新抗生素和糖尿病治疗药物开发的靶标——葡糖胺-6-磷酸合酶

·472· 文章编号：1000—1336(2008)04-0472-05 《生命的化学》2008年28卷4期 CHEMIsTRYoFuFE-2008，28(4)．!曼!旦业皇!堕型璺翌垡竺型型旦皇 新抗生素和糖尿病治疗药物开发的靶标——葡糖胺-6-磷酸合酶 费良润，吴宗辉。 王洪海3 谢建平1·， (1西南大学生命科学学院现代生物医药研究所，重庆400715；2西南大学校医院，重庆400715；3复旦大学生命科学学院，遗传学研究所，遗传工 程国家重点实验室，上海200433) 摘要：葡糖胺一6一磷酸合酶催化氨基己糖代谢和细胞壁合成的第一步反应，即利用D．果糖．6一磷酸和L一谷氨酰胺生 成衙糖胺一6一磷酸和谷氨酸，该途径的终产物N一乙酰葡糖胺是细菌和真菌细胞壁构建的基本成分。真菌、昆虫和 甲壳类动物的几丁质，哺乳动物的糖蛋白和黏多糖都是通过N．乙酰葡塘胺最终合成的。葡塘胺一6一磷酸合酶是一 个胰岛素调节酶，介导II型糖尿病的胰岛素抵抗。因此葡糖胺一6．磷酸合酶被认为是开发抗细菌、抗真菌、治疗II 型糖尿病及其相关并发症等疾病的药物的分子靶标。 关键词：葡糖胺．6．磷酸合酶；抗生素；分子靶标 中图分类号：Q936 1．葡糖胺一6一磷酸合酶的基本概述 葡糖胺一6一磷酸合酶(glucosamine一6-phosphate synthase，GImS；EC2．6．1．16)在细菌、真菌、哺乳动物 中分别称GlmS、GFA、GFAT[11，本文中统一使用GlmS。 至少有40种原核生物、7种真核生物和1种滤过性病 毒序列编码该酶。GlmS是一种相对较大的蛋白质，研 究发现，酵母的肽链最长，有716个氨基酸残基(aa)； Methanobacterium的最短，有589个aa[¨。从GenBank 数据库中获得不同种类生物GImS蛋白质序列，进行 比对获得系统进化树，发现各种生物GlmS具有较高 的同源性，与已有研究一致啦'3】，明该酶在原核生 物、真菌、植物、昆虫和高等生物中高度保守。天 然的GlmS结构和分子大小存在差别：原核生物中由 两个相同弧基形成二聚体，分子量为130-150kDa； 真核生物和哺乳动物中都是四聚体结构，分子量分 别为320—340kDa和340-360kDa。GImS是偏酸性蛋 白质，其pH值介于4．1-5．0t¨。大肠杆菌(Escherichia 收稿日期：2008—04·12 作者简介：费良润(1982一)，女，硕士生， E-mail： feilr@swu．edu．eta；吴宗辉(1967-)，男，剐主任医师，E—mail： zhwu@sina．com．cn；王洪海(1945．)，男，教授，博士生导 师，E-mail：hhwang@fudan．edu．cn；谢建平(197l一)，男，博 士，教授，博士生导师，联系作者，E—mail：georgex@swu．edu． Cn coli)的GlmS由608个aa组成，由约67kDa单体组成 的130kDa同型二聚体。白念珠菌(Candidaalbicans) 的GlmS含712个aa，由约79kDa单体形成的320kDa 的同型四聚体【4—1。节肢动物硬蜱长角血蜱 (Haemaphysalislongicornis)的GlmS有696个aa，分子 量为78．4kDat扪。人有两个不同GlmS(GFATl和 GFAT2)，其中GFATl包含681个aa，在Ecoli中表 达产生分子量约306kDa的同型四聚体蛋白质【们。 GlmS催化D一果糖一6．磷酸(F-6一P)和厶谷氨酰胺 (Gin)生成葡糖胺一6一磷酸和谷氨酸，是氨基己糖代谢 和细胞壁合成反应的第一步反应，是不可逆限速反 应。该途径终产物N-乙酰．D．葡糖胺(GIcNAc)是细菌 和真菌细胞壁构建的基本成分。真菌、昆虫和甲壳 类动物的几丁质，哺乳动物的糖蛋白和粘多糖都是 通过GIcNAc最终合成的。氨基糖作为细胞壁的前 体，对细胞生长非常重要。在没有GlcN和GIcNAc下 培养GlmS缺失突变株，会快速失去细胞生长能力并 裂解。该酶对细菌和真菌形态的维持也起着非常重 要的作用，过表达黑曲霉GlmS可增强胞壁耐受外界 压力的能力。