecific amino-acid amidase from Ochrobactrum anthropi SV3 by directed evolution[外文期刊] 2003(4/6) 7.Mamoru W;Kazuaki Y;Yoshihiko H;et a1 Production of d-amino acids by N-acybd-amino acid amino hydrolase and its structure and function[外文期刊] 2003(2/6) 8.白国义;陈立功;邢鹏 乙胺丁醇的合成[期刊论文]-精细化工 2004(12) 9.史黎黎;秦凡 正交设计优化N-乙酰-L-亮氨酸的合成研究[期刊论文]-江汉大学学报（自然科学版） 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