激光辅助孵化联合囊胚培养提高冻胚移植的妊娠率

© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 激光辅助孵化联合囊胚培养提高冻胚移植的妊娠率 周 　平 　曹云霞 　章志国 　丛 　林 　魏兆莲 　巫新春 　安徽医科大学第一附属医院妇产科生殖中心 (安徽 　合肥 ) 　230022 中国图书分类号　R715　　文献标识码　B　　文章编号　100124411 ( 2010) 0120074203 【摘 　要 】　目的 : 冻胚移植与取卵周期新鲜胚胎移植的妊娠率相比仍偏低。该研究是为了探索一种可以提高冻胚移植妊娠 率的方法。方法 : ①将解冻后无移植价值的 30个胚胎 (A组 ) 及取卵周期移植后废弃的 30个胚胎 (B组 ) 作 1% Pronase酶消 化透明带的实验 , 记录残留透明带的厚度并作统计学处理。②在 131个冷冻胚胎移植周期中 , 全部解冻后胚胎立即行激光削薄 透明带辅助孵化 , 并随机分为两组 : C组 , 培养 48 h移植 ; D组 , 培养 2 h后即移植。记录移植胚胎的评分 , 随访两组妊娠结 局 , 比较两组间妊娠率、种植率、早期妊娠流产率。结果 : ①A 组和 B 组透明带厚度平均 ( 19107 ±0184) μm和 ( 19103 ± 0175) μm, P > 0105。经过 Pronase消化后 , A组残留透明带的厚度大于 B组 , 分别为 (13101 ±0188) μm和 (817 ±0173) μm ( P < 0105) , 差异有显著性。②C组 68周期中行早期桑椹或囊胚移植 60周期 , 妊娠 23例 , D组 63周期中行分裂期胚胎移植 60 周期 , 妊娠 14例 , C组和 D组妊娠率分别为 33182%和 22122% , 种植率分别为 2813%和 1515% , 差异有显著性 , P < 0105。C 组内无早期桑椹或囊胚移植的共 6个周期 , 占 11176% , 高于 D组的无胚胎移植率 (4176% , 2个周期 ) , P < 0105。两组早期妊 娠流产率分别为 13104% (3 /23) 和 14128% ( 2 /14) , 无显著性差异 , P > 0105。结论 : 冻融胚胎的透明带与新鲜胚胎相比 , 其硬度增加 , 因此给予冻胚的透明带行激光辅助孵化是必要的。囊胚培养联合激光辅助孵化增加了冻胚移植的妊娠率和种植率 , 这是提高冻胚移植成功率的有效方法。 【关键词 】　冻融胚胎 　胚胎移植 　辅助孵化 Pregnancy ra te of frozen - thawed em bryo tran sfer increa sed by la ser a ssisted ha tch ing and bla stocyst culture ZHOU P ing, CAO Yun - X ia, ZHAN G Zhi - Guo et a l1R eproductive Cen ter, D epartm en t of O bstetrics and Gynecology, the F irst A ff ilia ted Hospita l of A nhu i M ed ica l U niversity, Hefei 230022, A nhu i, Ch ina 〔Abstract〕　O bjective: To exp lore a method to increase the p regnancy rate of frozen - thawed embryo transfer ( FET) 1M ethods: 30 unvalued embryos after thawing ( group A) and 30 disused embryos after transfer ( group B) were put into 1% Pronase medium to digest the pellucid zone, the thickness of residual pellucid zone was recorded and analysed1Among 131 cycles of embryo transfer, embryo after thaw received assisted hatching on the basis of pellucid zone, then were divided into group C ( cultured 48 hours before transfer) and group D ( cultured 2 hours before transfer) 1The score of