在哺乳动物中，其生理重要性就更复 杂，但该酶被抑制不会致死整个生物，其活性因组 织而异(I'3’7J。 2．葡糖胺一6一磷酸合酶的结构特征 GImS属于酰胺转移酶家族成员，其肽链折叠成 万方数据 ●生化与医学 《生命的化学》2008年28卷4期 CHEMISTRYOFLIFE2008，28(4) 两个不同功能结构域(图1)。研究最为清楚的是E． coli的GImS，其N一端由aa1-239组成约30kDa(GAH)， C一端由aa249-608组成约40kDa异构酶区域(ISOM)。 N一端半胱氨酸位于分子表面D-链浅缝的开端，参与 底物结合和催化的其他aa位于连接p链的环中。其 中Q环(73～80aa)尤为重要，它在结合Gin后盖住活 性位点使其与溶剂隔开【8】。真核生物C．albicans的 两个结构域分别位子aa1-345、346-712，Q环由aa98- 103组成，两ISOM相互作用负责GlmS同型四聚体结 构的形成，GAH不参与蛋白寡聚体的形成【9l。虽原 核生物和真核生物GlmS结构、拓扑学活性位点和催 化机制都不一样，但不同来源GImS初级结构中起关 键作用的位点和aa序列是一样的，各GImSaa序列 进行比对(图2)n1，可以看出，它们存在一些非常保 守的序列和位点。 GImSGAH催化Gin水解成谷氨酸和氨，ISOM利 用氨将F-6．P转化成GlcN．6．P。这个反应被认为先生 成果糖胺一6一磷酸然后再异构化形成GIcN一6一P。GImS 在氨基转移时不接受外源氨为氮源，它需要Gin的 图1GImS单体的立体图181 ·473· 氨并与果糖胺的C一2紧密结合。GlmS不能利用外源 的氨作为氮受体，这可能与它天然的四级结构有关m—o／。 GlmS两个功能结构域，通过胰凝乳蛋白酶水解 分开或者单独表达时，仍然保持单独底物结合能力 及酶催化活性。通过X(射)线衍射分析E．coliGImS 两个结构域与不同物质形成的复合体并研究其三维 结构，包括GAH．谷氨酸复合体(PDB代码1GDO)、 GAH一丫-谷氨酰基氧肟酸盐复合体(PDB代码1GMS) ISOM—GlcN-6-P复合体(PDB代码1MOQ)，ISOM一2-氨 基·2一葡萄糖醇．6一磷酸复合体(PDB代码1MOS)ISOM- 葡萄糖一6·磷酸复合体(PDB代码IMOR)GImS．葡萄 糖一6一磷酸复合体(PDB代码1JXA)，GImS．葡萄糖一6． 磷酸一5-氧一L正亮氨酸复合体(PDB代码2J6H)，GlmS— F-6一P复合体(PDB代码)。这些复合体结构表明Gin的 水解机制是N．端亲和型，且其水解依赖于F．6．P的 异构化，通过烯醇／烯二醇中间体完成，其作用类 似于磷酸丙糖异构酶[8,11-13】。 GImSISOM的活性位点在进化时通过复制随后 二聚体化形成的。通过His504催化环化-开环步骤及 Glu懈将底物Cl的质子转移到C2上，F一6一P可能与GlmS 的Lys603形成希夫碱。高度保守的C-端可能在底物 结合、催化及GAH通讯中起着关键作用，相应的序 列模式DXPXXLAK[SC]VT可能是GImS的指纹[11J。E coliGImS有一系列对其催化作用重要的保守残基或 序础C1，Y25GYD29，R73wATHG78，H黼，H97NG99，D123， C300，S347QSGET352，E481GALKLKE4髂，K503HG505和 P598RNLAK603，这些残基恰好负责识别、结合底物以 及催化Gln水解成氨，形成酶催化活性位点，从丽 完成整个催化反应[8,10,12,131。 真核生物的GlmS在C-端和N．端区域之间含额 外的结构域。例如CalbicansGImSaa218～283，该 区域没有特异的功能，但它的缺失会强烈破坏功能 结构域问的通讯和信号传输[9,12,131。 最近的研究表明反馈抑制剂UDP—GlcNAc能结 合ISOM或Ser208残基，影响GAH的氨基水解酶活性， 进而影响全酶的活性。Calbicans的疏水残基Trp97 是连接两个功能结构域作用通道的分子门，aa702～ 709对该通道也起着很重要的作用，它能减少分子门 的大小，当aa7ll发生突变时该通道将会被阻断一1。 