脑得生丸中葛根异黄酮的提取工艺研究

© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 脑得生丸中葛根异黄酮的提取工艺研究 李坷平 ,王俊永 ,梁生旺 (广东药学院 中药学院 ,广东 广州 510006) 摘要 :目的 优选脑得生丸中有效成分葛根异黄酮的提取工艺。方法 以正交设计安排试验 ,采用高效液相色谱法测定葛根素 和大豆苷的含量 ,并以此为指标考察溶剂浓度、溶剂用量、提取时间 3个因素对异黄酮提取率的影响。结果 用 12倍量的体积 分数为 40%的乙醇回流提取 2次 ,每次 1 h的条件为最佳提取工艺。结论 本提取工艺设计合理 ,稳定 ,可为脑得生丸的进一 步开发提供可靠的实验依据。 关键词 :脑得生丸 ;异黄酮 ;葛根 ;大豆苷 ;提取工艺 中图分类号 : R 284. 2　文献标识码 : A　文章编号 : 1006 - 8783 (2007) 05 - 0501 - 03 作者简介 :李坷平 (1984 - ) , 2003级本科生 ;通迅作者 :梁生 旺 ,男 ,教授 ,硕士生导师 ,从事新药开发与质量控 制研究 , E2mail: swliang371@163. com。 　　脑得生丸收载于《中国药典 》2005年版一部 ,由 三七、川芎、红花、山楂和葛根等加工而成的蜜 丸 [ 1 ]。具有活血化瘀、疏通经络、醒脑开窍之功效 , 是治疗脑动脉硬化、脑中风及脑出血后遗症的常用 药。葛根为豆科植物野葛 [ Puera ria loba ta (W illd. ) Ohwi]的干燥根 ,主要含有葛根素、大豆苷、大豆苷 元等异黄酮类成分 ,能改善冠脉、脑和外周血循环 , 抑制血小板聚集 ,降低血压 ,降低心肌耗氧量 [ 2, 3 ]。 由于脑得生丸处方所含有效成分的极性差别较大 , 为进一步纯化的需要 ,本课题组将其处方分为葛根、 红花和三七、川芎、山楂两个部分 ,分别进行提取工 艺研究。本文对葛根和红花这部分进行报道 ,以葛 根素、大豆苷作为异黄酮类成分的定量指标 ,探讨了 脑得生丸中葛根异黄酮的最佳提取工艺条件。 1　仪器与试药 1. 1　仪器 W aters 2695型高效液相色谱仪 ;W aters 2996二 级管阵列检测器 ; W aters Empower色谱工作站 ; RE52CS旋转蒸发仪和 B 2220型恒温水浴锅 (上海 亚荣生化仪器厂 ) ; 十万分之一电子分析天平 ( SH IMADZU) ;纯水制备系统 (重庆艾科浦 ) ; SHB 2 IV22B循环水多用真空泵 (郑州长城科工贸有限公 司 )。 1. 2　试药 色谱甲醇 ,自制纯净水 ,其它试剂均为分析纯 ; 葛根和红花药材购于河南省药材总公司 ,由我院生 药教研室李书渊教授分别鉴定为豆科植物野葛 [ Pueraria loba ta (W illd. ) Ohwi]的干燥根和菊科植 物红花 ( Cartham us tinctorius L. )的干燥花 ;葛根素 和大豆苷对照品 (批号 : 7522200108,中国药品生物 制品检定所 )。 2　方法与结果 2. 1　色谱条件 以十八烷基键合硅胶柱为色谱柱 ;以甲醇 2水 (体积比 20∶80)为流动相 ;检测波长为 250 nm;流 速 1. 0 mL /m in;柱温 30 ℃。 2. 2　对照品溶液的配制 精密称取葛根素和大豆苷对照品 ,分别置 10 mL容量瓶中 ,加入甲醇 5 mL,超声溶解后 ,用甲醇 定容至刻度 ,制得葛根素质量浓度为 0. 512 mg· mL - 1 ,大豆苷质量浓度为 0. 925 mg·mL - 1 ,密封保 存 ,备用。 2. 3　药材溶液的制备 取葛根药材粉末 (过 3号筛 ) ,精密称定 ,置锥 形瓶中 ,精密加体积分数为 50%的甲醇 50 mL,称定 重量 ,加热回流 30 m in,放冷 ,再称定重量 ,用体积分 数为 50%的甲醇补足减失的重量 ,摇匀 ,滤过 ,取续 滤液 ,即得。 2. 4　曲线的制备 分别精密移取对照品溶液 0. 2, 0. 4, 0. 6, 0. 8, 1. 0, 2. 0 mL 置 10 mL 容量瓶中 ,用甲醇定容至刻 度。0. 45μm微孔滤膜滤过 ,取续滤液。进样体积 10μL,按色谱条件测得进样量与峰面积 ,计算回归 方程 ,结果见 1。 105 第 23卷第 5期 广　东　药　学　院　学　报 Vol. 23 No. 5 2007年 10月 JOURNAL OF GUANGDONG COLLEGE OF PHARMACY Oct. 2007 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 表 1　两种异黄酮的回归方程和线性范围 Tab. 1　Regression equa tion s and linear ranges of two k inds of Isoflavone 对照品 回归方程 线性范围 /μg 葛根素 A = 3. 560 80 ×104m - 1. 364 27 ×105 ( r = 0. 999 8) 0. 204 8～1. 024 0 大豆苷 A = 4. 957 74 ×105m - 6. 116 40 ×105 ( r = 0. 999 7) 0. 185 2～0. 925 0 2. 5　提取工艺条件优选 [ 5 ] 按复方脑得生丸处方量的 1 /5,称取红花 18. 