embryo was recorded, p regnancy outcomes were followed up, and the rates of p regnancy, imp lantation and early abortion were compared between the two group s1Results: There was no significant difference in thickness of pellucid zone between group A [ (19107 ±0184) μm ] and group B [ (19103 ±0175) μm ] ( P > 0105) 1After digestion, the thickness of residual pellucid zone in group A was [ (13101 ±0188) μm ] , which was thicker than that in group B [ (817 ±0173) μm ] ( P < 0105) 1 In group C, 60 cycles of transfer were performed at blastocyst stage, and 23 women (33182% ) got p regnancy; in group D, 60 cycles of transfer were performed at m itotic phase, and 14 women (22122% ) got p regnancy, the rates of imp lantation in group C and group D were 2813% and 1515% , respectively, there was significant difference ( P < 0105) 1The p roportion of cancelled cycles in group C (6 cycles, 11176% ) was significantly higher than that in group D (2 cycles, 4176% ) ( P < 0105) 1There was no significant difference in rate of early abortion be2 tween group C (13104% , 3 /23) and group D (14128% , 2 /14) 1Conclusion: Compared to fresh pellucid zone, the pellucid zone of fro2 zen - thawed embryo is harder, thus assisted hatching of frozen - thawed embryo is necessary, laser assisted hatching and blastocyst culture can increase the rates of p regnancy and imp lantation, which is a effective method to imp rove the success rate of frozen - thawed embryo trans2 fer1 〔Key words〕　Frozen - thawed embryo; Embryo transfer; A ssisted hatching 　　体外受精 - 胚胎移植 ( IVF - ET) 取卵周期胚胎移植的 临床妊娠率达 35% ～40% , 大多数取卵周期有优质胚胎可供 移植 , 并且近半数的周期有可以冷冻保存的胚胎 , 可在自然 排卵周期或激素替代周期中进行冻融胚胎移植 , 提高累积妊 娠率。然而 , 随着体外培养时间的延长、胚胎冷冻和解冻等 使胚胎透明带硬化 , 以及一些未知的因素使透明带增厚等囊 胚不能孵出透明带 , 因而不能着床和在体内进一步发育 , 冷 冻胚胎移植的妊娠率低于取卵周期的妊娠率。采用透明带激 光辅助孵化 (Laser assisted hatching, LAH ) 联合囊胚培养可 提高冻胚移植的妊娠率。 ·47· 中国妇幼保健 2010年第 25卷 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 1　资料与方法 111　一般资料 　2005年 1月在我院生殖中心进行 IVF / ICSI 周期中 , 无移植及冷冻价值的 30个胚胎 (A组 ) 及解冻后无 移植价值的 30个胚胎 (B组 ) , 行蛋白酶消化透明带实验。 