实验二血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定by陈蔚文

null实验二 血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定实验二 血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定null层析技术 实验原理 实验思路 实验及操作注意事项层 析 技 术层 析 技 术1．层析法：又称色谱法，是一种广泛运用的物质分离纯化、鉴定技术.2. 依据：混合物中各组分的理化性质差异—吸附力、分子形状、大小、酸碱性或分子极性、分子亲和力以及分配系数。2. 依据：混合物中各组分的理化性质差异—吸附力、分子形状、大小、酸碱性或分子极性、分子亲和力以及分配系数。固定相—固定不动 流动相—对固定相作单向相对运动，推动样品中各组分通过固定相向前移动。各组分理化性质不同，对流动相和固定相具有不同的作用力，因此在流动相推动样品通过固定相的过程中，通过不断地吸附、解吸、吸附、解吸作用，造成混合物中各组分在固定相中的迁移距离不等，达到分离。固定相—固定不动 流动相—对固定相作单向相对运动，推动样品中各组分通过固定相向前移动。各组分理化性质不同，对流动相和固定相具有不同的作用力，因此在流动相推动样品通过固定相的过程中，通过不断地吸附、解吸、吸附、解吸作用，造成混合物中各组分在固定相中的迁移距离不等，达到分离。3．基本原理：固定相和流动相4．分类： ①流动相的物理状态：气相和液相 → 气液/固，液固/液 ②方式：纸、薄层、柱 ③原理：吸附、分配、凝胶、离子交换、亲和、金属螯合、疏水、反相4．分类： ①流动相的物理状态：气相和液相 → 气液/固，液固/液 ②方式：纸、薄层、柱 ③原理：吸附、分配、凝胶、离子交换、亲和、金属螯合、疏水、反相5．凝胶层析 (凝胶过滤、凝胶色谱、分子筛层析、分子排阻层析) ①定义：指混合物随流动相流经固定相的层析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。5．凝胶层析 (凝胶过滤、凝胶色谱、分子筛层析、分子排阻层析) ①定义：指混合物随流动相流经固定相的层析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。②基本原理： 固定相：凝胶，惰性三维空间多孔网状结构，故称分子筛，包括琼脂糖、交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖-葡聚糖复合凝胶。 流动相：洗脱液②基本原理： 固定相：凝胶，惰性三维空间多孔网状结构，故称分子筛，包括琼脂糖、交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖-葡聚糖复合凝胶。 流动相：洗脱液null交联葡聚糖凝胶多聚葡萄糖与环氧丙烷交联而成，网状结构珠状颗粒，商品名为Sephadex G系列 G—交联度：G后面的阿拉伯数字表示不同的规格型号，有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200八种，具体含义为凝胶得水值的10倍或吸水量（g）/10g干胶 交联度与孔径大小成反比：交联度越大，孔径越小，吸水性小；交联度越小，孔径越大，吸水性大。因此，“G”反映凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。null长链状葡聚糖分子间以环氧丙烷连接凝胶层析的基本原理凝胶层析的基本原理样品加于柱上，样品随洗脱液的流动而向下移动，同时作垂直向下运动和不定向扩散运动→小分子可进入凝胶空内部，流程长，速度慢，后流出；大分子不能进入凝胶空内部，颗粒间移动，流程短，先流出→大小分子彼此分开 nulll 分子大小不同混合物上柱； 2 洗脱开始，小分子扩散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；3 大小分子分开： 4大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中null数学模型 Vi—凝胶孔内水（内水） Vo—颗粒间水（外水） Vg—凝胶体积 总体积Vt= Vi +Vo+VgnullKd—分配系数：精确衡量混合物中某一待分离成分在凝胶柱内的洗脱行为，反映物质分子进入凝胶颗粒的程度，是溶质分子大小的一个函数 Ve—洗脱体积：分离物被洗脱时所用的洗脱液体积 Ve=Vo+Kd·Vi 洗脱曲线：以洗脱体积为横坐标，各物质浓度/吸光度为纵坐标作图null（1）完全被排阻的极端大分子，Ve=Vo，Kd=0 （2）中等分子，Ve=Vo+Kd·Vi，01nullnull③影响因素 *层析柱的选择及装填： 柱大小—分离样品量 凝胶型号—分辨率：各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。