2 g与葛根 52. 2 g,等量 9份药材。按正交设计安排 试验 (见表 2) ,回流提取 2次 ,合并滤液 ,回收溶剂 至 500 mL,定量移取 25 mL,置 1 000 mL容量瓶中 , 加体积分数为 50%的乙醇至刻度 ,滤过 ,取续滤液 作为正交试验的供试样品溶液。进样 10 μL,照 “211”项下色谱条件测定。由外标法分别计算葛根 素和大豆苷含量 ,两者之和为异黄酮的含量。结果 见表 3。 表 2　因素和水平表 Tab. 2　Factors and levels 水平 因素 A 乙醇 /% B 溶剂用量 /倍 C 提取时间 /m in 1 40 8 30 2 60 12 60 3 80 16 90 2. 6　阴性干扰试验 称取红花药材 18. 2 g,加体积分数为 40%的乙 醇 12倍量 ,回流提取 2 次 , 1 h /次。以下操作同 “215”项操作。色谱图见图 1。 A. 对照品 ; B. 供试样品 ; C. 阴性样品 1.葛根素 ; 2. 大豆苷 图 1　高效液相色谱图 F ig. 1　HPLC chroma togram s 表 3　正交实验 L9 ( 3) 4 结果分析表 Tab. 3　Ana lysis of the orthogona l exper im en t L9 ( 34 ) 试验号 因素 A B C D w /% 3 大豆苷 葛根素 异黄酮 1 1 1 1 1 0. 223 7 3. 139 5 3. 363 2 2 1 2 2 2 0. 378 3 3. 793 8 4. 172 0 3 1 3 3 3 0. 412 6 3. 941 7 4. 354 3 4 2 1 2 3 0. 462 4 2. 948 4 3. 410 8 5 2 2 3 1 0. 437 8 3. 751 4 4. 189 2 6 2 3 1 2 0. 542 7 3. 104 9 3. 647 6 7 3 1 3 2 0. 433 5 2. 785 3 3. 218 8 8 3 2 1 3 0. 594 5 2. 270 2 2. 864 7 9 3 3 2 1 0. 667 3 2. 456 2 3. 123 5 K1 11. 889 6 9. 992 8 9. 875 5 10. 675 9 K2 11. 247 6 11. 226 0 10. 706 4 11. 038 5 K3 9. 207 0 11. 125 4 11. 762 3 10. 629 8…K1 3. 963 2 3. 330 9 3. 291 8 3. 558 6…K2 3. 749 2 3. 742 0 3. 568 8 3. 679 5…K3 3. 069 0 3. 708 5 3. 920 8 3. 543 3 R 0. 894 2 0. 411 1 0. 628 9 0. 136 2 　　 3 相当于每克葛根药材中的含量 205 广东药学院学报 , 2007, 23 (5) © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 表 4　方差分析表 Tab. 4　Ana lysis of var iance 误差 来源 离差平 方和 自由度 均方差 F值 P值 A 1. 308 1 2 0. 654 0 39. 158 4 < 0. 05 B 0. 312 6 2 0. 156 3 9. 359 0 C 0. 596 1 2 0. 298 1 17. 846 4 误差 0. 033 4 2 0. 016 7 3　讨 论 3. 1　由表 3中的 R值可看出 ,影响异黄酮含量提取 的主次因素依次为溶剂浓度 >提取时间 >溶剂用 量。表 4的方差分析表明 ,溶剂浓度对试验有显著 性意义 ,提取时间次之 ,溶剂用量影响相对较小。但 采用低浓度乙醇回流提取时杂质较多 ,结合生产需 要 ,确定脑得生丸中异黄酮类成分的优选提取工艺 为 A1 B2 C2 ,即 :选用 12倍量的体积分数为 40%的乙 醇 ,回流提取 2次 ,每次 1 h。按此工艺进行 ,以葛根 素和大豆苷为指标 ,相对于葛根药材 ,其异黄酮的转 移率可达到 90%以上。 3. 2　本研究首次以葛根素和大豆苷为指标 ,采用高 效液相色谱法考察脑得生丸中异黄酮的提取工艺。 该方法与文献 [ 6, 7 ]所采用的 UV法相比 ,结果更准 确 ,所优选的提取工艺切实可行。 参考文献 : [ 1 ] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典 : 2005年版一部 [ S]. 北京 :化学工业出版社 , 2005: 572. [ 2 ] 禹志领 ,张广钦 ,赵红旗. 葛根总黄酮对脑缺血的保护作 用 [ J ]. 中国药科大学学报 , 1997, 28 (11) : 310～312. [ 3 ] 曹钟灵 ,李建北 ,张东明. 葛属植物中异黄酮类化合物的 研究进展 [ J ].中药材 , 2005, 28 (1) : 67～71. [ 4 ] 祝世发 ,陈文 ,江发寿 ,等. 葛根中葛根素的提取工艺研 究 [ J ]. 时珍国医国药 , 2004, 15 (3) : 114. [ 5 ] 周永治 ,马志庆. 医药数理统计 [M ]. 2版 . 北京 :科学出 版社 , 2005. 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