含中药龙血竭的血清处理方法研究

含中药龙血竭的血清处理方法研究　　【摘要】目的研究含中药龙血竭的血清处理方法。方法采用适宜蛋白沉淀剂并以有机溶剂提取处理含中药龙血竭的血清样品，测定含药血清的HPLC图谱，以龙血竭溶液中5个特征成分的峰面积为对照计算提取率，确定制备含药血清的最佳方法。结果通过乙腈沉淀蛋白，采用乙酸乙酯进行提取，可使含药血清中龙血竭特征成分的提取率达到80%以上。结论本法可作为龙血竭含药血清的制备方法。　　【关键词】龙血竭;含药血清;蛋白沉淀　　Abstract:ObjectiveToestablishamethodforthetreatmentofserumofrabbitsfedwithDracaena.MethodsVariousproteinprecipitatorsandorganicsolventswereusedtoprocesstheserumsamples.HPLCwasusedtodeterminethetargetsubjects.Fivechemicalsandtheircharacteristicpeakswereusedtoevaluatethetreatmentprocessoftheserum.ResultsTheaveragerecoveryofDracaena’smajorcomponentsreached80%afterprecipitatedbyacetonitrilefirstandthenextractedbyethylacetate.ConclusionThemethodprovidesareliableapproachtopreparetheserumcontainingDracaena.　　Keywords:Dracaenacochinchinesis(Lour.)S.C.Chen;herbserum;proteinprecipitation　　龙血竭为传统中药,是龙舌兰科植物剑叶龙血树[Dracaenacochinchinensis(Lour)S.C.Chen]含树脂木材的乙醇提取物[1]。龙血竭总黄酮(sanguisdraconisflavones,SDF)是从龙血竭中提取得到的主要成分[2]，包括黄酮、二氢黄酮、黄烷、查耳酮、二氢查耳酮等20多种化合物[3]。动物实验表明，龙血竭总黄酮能对抗整体动物心肌缺血损伤[2]。本实验将龙血竭HPLC图谱中特征峰较明显的5个成分的峰面积作为检测指标(其中2个主要成分为龙血素A和龙血素B)，以龙血竭原溶液为对照计算体外加样后提取百分率，进行血清处理方法的研究。　　1、仪器与试剂　　Waters高效液相色谱仪：515HPLC泵,2487双波长吸收监测器,N?2000双通道色谱工作站(浙江大学智能信息工程研究所);TDL80?2B台式离心机(上海安亭科学仪器厂);超声仪(上海超声波仪器厂);TU?1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);ZH?2BLENDER涡旋混合器(天津药典仪器厂)。　　广西产龙血竭(广西中医学院制药厂提供);龙血素A、龙血素B对照品(中国药品生物制品检定所提供);乙腈(色谱纯);甲醇，乙酸乙酯，丙酮，正丁醇，乙醚，三氯甲烷，正戊醇，95%乙醇，无水乙醇，三氯醋酸，均为分析纯;新西兰大耳白兔(广东省医学实验动物中心提供)。　　2、HPLC法的建立　　2.1色谱条件　　色谱柱：DiamonsilC18(5μm,250mm×4.6mm);保护柱：EasyguardC18ReplacementCartridgesCat#6101;流动相：乙腈?1%冰醋酸(体积比38∶62);检测波长：280nm;流速：1.2mL/min。　　2.2溶液的制备　　取龙血素A、龙血素B对照品适量，用甲醇分别配制成每1mL含10μg的溶液，作为对照品溶液。　　取广西龙血竭，用甲醇配制成每1mL含2mg的溶液，0.45μm微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液。　　2.3线性范围　　将龙血素A对照品溶液分别配制成浓度为0.925、4.625、9.250、13.875、18.500、23.125μg/mL的溶液，进样10μL,记录色谱图，进样量(m)与峰面积(A)的回归方程为：A=45064451m-10379768，r=0.9992，线性范围为9.25～231.25ng。　　同上，将龙血素B对照品溶液分别配制成浓度为0.947、4.735、9.470、14.205、18.940、23.675μg/mL的溶液，进样10μL,记录色谱图，进样量(m)与峰面积(A)的回归方程为：A=33227615m-10135858，r=0.9990，线性范围为9.47～236.75ng。　　