凝胶分离范围之外的分子，难以分离。如大小不同的两种全排阻分子/完全渗透分子。 *洗脱液：溶解待分离物质，不变性 *加样量：1%～5% *凝胶的再生null交联葡聚糖凝胶层析介质的有关技术参数实验原理实验原理透析及超滤法 盐析、有机溶剂/免疫沉淀 电泳 凝胶层析 离子交换层析 超离心共性： *生命高分子：透析、超滤、超离心、凝胶层析 *蛋白质溶液是亲水胶体：稳定因素为水化膜和电荷→盐析/有机溶剂沉淀 *两性电解质和等电点：pH> pI，蛋白质带负电；反之带正电→电泳、离子交换层析 *有一定的功能：抗原性→ 免疫沉淀 个性：蛋白质的分子量、等电点、亲水程度、形状不同共性： *生命高分子：透析、超滤、超离心、凝胶层析 *蛋白质溶液是亲水胶体：稳定因素为水化膜和电荷→盐析/有机溶剂沉淀 *两性电解质和等电点：pH> pI，蛋白质带负电；反之带正电→电泳、离子交换层析 *有一定的功能：抗原性→ 免疫沉淀 个性：蛋白质的分子量、等电点、亲水程度、形状不同分离依据：蛋白质理化性质的和个性null实验思路实验思路分段盐析去除杂蛋白凝胶层析脱盐交联葡聚糖吸水浓缩醋酸纤维素薄膜电泳鉴定上午完成下午完成先粗后细null①分段盐析： 常用中性盐：硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。 硫酸铵：温度系数小，溶解度大，蛋白谱广，分段盐析效果好，不易引起变性。溶液pH约4.5～5.5，可用硫酸/氨水按需要调节pH值。 分段盐析：各种蛋白大小、亲水程度、pI不同，所需的盐浓度、pH也不一样。如清蛋白分子小，亲水性强，需高盐浓度才沉淀，球蛋白分子大，亲水性弱，较低盐浓度即可沉淀。因此调节盐浓度及pH可使各种蛋白质分段沉淀。实验流程及操作注意事项影响因素： ①温度：温度与溶解度成正比。一般室温即可,少数温度敏感型蛋白质需4度操作，而血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白在25度比0度时溶解度低，更易盐析。 ②pH值：大多数蛋白质在pI时溶解度最低。pH=pI效果更好。 ③蛋白质浓度：浓度高时产生共沉。盐析前血清加等量生理盐水稀释，控制蛋白质含量在2.5-3.0%。影响因素： ①温度：温度与溶解度成正比。一般室温即可,少数温度敏感型蛋白质需4度操作，而血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白在25度比0度时溶解度低，更易盐析。 ②pH值：大多数蛋白质在pI时溶解度最低。pH=pI效果更好。 ③蛋白质浓度：浓度高时产生共沉。盐析前血清加等量生理盐水稀释，控制蛋白质含量在2.5-3.0%。②凝胶层析脱盐：常用透析，需时较长，最好低温。也可用葡萄糖凝胶G-25/50过柱，用时较短。 固定相：sephadex G-25 流动相：pH7.4的0.01M磷酸盐缓冲液（0.9%NaCl） 原理同前，蛋白质大分子，硫酸铵小分子。 ②凝胶层析脱盐：常用透析，需时较长，最好低温。也可用葡萄糖凝胶G-25/50过柱，用时较短。 固定相：sephadex G-25 流动相：pH7.4的0.01M磷酸盐缓冲液（0.9%NaCl） 原理同前，蛋白质大分子，硫酸铵小分子。 ③浓缩：sephadex G-25吸水，利用高分子性质。③浓缩：sephadex G-25吸水，利用高分子性质。注意事项： 1．硫酸铵的滴加，边摇边逐滴加入 2．流洗柱子：3～4个柱长 3．上样：转圈滴加，起跑线一致 4．防止柱上液层干涸 5．洗脱液收集无需分部，用载玻片

检测

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蛋白，无纳氏试剂 6．G-25干胶用纸条少量多次加入，液层高<0.5ml 7. 用过的G-25干胶倒入收集缸，回收利用。注意事项： 1．硫酸铵的滴加，边摇边逐滴加入 2．流洗柱子：3～4个柱长 3．上样：转圈滴加，起跑线一致 4．防止柱上液层干涸 5．洗脱液收集无需分部，用载玻片检测蛋白，无纳氏试剂 6．G-25干胶用纸条少量多次加入，液层高<0.5ml 7. 用过的G-25干胶倒入收集缸，回收利用。④鉴定：醋酸纤维素薄膜电泳 ④鉴定：醋酸纤维素薄膜电泳 电泳：带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。 电泳技术：利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。 电泳系统：电泳支持介质、电泳缓冲液、电场null COO- COO- COOH ╱ + H+ ╱ + H+ ╱ Pr ←————→ Pr ←————→ Pr ╲ + OH- ╲ + OH- ╲ NH2 NH3+ NH3+ PH>PI PH=PI PH