肝损伤实验报告

急性肝损伤对药物作用的影响 实验组成员 学号 专业班级 得分 【目的】1、学习制作CCl4肝损伤模型。 2、观察肝损伤时对地西泮药效的影响。 3、观察肝损伤时肝脏大体病理形态的改变。 4、检测肝损伤时肝脏谷丙转氨酶（ALT）的活性。 【器材】紫外可见光分光光度计1台，恒温振荡水浴器1台，台式高速离心机1台，小鼠笼及饮水瓶2套，组织剪1把， 1ml注射器3只，250ml烧杯1只，一次性试管（5ml）6支，试管架4个，1.5mlEP管8个，苦味酸1瓶，冰块1盆，鼠料1包，垫料1包。 【药品】20% CCl4溶液，地西泮注射液，ALT（谷丙转氨酶）检测试剂盒，生理盐水200ml，蒸馏水100ml。 【动物】雄性昆明小鼠8只，体重25~30克。 【方法】每组4只小白鼠，饲养于同一鼠笼中。2只作为对照；2只作为CCL4肝损伤模型动物，以苦味酸号标记。 1、CCl4肝损伤动物模型的制作： 模型组小白鼠腹腔注射0.1ml/10g 的20%CCl4溶液 ，对照组小白鼠腹腔注射0.1ml/10g的生理盐水。饲养过夜。 2、CCl4肝损伤对地西泮催眠作用的影响： 24h后， 取对照组和模型组小白鼠各1只，分别腹腔注射5mg/ml地西泮50mg/kg。观察并记录其入睡时间（翻正反射消失时间）。 3、肝脏大体病理形态观察： 入睡小鼠颈椎脱臼处死，取肝脏，观察大体病理形态（颜色、结构等变化）。 4、血清制备：取对照组和模型组小白鼠各2只，断头取血，收集到EP管中，静置10分钟，4000rpm离心10分钟，取上清50ul，稀释10倍为待测样品。 5、血清ALT测定： 空白管 管 样品管 基质液（ul） 250 250 250 标准液（ul） — 50 — 样 品（ul） — — 50 蒸馏水（ul） 50 — — 混合后，37 ℃水浴30min 加显色剂250ul 37 ℃水浴20min 加0.4N NaOH 2.5ml 室温放置3min，510nm比色测定 ALT活性计算公式： C样=（A样/A标）× C标 C：浓度（活性单位U/L），A：吸光度值 ， C标为100 U/L 【结果】 1、CCl4肝损伤对地西泮催眠作用的影响（数据以x±s示，做组间t检验） 实验组别 地西泮入睡时间（S） 生理盐水组 215.40±70.47 CCl4肝损伤组 59.35±14.89 t检验过程: （1）建立检验假设，确定检验标准 H0：μ1=μ2,两组不同处理实验小鼠注地西泮后入睡时间的总体均数相同 H1：μ1≠μ2,两组不同处理实验小鼠注地西泮后入睡时间的总体均数不相同 ɑ=0.05 （2） 计算检验统计量 由原始数据计算得： n1=20,∑X1=4308 ∑X²1=1027254 ¯X1=215.4 n2=20,∑X2=1187 ∑X²274885 ¯X2=59.35 运用统计学公式计算得： S²c=(n1-1)S²2+(n2-1)S²2/（n1+n2-2）=2730.19 S¯x1-¯x2=16.5233 算得 t=|¯X1-¯X2|/S¯x1-¯x2=9.444 (3) 确定P值，作出推断结论 V=n1+n2-2=38；查t界值表得，t0.05/2,38=2.024,t0.01/2,38=2.712, 本例t> t0.01/2,38,P<0.01，差异有统计学意义,拒绝H0，接受H1，故可认为CCl4肝损伤对地西泮催眠作用有影响。 2、CCl4肝损伤小鼠肝脏大体病理改变特征（简单描述）： 肝脏体积增大，肝被膜紧张，表面凹凸不平，呈现颗粒样变，同时表面充血，有油腻感，呈脂肪样变。 