2.4稳定性试验　　取“2.2”项下的供试品溶液分别于0、2、4、6、8、24h进行检测，分别记录5个特征性成分的峰面积，相应峰面积的RSD值分别为1.83%、3.09%、2.89%、2.47%、2.05%，即供试品溶液在24h内保持稳定。　　2.5供试品溶液HPLC图谱　　取“2.2”项下的供试品溶液，龙血素A、龙血素B对照品溶液及空白血清样品，各进样10μL，记录HPLC图谱，见图1。　　图1供试品溶液(A)、龙血素A对照品(B)、龙血素B对照品(C)及空白血(D)HPLC图谱　略　　含中药龙血竭的血清处理方法研究在供试品溶液图谱上选取5个特征峰较明显的成分作为检测指标，保留时间分别为10.232、15.498、26.665、35.732、38.732min，其中峰4和峰5经验证，确定为龙血素A(4′?羟基?2,4?二甲氧基二氢查耳酮)和龙血素B(4′?羟基?2，4，6?三甲氧基二氢查耳酮)[4]，峰1、2和3结构未知。由上图可知，空白血清样品无干扰。　　3、结果与讨论　　3.1提取率的计算　　特征性成分的提取率=血清样品中特征性成分的峰面积/供试品溶液相应成分的峰面积×100%　　3.2血浆样品的处理方法　　3.2.1蛋白沉淀剂的选择　　实验中发现，供试品溶液与10%三氯醋酸会发生反应，出现混浊现象，故使用常用的蛋白沉淀剂甲醇、乙腈、无水乙醇、丙酮进行处理。　　由兔耳缘静脉取血约2mL，置离心管中，加入供试品溶液1mL，涡旋混合，分别加入各种蛋白沉淀剂甲醇、乙腈、无水乙醇和丙酮适量，离心，取上清液，水浴挥干后精密加入1mL甲醇，超声溶解，0.2μm微孔滤膜滤过，取续滤液10μL进行HPLC检测。以供试品溶液5个指标性成分的峰面积为对照，计算得各成分的提取率见表1。　　表1不同蛋白沉淀剂制备含药血清的特征峰的提取率略　　从表1可见，以甲醇作蛋白沉淀剂对5个特征峰的提取率均较低，丙酮次之，乙腈和无水乙醇相对高一些，但对峰3的提取率均低于50%，证明4种处理过程均无法避免血浆蛋白对药物的吸附，无法达到理想的提取效果。　　按上述实验步骤，在分别加入蛋白沉淀剂后，加入与血样同等量的乙酸乙酯，提取3次，涡旋混合，离心，取乙酸乙酯层，合并提取液，水浴挥干，精密加入1mL甲醇，超声溶解，经0.2μm微孔滤膜滤过，取续滤液10μL进行HPLC检测。以供试品溶液5个指标性成分的峰面积为对照，计算得各成分的提取率见表2。　　从表2可见，含药血清在使用不同蛋白沉淀剂后，通过同种有机溶媒——乙酸乙酯进行提取，可不同程度提高5个特征性成分的提取率，以无水乙醇组提高效果最不明显，甲醇、乙腈、丙酮组均有显著提高，且乙腈组对5个特征峰的提取率均达到80%以上。　　表2不同蛋白沉淀剂与溶媒结合提取制备含药血清的特征峰的提取率　略　　3.2.2提取次数的选择　　使用乙腈作为蛋白沉淀剂，加入与血样同等量的乙酸乙酯，分别按2、3、4次进行提取，水浴挥干后精密加入1mL甲醇，超声溶解，0.2μm微孔滤膜滤过，取续滤液10μL进行HPLC检测。以供试品溶液5个指标性成分的峰面积为对照，计算得各成分的提取率见表3。　　表3不同提取次数制备含药血清的特征峰的提取率　略　　由表3结果可见，使用与血样同等量的乙酸乙酯提取3次(见图2)的效果明显优于提取2次，当提取次数为4次时，对各特征性成分的提取率影响则较小，再增加提取次数意义不大。　　3.2.3提取溶剂的选择　　使用乙腈作为蛋白沉淀剂，采用其他种类提取溶剂如正丁醇、乙醚、氯仿对血样进行处理。以供试品溶液5个指标性成分的峰面积为对照，计算各成分提取率见表4。　　图2含中药龙血竭血清HPLC图谱　略　　表4不同提取溶剂制备含药血清的特征峰的提取率　略　　正丁醇对于峰2、4、5的提取率达到80%以上，但对峰1和3的提取率均低于75%;而乙醚和氯仿对峰3的提取率均低于50%，不及使用乙酸乙酯为提取溶剂的效果。　　4、结论　　将含中药龙血竭的血清先通过乙腈沉淀血浆蛋白，再使用与血样同等量的乙酸乙酯提取3次，可使龙血竭中5个特征性成分的提取率达到80%以上。本研究结果可为中药龙血竭的体内药动学研究提供依据。　　【】　　[1]孙胜利，宓鹤鸣，姚庆芳，等.不同来源国产血竭的薄层色谱和紫外光谱鉴别[J].中草药，2002，33(11)：1033-1034.　　[2]方伟蓉，李运曼，邓嘉元.龙血竭总黄酮对动物心肌缺血的保护作用[J].中国临床药理学与治疗学，2005，10(9)：1020-1024.　　[3]张庆云，朱辉.龙血竭研究进展[J].武警医学院学报，2004，13(1)：69-71.　　[4]周志宏，王锦尧.龙血竭的化学成分研究[J].中草药，2001，32：484-486.