利用具多底物抑制特性的化合物AP3(1)，AP4 (2)，AP5(3)，AP6(4)，AP7(5)和CGSl9755(6)为探针， 万方数据 ·474· 《生命的化学》2008年28卷4期 CHEMISTRYOFLIFE2008，28(4) 图2GlmS氨基酸序列多重比对Il】 测定CalbicansGImS磷酸结合位点和氨基酸结合位 点的距离、GmlS两活性位点的二维空间图谱(图3)。 氨基酸的0【一C与膦酸盐的0c—P距离的关系，表明链长 越短，其化合物的抑制活性越好。同时发现Gin结 合位点可以耐受大量的基团，哌啶环的疏水性增强 该位点的结合力，也证明r两个位点的距离约为3A 表明将来多底物抑制剂的合成也可通过形成希夫碱 与赖氨酸残基结合帮助测定异构酶活性位点中Lys 与Gln活性位点的距引11】。 3．葡糖胺．6一磷酸合酶的稳定性 GlmS是普遍存在的酶，但它很不稳定，因此 图3葡糖胺-6一合酶活性位点的二维图【¨I 万方数据 ●生化与医学 《生命的化学》2008年28卷4期 CHEMISTRYOFLIFE2008，28(4) GlmS一般要通过过表达并采用合适的方法才能得 到。纯化真核生物的GlmS是一件很困难的事情，因 为在真核细胞胞质蛋白库中该酶仅占很小一部分， 因此过表达蛋白可能是有效纯化该酶的方法15]。在 Ecoli中构建Calbicans的GlmS基因使其产量比野 生型提高50～100倍。三种带His6标签的Calbicans 的GImS，其酰氨水解酶活性与野生型的差不多，但 仅有18％的己糖磷酸异构酶活性和约1．5％的合成活 性【4j】。人的GlmS在Ecoli中表达带His6标签的蛋白 质，其活性比以往报道的人肝脏中该酶活性高6000 倍【6】。嗜热菌(Thermusthermophilus)的GImS(GImSm) 的二聚体在70oC表现出最佳的活性，在80oC时半 寿期仍有90分钟。在氯化胍和尿素中解离GImS出，与 其单体一样没有活性【141。 4．葡糖胺一6．磷酸合酶作为分子靶标筛选抗生素 真菌感染是现代医学中的难题，然而只有很少 一些抗真菌药物应用于临床。因此不仅要在现有药 物基础上改良药物，也迫切需要寻找新的药靶。不 幸的是，真菌和人类都是真核生物，所以要获得真 菌的选择性毒性不是个简单的事情。真菌和哺乳动 物最重要的区别在于真菌存在细胞壁，因此，参与 形成细胞壁途径中的酶成为潜在的抗真菌药物的药 靶【151。 GImS很早就被鉴定为一个新的抗菌试剂的靶 标。其存在于所有的细胞中，葡糖胺-6．磷酸是该酶 的产物，对细菌、真菌和动物，包括人在内都是必 不可少的。有研究表明在病原体中短期失活GImS对 真菌细胞都是致死的(它可以诱发形态改变、胶合和 裂解)。由于哺乳动物的寿命比真菌长，因此短时间 损耗氨基糖库不会致死，因为GImS有较长半寿期， 并且能快速表达编码该酶的基因【151。由图2可以看 出，各种生物该酶的活性序列和位点都很保守，可 用来设计特异抑制剂，开发潜在抗细菌，抗真菌药 物并获得选择性毒性的药物。 随着一线抗结核药物的治疗的效果下降， 抗药性广泛蔓延，迫切需要开发新的治疗结核病的 药物。乐军等【161通过研究结核分枝杆菌异烟肼耐药 菌株与敏感菌株蛋白质表达的差异，发现异烟肼耐 药菌株中细胞壁蛋白GImS表达量提高，由此推测 GlmS与耐药性相关。因此可将GImS作为开发抗生素 的一个分子靶标。 ·475· 哺乳动物细胞中，GlmS控制着葡萄糖到己糖胺 途径的流量，催化糖蛋白和糖脂生成必须的底物， 在葡萄糖平衡调节中起着重要的作用。当葡萄糖代 谢提高时，通过己糖途径导致胰岛素抵抗，削弱胰 岛素的分泌，引发糖尿病性肾病变。在转基因动物 骨骼肌中过表达GlmS会产生胰岛素抵抗，使肝内合 成过多脂肪酸，B细胞分泌过多胰岛素导致血(内)胰 岛素过多症，长期这样就可能导致肥胖、高脂血症、 D细胞衰竭、型糖尿病和高血糖症。因此GlmS被认 为是治疗II型糖尿病及相关并发症很有吸引力的分 子靶标[1,17,181。 到目前为止，已报道有GlmS抑制剂，包括天然 的和合成的，都表现出抗细菌和抗真菌活性，大多 数是活性位点定向烷基化的谷氨酰胺类似物。已经 有特异的针对GlmS的抗真菌物质，如Ⅳ一3一(4- methoxyfumaroyl)-(S)一2，3-diaminopropanoicacid(FMDP)， 2-amino-2一deoxy-D-glucitol一6-phosphate(ADGP)．