大肠杆菌革兰氏染色影响因素分析

收稿日期: 2003- 05- 12 第 11卷第 4期 安徽建筑工业学院学报(自然科学版) Vol. 11 No. 4 2003 Journal of Anhui Inst itute of Architecture & Indust ry 2003 大肠杆菌革兰氏染色影响因素分析 凌 � 琪,王 � 敏 (安徽建筑工业学院环境工程系,合肥 � 230022) 摘 � 要:通过大量实验室工作, 研究了菌龄、涂片厚薄均匀度、媒染时间、乙醇脱色程度等因素对大肠杆菌革兰氏 染色结果的影响。试验结果显示,在对大肠杆菌进行革兰氏染色时, 细菌在伊红美蓝培养基上培养的时间不宜 超过24h;涂片时应为均匀薄片;革氏碘液媒染时间以 30s~ 60s 为宜;乙醇脱色程度是革兰氏染色的关键 ,脱色时 间应严格控制在 30s~ 60s。 关键词:大肠杆菌; 革兰氏染色;影响因素 中图分类号: X835 � � 无论在饮用水质量管理、还是在环境质量中, 大肠菌群都是一项很重要的指标。在对大肠菌群 测定过程中,革兰氏染色是很重要的一个鉴定步骤,革兰氏染色的正确性直接关系到能否正确判断该菌 落是不是大肠菌群, 故其是环境微生物实验中最常用的染色法之一, 也是细菌学中最重要的鉴定染色方 法之一。在革兰氏染色的整个操作过程中,有很多因素对染色结果有影响。现通过对大肠杆菌革兰氏染 色影响因素试验研究工作,以求得到一些有益的结论。 1 � 材 � 料 ( 1)菌种:大肠杆菌。大肠杆菌是大肠菌群中很重要也很有代性的一种。在对新鲜粪便污染水中 大肠菌群测定过程中,选取伊红美蓝琼脂培养基上不同的典型菌落, 按照方心芳著的�应用微生物学实验 法�中大肠菌群细菌分离法得到具有甲基红试验阳性、发酵柠檬酸盐阴性、V�P 试验阴性、脲酸试验阴性 等特征的一株大肠杆菌。 ( 2)染液:草酸铵结晶紫、革氏碘液、95%乙醇、蕃红染液。 2 � 影响因素对革兰氏染色结果的影响 2�1 � 菌种菌龄对染色结果的影响 革兰氏染色要求菌种被染色时处于活跃生长期。此时菌体的细胞壁的成分和结构最为典型,经革兰 氏染液染色处理后, 能典型正确地反映染色的结果。若菌体细胞未成熟或已老化,染色结果可能会出现 完全相反的情况。大肠杆菌的活跃生长期为 24h左右, 故选择从 18h~ 32h的范围, 分 10个时间段进行 涂片染色,每个时间段涂片 20张。试验结果见表 1。 表 1结果显示, 在对大肠杆菌测定时,细菌在伊红美蓝培养基上培养时间不宜超过 24h, 以免阳性菌 呈现假阴性,干扰革兰氏染色的正确性。 表 1 � 不同培养时间大肠杆菌的染色结果 菌种培养时间( h) G- 玻片数 涂片染色正确率( % ) 18 14 70 20 15 75 22 18 90 23 20 100 24 20 100 菌种培养时间( h) G- 玻片数 涂片染色正确率( % ) 25 20 100 26 14 70 28 14 70 30 11 55 32 10 50 � � � � � 表 2� 涂片菌膜厚薄对染色结果的影响 涂片情况 G- 玻片数 涂片染色正确率( % ) 满环 10 50 半环 17 85 更少量 20 100 2�2 � 涂片菌膜厚薄对染色结果的影响 用直径 3mm 的接种环分别挑起培养 24h 的大肠杆菌满环、半环和用接种针挑起更少量 大肠杆菌进行涂片, 使细菌在一滴生理盐水或 无菌水中和匀后涂成片状, 直径为 12 ~ 15mm,作革兰氏染色观察。每种情况涂片 20 张。试验结果见表 2。 表 2结果显示, 涂片菌膜浓厚时,因大肠杆菌密集成堆不易脱色或脱色不完全而常常呈 G+ 反应; 涂 片菌膜薄且均匀时均能得到正确结果。 � � � � � 表 3� 媒染时间对染色结果的影响 媒染时间( s) G- 玻片数 涂片染色正确率( % ) 30 20 100 60 19 95 90 18 90 120 16 80 2�3 � 媒染时间对染色结果的影响 将培养 24h的大肠杆菌革兰氏染色,用革 氏碘液作媒染剂, 覆盖时间分别为 30s、60s、 90s、120s。每个覆盖时间涂片 20张, 试验结 果见表 3。 表 3结果显示, 对于 G - 菌而言,媒染时间 过长,容易使阴性菌呈假阳性, 可能与媒染时 间过长使初染液结晶紫与细胞的结合过分牢固有关, 因而造成阴性菌呈阳性。媒染时间应控制在 30s~ 60s为宜。 2�4 � 乙醇脱色时间对染色结果的影响 G - 菌细胞壁疏松,脂类含量高,肽聚糖含量很低。