并于 2005年 3～12月所有胚胎解冻后行激光透明带削薄辅助 孵化 (LAH) , 随机分组 : C组解冻后行囊胚培养移植 , D组 解冻后 2 h移植。 112　蛋白酶消化透明带法 ( EAH) 　配置 1% p ronase (Mer2 ok, 美国 ) 的 HTF1023 ( SAGE B ioPharma, 美国 ) 作为酶溶 液 , 在 3001皿 ( Falcon, 美国 ) 中做 100μl酶溶液液滴 , 周 围做 50μl大小 ET液液滴 6个 , 盖即用型无菌矿物油 ( SAGE B ioPharma, 美国 ) , 置 37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中 预热。30个废弃的取卵周期胚胎及 30个冻融胚胎分次在体视 镜 ( SMZ800, N ikon) 下被移入酶溶液中 50 sec, 再移入周围 的清洗液中洗 6次 , 以测量软件记录酶消化前及消化后残留 透明带的厚度 , 每个胚胎测量三处后取平均值。 113　超促排卵与胚胎培养、移植 　采用本中心常规〔1〕: 月经第 19～21天给予达菲林 1188 mg皮下注射 , 注射后第 14 天开始 Gonal - F ( Serono, 瑞典 ) /绝经期促性腺激素 (丽珠 , 中国 ) 肌注 , 2个卵泡直径达 18 mm时当天晚 9时注射 Preg2 nyl (O rganon, 荷兰 ) 10 000 IU, 36 h取卵。卵丘复合体经 培养 4～6 h, 与 Puresperm (N idacon Labs, 瑞典 ) 处理后的精 子微滴法受精 (每个卵丘液滴中加入 5～10万条活精子 ) 或 行 ICSI。次日晨检查受精情况 , 受精后 42 h及 66 h分别检查 及记录卵裂球数目和胚胎中碎片的多少 , 以及注意透明带的 厚度。第 3天移植卵裂球数目为 6～8个、碎片少于 20%的胚 胎。剩余的达到以上的胚胎予以冷冻 , 在未妊娠后 3个 月激素替代周期中行 F - ET。 114　胚胎冷冻〔2〕　胚胎移植日 (取卵后第 3天 ) 上午选择 6～8细胞且胞质碎片 ≤20%的剩余胚胎进行冷冻。采用冷冻 试剂盒 (ART - 8014, SAGE Media, USA) , 程序冷冻仪型号 : CL - 3300 (Cryologic, Australia)。操作过程 : 胚胎置含蛋白的 Hepes中清洗 , 室温下立即放入 015 M 丙二醇 ( PROH ) 中 10 m in, 015 M丙二醇 ( PROH) + 012 M蔗糖中 5 m in内装入 麦管 , 20 ℃开始 , - 1 ℃ /m in 速率下降至 - 6 ℃, 维持 1 m in, 植冰 (协助细胞外冰晶形成 ) , 9 m in后以 - 013 ℃ /m in 速率下降至 - 32℃, 再以 - 012 ℃ /m in速率下降至 - 36 ℃, 以 - 4 ℃ /m in下降至 - 80 ℃, 随后自由下降至 - 120 ℃后直 接投入液氮 ( - 196 ℃) 保存。 115　胚胎解冻〔2〕　在排卵发生后 3天或黄体酮注射后 3天的 上午解冻。采用解冻试剂盒 (ART - 8016, SAGE Media, USA) , 麦管取出后在空气中轻轻摇动 60 sec, 放入 31 ℃水浴 中 60 sec。自麦管中吹出含胚胎的冷冻保护液 , 解剖显微镜 (N ikon SMZ 800, Japan) 迅速检出后放入 37 ℃的 015 M丙二 醇中 10 m in, 移入 012 M丙二醇中 10 m in, 再放入含蛋白的 Hepes液滴中清洗 7次 , 移入囊胚培养液微滴 , 5% CO2 孵箱 中培养至 ET。 116　冻胚移植前处理 　所有解冻的胚胎行激光法透明带削薄 (LAH) 后放入囊胚培养液 ( HTF 1029, SAGE B ioPharma)。 解冻当天采用随机方法 , 68个周期采用囊胚培养法 , 63个周 期为解冻后培养 2 h移植。 117　激光透明带辅助孵化法〔3〕 ( quarter laser zone thinning as2 sisting hatching, qLZT - AH, or Laser AH) 　倒置显微镜 (O2 lympus IX70) 安装 ZILOS - tk激光系统 ( ZILOS - tk, HAM IL2 TOON THORNE B IOSC IENCES, 美国 ) , 通过匹配的软件 , 操 作过程简单、快速。方法 : ET皿含培养液 0 18 m l, 胚胎移入 其中 , 置于 37 ℃热台上 , 使胚胎透明带欲打孔处位于屏幕标 记处 , 按动鼠标控制激光发射 , 采用将透明带自外向内削薄 (不穿破透明带 ) 80% , 孔径大小达透明带赤道面的 25%。 