N7- trans—epoxy—succinamoyl-I，2-3一diaminopropanoicacid (EADP)及其类似物【19，20]。Floquet等皿11通过模拟筛选， 从50，000个化合物中筛选到14个具有抑制细菌GlcN． 6-P合酶活性的物质。 提坦菌素是第一个被认可的GlmS的选择性抑制 剂，但研究最多的是具广谱抗菌活性的活性位点定 向失活剂FMDP和EADP，这两个抑制剂都共价结合 GImS，失活该酶N一端Gln结合位点。FMDP在体外 对哺乳动物细胞和老鼠没有毒性，但对实验的念珠 菌病有效[14,21】。 Zthermophilus的GlmS血、Ecoli的GlmS与特异 单克隆抗体Gin结合位点线性抗原决定簇(RWATHG) 进行抗原交叉反应，发现Ecoli的GImS与mAbs没 有交叉反应。E。coliGImS有效的谷氨酰胺位点定向 亲合标签6-diazo-5一oxo-L-norleucin和methoxyfumaroyl— L一2，3-diaminopropionicacid的抑制常数在测试GImS血 时减少2—3个数量级，而F一6一P位点有效的竞争性 抑制荆2-amino-2一deoxycarglucitol一6-P的抑制作用不受 影响【14】。 GlmS在二聚体状态下才具有活性，导致GlmSm 结构和功能受限，构象挠性减少。DON和FMDP是 Zthermophilus和EcoliGlmS时间依赖性的抑制剂， GImS出的抑制常数随时问急剧增大(160—400倍)，失 活率减少(2—20倍)【14I。 万方数据 ·476· CH《生EM命I的ST化RY学O》F200LIF8E年220808卷428期(4)!曼堕虫皇竺堕型璺Qs!堂皇型型旦皇． 一 =_===：===二2=====二=二 5．利用葡糖胺．6．磷酸合酶提高葡糖胺生产 由于葡糖胺是粘多糖的前体，可用于修复维持 软骨和关节的健康，临床上被用于治疗关节炎，也 逐渐用于补充膳食。而现在大多数是通过提取和酸 水解甲壳类废弃物而得到，且产量很有限，并带有 潜在的甲壳类动物蛋白污染。由于真核生物GlmS严 重受其代谢产物GlcN一6一P的抑制，同时也受到UDP． GIcNAc的抑制，然而细菌的GlmS对UDP．GIcNAc的 抑制不敏感，因此通过代谢工程的途径在细菌中过 表达细菌GlmS，使GIcN一6一P和UDP—GlcNAc对其的抑 制作用降低，同时失活分解代谢的基因，可提高葡 糖胺产量，解决现在的葡糖胺生产中存在的问题 【221。 制， 分， 综上所述，进一步研究GlmS及其相应作用机 抑制剂和代谢途径，不仅仅是基础科学的一部 而且可以推动医学和工业的前进。 参考文献 【1】MilewskiS．BiochimBiophysActa，2002，1597：173—192 f2】XiaoHHeta1．Int-，Parasitol，2007，37：383·392 【3】RamAFJeta1．Microbiol，2004，150：3315·3326 【4】SachadynPeta1．ProteinExprPurif,2000，19：343—349 【5】OlchowyJeta1．ProteinExprPurif,2006，46：309·315 【6】RichezCeta1．ProteinExprPurif,2007，54：45·53 【7】VoglerAPeta1．JBacteriol，1989，17l(12)：6586—6592 181TeplyakovAeta1．JMolBi01．2001，313：1093-1102 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400715，China；3StateKeyIab0哟loqofGeneticEngineering,InstituteofGenetics，SchoolofLifeSciences，FudanUniversity，Shaaghai200433，China) AbstractGlucosamine一6-phosphatesynthasecatalysesthefollowingreaction：L—glutamine+D-fruetose一6一phosphate一口 glucosamine·6一phosphate+L-glutamate，thereactioninvolvingammoniatransferandsugarphosphateisomerization．