因此用乙醇脱色时, G- 菌的脂类物质易被酒精溶 解,致使细胞壁通透性影响,细胞内的结晶紫- 碘复合物易被乙醇溶解而脱出, 使菌体出现无色。如果脱 色时间太短, G - 菌细胞壁内所形成的结晶紫- 碘复合物不易脱出,故往往被染成紫色造成假阳性。 将培养 24h的大肠杆菌革兰氏染色,试验选择 5s~ 90s的脱色时间范围,分 7个时间段进行试验, 每 个时间段制片 20张。试验结果见表 4。 表 4� 乙醇脱色时间对染色结果的影响 脱色时间( s) G- 玻片数 涂片染色正确率( % ) 脱色时间( s) G- 玻片数 涂片染色正确率( % ) 5 15 75 10 16 80 20 19 95 30 20 100 45 20 100 60 20 100 90 20 100 � � 表 4结果显示, 乙醇脱色时间不够, 阴性菌可能被染为阳性菌。虽然只差 10s、20s, 但染色结果相差 较大。因此,革兰氏染色要严格控制乙醇脱色时间,一般以 30s~ 60s为宜。 63第 4期 凌琪, 王敏:大肠杆菌革兰氏染色影响因素分析 3 � 试验结果分析 ( 1)菌龄对革兰氏染色的结果有较大影响,且与活跃生长期的时间差距越大, 影响也越大;革兰氏阴 性菌菌龄提前与菌龄推迟相比,对染色结果的影响要小得多。在对大肠杆菌测定时,细菌在伊红美蓝培 养基上培养时间不宜超过 24h; ( 2)涂片菌膜厚薄对染色结果有影响,涂片的菌膜薄且均匀时均能得到正确结果。在对大肠杆菌测 定时,只需用接种针挑起很少量大肠杆菌即可; ( 3)媒染时间对染色结果有影响,控制在 30s~ 60s为宜; ( 4)乙醇脱色程度是大肠菌群革兰氏染色的关键,一般控制在 30s~ 60s之间, 延长脱色时间对大肠 杆菌染色结果的影响较大,但继续延长则影响不大。 参考文献 1 � 沈萍� 微生物实验(第四版)� 北京:文采教育出版社, 1999, 28~ 35� 2 � 周德庆� 微生物学教程� 北京: 高等教育出版社, 1993, 18~ 40� 3 � 顾夏声� 水处理微生物学(第三版)� 北京:中国建筑出版社, 1997, 150~ 152� 4 � 李仲兴, 等� 诊断细菌学� 香港:黄河文化出版社, 1992, 291~ 297� 5 � 张纪忠� 微生物分类学� 上海: 复旦大学出版社, 1990, 102~ 112� 6 � 苏德模�MUG�Indole快速检定大肠杆菌研究� 药物分析杂志, 1996, 16( 2) : 108~ 112� RELATED FACTORS OF GRAM� S DYE OF COLIFORM LING Qi, WANG M in ( Department of Environmental Eng ineering, Anhui Institute of Architecture & Industr y, Hefei, 230022, China) Abstract: In the paper, the inf luences of bacterium age, the even thickness of smear, mordant agent t ime, the degree of ethanol decolouration and other related factors on the result of Gram� s dye of Coliform are dis� cussed. T he result of experiments shows that during Coliform Gram� s dye the t ime of culturing bacterium in EMB medium is w ithin 24h; smear should be even and thin; the t ime of mordant agent is appropriate betw een 30s and 60s; the degree of ethanol decolouration is key to experiment and the t ime of decolouration is st rictly cont rolled betw een 30s and 60s. Key words: Coliform ; Gram� s dye; related factors 64 安徽建筑工业学院学报(自然科学版) 第 11卷