3、CCl4肝损伤对肝脏ALT 活性的影响（数据以x±s表示，做组间t检验） 实验组别 ALT活性（U/L） 生理盐水组 18.045±5.603 CCl4肝损伤组 267.348±15.746 t检验过程: （1）建立检验假设，确定检验标准 H0：μ1=μ2 ,两组不同处理实验小鼠的ALT活性与总体均数相同 H1：μ1≠μ2 ,两组不同处理实验小鼠的ALT活性与总体均数不相同 ɑ=0.05 （3） 计算检验统计量 由原始数据计算得： _ n1=24,∑X1=433.0739，∑X²1=8568.0328 ， X1=18.0447 _ n2 =24,∑X2 =6416.3424，∑X²2=1721343.85， X2 =267.3476 运用统计学公式计算得： S²c=(n1-1)S²1+(n2 -1)S²2 /（n1+n2 -2）=145.7268 _ _ Sx1-x2=3.4848 算得 _ _ _ _ t=|X1-X2 |/Sx1-x2=71.540 (4) 确定P值，作出推断结论 V=n1+n2 -2=46；查t界值表得，按ɑ=0.05的水准拒绝H0，接受H1，差异有统计学意义，故可认为CCl4肝损伤对肝脏ALT 活性有影响。 【思考题】 1、CCl4肝损伤对地西泮的催眠作用有何影响？为什么？ 答：CCl4肝损伤对地西泮的催眠作用为加强作用。 γ-氨基丁酸（GABA ）是一种抑制性突触传递的主要介质，由谷氨酸脱梭酶作用于谷氨酸盐而合成，血浆中GABA 主要来源于肠道菌群，并在肝脏分解。GABA通过激活GABA 受体，使氯离子内流增加，致使突触后膜超极化，引起神经抑制而达到镇静作用。GABA 存在高亲和力GABAa 和低亲和力GABAb 两种亚型，肝脏疾病严重时GABA 调控因子对GABAa 受体高亲和力部位的抑制被解除，从而激活GABAa 受体，促进GABA 与受体结合，使氯离子通道开放，增加GABA 的突触后膜抑制功能，打破脑干网状结构唤醒机制，产生中枢抑制效应。当突触前神经元兴奋时，GABA从囊泡中释放，通过突触间隙与突出后神经元细胞膜上的ＧＡＢＡ受体结合，使细胞膜对Cl通透性增高，由于细胞外的Ｃl浓度比细胞内高，因而，Cl由细胞外进入细胞内，产生超极化，从而发挥突出后的抑制作用。同时也有突出前的抑制作用，只是由于当GABA作用于突出前的轴突末梢时，也可使轴突膜对Cl通透性增高，由于，轴浆内浓度高于轴突，因而，Cl反向轴突内流向轴突外，进而产生去极化，使末梢在冲动到来时，释放神经递质量减少，从而产生突触前抑制作用。综上所述，CCL4肝损伤对地西泮的催眠作用为加强作用。 2、肝脏出现上述大体病理改变的原因？ 答：大体观察 肝脏体积增大，肝被膜紧张，表面凹凸不平，呈现颗粒样变，同时表面充血，有油腻感，呈脂肪样变。 病变发生机制四氯化碳为一种化学药物，进入人体后，经由肝脏代谢后形成由强毒性的自由基CCl3.和Cl.，破坏细胞膜的结构，导致膜通透性增加，钠 -钾泵功能障碍，细胞内钠离子增多，水分增加。 CCl4是一种有毒的环境生物损害剂，在肝氧化代谢中可产生三氯甲基自由基，继而攻击脂质细胞膜，造成肝细胞脂质过氧化性损伤。CCl4可使小鼠血浆转氨酶活力明显上升，同时肝匀浆脂质过氧化产物MDA含量明显增加。四氯化碳、可干扰脂蛋白的合成与转运，形成脂肪肝。 3、CCl4肝损伤时肝脏ALT活性有何变化？为什么？ 答：CCl4肝损伤时肝脏ALT活性增强。 CCl4 肝毒作用机制是自由基的形成及引发的链式过氧化反应。CCl4在体内可经肝微粒体细胞色素P450 代谢激活,生成两个活性自由基(CCl3O2 和Cl) 及一系列氧活性物,可与肝细胞质膜或亚细胞结构的膜脂质发生过氧化反应,膜磷脂大量降解,从而破坏细胞膜结构完整性,引起膜通透性增加,最终导致肝细胞死亡。 ALT是反映肝细胞损伤和线粒体膜损伤的重要指标，主要存在于细胞的可溶部分，正常情况下血清ALT活性极低，当肝细胞损伤时膜通透性增大，ALT释放入血而导致升高。