This irreversiblereactionisthefirststepinhexosaminebiosynthesis，leadingtotheformationofuridine5'-diphospho—N—acetyl—D- glucosamine，nllactivatedprecursorofnumerousaminosugar—containingbiomacromolecules，includingchitinandmannoprotein infungi，peptidoglycanandlipopolysaccharidesinbacteria，andglycoproteinandinmammals．Thissynthaseisanimportant pointofmetaboliccontrolofaminosugarbiosynthesis，andthemammalianenzymeissupposedtobeinflictedinphenomenon ofhexosamine—inducedinsulinresistanceindiabetes．Soglucosamine·6-phosphatesynthasehasbeenproposedasanewmoleca— lartargetforantibacterial，antifungalandtreatingdiabetes． Keywordsglucosamine—-6·，phosphatesynthase；antibiotic；moleculartarget 万方数据 新抗生素和糖尿病治疗药物开发的靶标——葡糖胺-6-磷酸合 酶 作者： 费良润， 吴宗辉， 王洪海， 谢建平 作者单位： 费良润(西南大学生命科学学院现代生物医药研究所,重庆,400715)， 吴宗辉(西南大学校医 院,重庆,400715)， 王洪海(复旦大学生命科学学院,遗传学研究所,遗传工程国家重点实验 室,上海,200433)， 谢建平(西南大学生命科学学院现代生物医药研究所,重庆,400715;复旦 大学生命科学学院,遗传学研究所,遗传工程国家重点实验室,上海,200433) 刊名： 生命的化学 英文刊名： CHEMISTRY OF LIFE 年，卷(期)： 2008,28(4) 参考文献(22条) 1.Olchowy J 查看详情 2007 2.Teplyakov A Channeling of ammonia in glucosamine-6-phosphate synthase[外文期刊] 2001(5) 3.Vogler A P 查看详情 1989(12) 4.Richez C 查看详情 2007 5.Olchowy J Construction, purification, and functional characterization of His-tagged Candida albicans glucosamine-6-phosphate synthase expressed in Escherichia coli[外文期刊] 2006(2) 6.Sachadyn P Purification to homogeneity of Candida albicans glucosamine-6-phosphate synthase overexpressed in Escherichia coli[外文期刊] 2000(3) 7.Ram A F J 查看详情 2004 8.Xiao H H 查看详情 2007 9.Deng M D Directed evolution and characterization of Escherichia coli glucosamine synthase[外文期刊 ] 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