每个胚胎打孔费时约数秒。 118　子宫内膜的准备 　所有的 F - ET均在取卵周期 2～3月 后进行。其解冻时机选择 : 口服戊酸雌二醇 (补佳乐 ) 2～4 mg/d,数日后行 TVS监测 , 子宫内膜厚度 ≥8mm时 , 继 续口服补佳乐并开始肌注黄体酮 , 由 20 mg/d递增至 60 mg/d 并维持此剂量 , 注射黄体酮的第 4天开始解冻。 119　移植后处理 　每日继续肌注黄体酮 60 mg, ET后第 14 天晨尿 hCG检查阳性为生化妊娠 , ET后第 35天经 TVS检查 , 见胚芽及心管搏动诊断为临床妊娠。同时确定孕囊数目。继 续保胎治疗至停经 83天。嘱咐定期产检 , 电话随访新生儿情 况。 1110　统计方法 　数据录入 SPSS 1210统计软件 , 采用 t检验 和χ2 检验。 2　结果 A组和 B 组透明带厚度平均 ( 19107 ±0184 ) μm 和 (19103 ±0175) μm, P > 0105。经过 Pronase消化后 , A组残 留透明带的厚度大于 B 组 , A 组和 B 组分别为 ( 13101 ± 0188) μm和 (817 ±0173) μm , P < 0105, 差异有显著性。 C组 68周期中行早期桑椹或囊胚移植 60周期 , 妊娠 23 例 , D组 63周期中行分裂期胚胎移植 60周期 , 妊娠 14例 , C组和 D组妊娠率分别为 33182%和 22122% , 种植率分别为 2813%和 1515% , 差异有显著性 , P < 0105。C组内无早期桑 椹或囊胚移植的共 6个周期 , 占 11176% , 高于 D组无胚胎移 植 (4176% , 2个周期 ) , P < 0105。两组早期妊娠流产率分 别为 13104% ( 3 /23) 和 14128% ( 2 /14) , 无显著性差异 , P > 0105。 F - ET结局 : 120个 F - ET周期 , 宫外孕 1例 , 流产 5 例 , 28例单胎 , 2例双胎 , 另 1例三胎行减胎术后双胎生长 良好。分娩 34个新生儿 , 体重均在 2 500 g以上 , 无畸形儿。 3　讨论 人类的卵子和早期胚胎周围包绕着厚度约 10～18μm透 明带 , 由糖蛋白构成 , 主要的功能是阻止多精受精、保护种 植前胚胎的完整性。受精后为加强这些功能发生透明带硬化。 在囊胚和种植前阶段 , 胚胎必须从透明带中逸出 , 这个过程 叫胚胎孵出。至少分裂期胚胎或子宫产生的分解素和囊胚的 物理性扩张共同作用于透明带使之在孵出前变薄〔4〕。 延长时间的卵子培养和胚胎培养会导致透明带硬化 , 女 ·57·周　平等　激光辅助孵化联合囊胚培养提高冻胚移植的妊娠率　第 1期 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 性年龄的增长或基础 FSH升高会导致透明带厚度增加 , 因此 推测在胚胎移入子宫腔前 , 利用人为的办法将透明带打孔对 一些病人是有好处的。这个方法称为辅助孵化 , 目的是提高 胚胎的种植率。 最早应用的辅助孵化方法是用酸性 Tyrode溶液化学性打 孔 (也称透明带凿孔 ) , 还有利用显微操作的机械方法 (也 称透明带部分切除术 )。两种方法均要求较高的技术 , 且费时 较长 , 透明带上孔的大小不能精确控制 , 不利于不同操作者 间的比较。第三种 AH方法是蛋白酶消化透明带〔5〕或酸性 Ty2 rode溶液整体改变透明带厚度〔6〕的方法 , 操作简便。近几年 激光被应用到辅助孵化中 , 一束 1148μm CO2 激光可穿透光 学镜头、塑料器皿、培养液 , 能量丢失少 , 在透明带上留下 一条沟壑 , 正面观察为一个圆孔。激光不仅应用于人类胚胎 的打孔 , 还安全地用在精子的制动上〔7〕。激光的好处在于所 打的孔依据应用的能量有一个明确的大小 , 由于计算机控制 , 激光可快速和精确地操作 , 产生极小的热作用 , 潜在的影响 也极低。 Jelinkova〔6〕应用酸性 Tyrode溶液化学性去除第 5天移植 的胚胎透明带 , 使发育延迟的胚胎获得较好的种植率 , 与未 行 AH的对照组相比 , 差异有显著性。体内囊胚的孵出较少 出现囊胚的扩张 , 体外培养的囊胚在孵出前都有囊胚扩张的 阶段 , 说明体外的囊胚要克服来自增强的透明带的束缚 , 孵 出的过程需要巨大的能量和胚胎的运动。AH可能减少孵出时 能量的损耗 , 于发育延迟的胚胎更能帮助它的孵出。 冷冻胚胎由于冷冻、保存、解冻的过程使透明带硬度增 加 , 难于被酶消化 , 提示进行冻胚透明带辅助孵化是必要的 步骤。激光破膜操作简单、快速 , 是胚胎实验室必备的装置。 蛋白酶消化法不需特殊设备 , 在没有激光破膜装置的胚胎实 验室也能采用该方法进行辅助孵化。 囊胚移植符合胚胎进入宫腔的生理阶段 , 虽然囊胚移植 存在没有囊胚移植的风险 , 但与分裂期胚胎移植相比 , 可获 得更高的妊娠率 , 在培养条件合适的情况下 , 选择辅助孵化 后囊胚移植可以提高冻胚移植成功率。 4　参考文献 1　曹云霞 , 王 　毅 , 丛 　林 et a l1 IVE - ET治疗不孕症获双胎妊娠 〔J〕1安徽医科大学学报 , 2000, 35 (4) : 封三 2　欧阳冰清 , 周 　平 , 曹云霞 et al1冻融胚胎移植 98周期结果分 析 〔J〕1安徽医科大学学报 , 2005, 40 (6) : 550 3　Petersen CG, Mauri AL, Baruffi RLR et a l1 Imp lantation failure: suc2 cess with quarter laser zona thinning assisted hatching 〔J〕1Hum Re2 p rod Abstracts, 2004, i58 4　De Vos A, Van Steirteghem A1Zona hardening, zona drilling and assis2 ted hatching: new achievements in assisted rep roduction 〔J〕1Cells Tissues O rgans, 2000, 16 (6) : 220 5　Fong CY, Bongso A, Ng SC et a l1B lastocyst transfer after enzymatic treatment of the zona pellucida: imp roving in - vitro fertilization and understanding imp lantation 〔J 〕 1Hum Rep rod, 1998, 13 ( 10 ) : 2926 6　Jelinkova L, Pavelkova J, Strehler E et al1 Imp roved imp lantation rate after chem ical removal of the zona pellucida 〔J〕1Fertil Steril, 2003, 79 (6) : 1299 7　Eroglu A , Nahum RT, Isaacson K et a l1Laser - assisted intracytop las2 m ic sperm injection in human oocytes 〔J〕1Rep rod Med, 2002, 47 (3) : 199 (2007211227　收稿 ) 〔编校 　刘鹏博 〕 异位妊娠 54例临床分析 马要敏 　汤广英 　河南省洛阳市吉利区人民医院 　471012 中国图书分类号　R714122　　文献标识码　B　　文章编号　100124411 ( 2010) 0120076202 【摘 　要 】　目的 : 分析异位妊娠的发病因素、早期诊断及治疗方法。方法 : 对 54例异位妊娠患者的临床资料进行回顾性 分析。结果 : 54例异位妊娠的平均发病年龄为 3016岁 , 多次孕产史、人工流产史、盆腔手术史及置宫内节育器是其好发因素 , 停经、腹痛、阴道流血是其常见症状 , 首诊误诊率达 48115%。54例患者中 , 2例保守治疗成功 , 52例经手术治愈。结论 : 根据 异位妊娠的临床特点结合辅助检查 , 可提高早期诊断率 , 减少误诊 , 改善预后。 【关键词 】　异位妊娠 　发病因素 　早期诊治 　　异位妊娠是妇产科常见的急腹症之一 , 严重腹腔内出血 者可致休克 , 甚至死亡 , 近年来其发病率有上升趋势。为了 解其发病特点 , 早期诊治 , 降低患者腹腔内出血量及休克的 发生率 , 本文对我院收治的 54例异位妊娠患者的病历资料进 行回顾性分析。 1　资料与方法 111　一般资料 　我院 2001年 1月 ～2007年 10月共收治异位 妊娠患者 54例 , 年龄 20～40岁 , 平均 3016岁 ; 未生育者 17 例 (31148% ) , 初次妊娠发病者 8例 (14181% ) , 其余 46患 者均有 1次或多次流产史、引产史和分娩史 ( 85119% )。剖 宫产 7例 , 置宫内节育器 8例 , 有宫外孕手术史 4例。 112　临床现 　主要症状是停经、不规则阴道流血及腹痛。 54例患者中 , 无停经史 6例 , 余 48例 (88189% ) 停经 30～ ·67· 中国妇幼保健 2010年第 25卷