耐甲氧西林溶血葡萄球菌、金黄色葡萄球菌erm基因的检测与分析

耐甲氧西林溶血葡萄球菌、金黄色葡萄球菌erm基因的检测与 耐甲氧西林溶血葡萄球菌、金黄色葡萄球菌 erm基因的检测与分析 江西医学院2006年第46卷第1期ActaAcademiaeMedicinaeJiangxi2006,Vol46,No1?111? 耐甲氧西林溶血葡萄球菌,金黄色葡萄球菌 eFm基因的检测与分析 王宏,谢忆虹,彭梅,糜祖煌. (1_南昌市第一医院,江西南昌33OO08;2.无锡市克隆遗传技术研究所,江苏无锡214026) 摘要:目的比较耐甲氧西林溶血葡萄球菌,金黄色葡萄球菌erm基因的检出差异,以及与细菌药敏型之间的 关系.用MicroScan8utoSCAN4细菌鉴定仪进行鉴定和药敏试验,用聚合物酶链反应(PCR)法检测crm基 因.结果36株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)中表型耐红霉素的为35株,其中有34株检出arm基因,两 者符合率为97.14f24株耐甲氧西林溶血葡萄球菌(MRSH)中表型耐红霉素的为22株,其中有15株检出arm基 因数,两者符合率为68.18.两组细菌数据统计使用电于表格MicrosoftExcel软件处理,组间率比较采用卡方 检验,P<O.05,差异非常显着.结论耐甲氧西林金黄色葡萄球菌对红霉素的耐药机制主要是由arm基因编码甲 基化酶,使药物作用靶位的改变.耐甲氧西林溶血葡萄球菌对红霉素耐药不仅存在erm耐药基因,还有着其他的 耐药分于机制. 关键词:耐甲氲西林?葡萄球菌I耐药f基因 中图分类号:R446.51文献标识码:A文章编号:1000--2294(2006)01--0111--02 随着医疗诊治手段的变化,引起医院内感染的 革兰氏阳性球菌除金黄色葡萄球菌外,凝固酶阴性 的葡萄球菌(CNS)检出率已越来越高.据报道在 CNS中MRSH占据首位L1],已引起医务人员的密 切关注MRSA和MRSH都具有高度的耐药性. 为了探讨MRSA和MRSH中的arm基因的检出差 异,与细菌药敏表型之间的关系是否一致,以便更加 合理正确地指导临床用药,并为开发新的抗生素提 供理论基础.我们对临床分离出来的36株MRSA 和24株MRSH用MicroScanautoSCAN4细菌鉴 定仪进行鉴定和药敏试验,用聚合物酶链反应 (PCR)法检测erm. 1材料与方法 1)菌株来源:36株耐甲氧西林金黄色葡萄球 菌,24株耐甲氧西林溶血葡萄球菌均从我院临床各 种标本中分离,鉴定而获得.质控菌株:金黄色葡萄 球菌ATCC29213(购自卫生部临床检验中心).材 料:PCR试剂盒(购自无锡市克隆遗传技术研究 所),MicroScanautoSCAN4细菌鉴定仪. 2)6O株耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)均从临 床各种标本中经MicroScanautoSCAN4细菌鉴定 仪进行鉴定和药敏试验而获得.全程用 ATCC29213作质量监控. 3)erm基因的检测(可检出ermA,ermB,er- 收稿日期:2OO5一O9—2O mC,ermG,ermQ5种甲基化酶基因):(1)细菌DNA 模板板制作:挑取菌落置人内含100L生理盐水的 0.5mL离心管内,离心5min,10000r/min,用移液 管吸弃上清液,加5OL裂解液(O.5非离子去污剂 NP40配置浓度为200ng/mL蛋白酶K溶液),置 55?水浴消化1h,改置95?水浴灭活10rain.离心 15000r/min,30S.上清液即为基因扩增检测的模板 液.(2)基因检测PCR法:引物序列见表1.PCR扩 增体系:取引物P1和P2各0.5Umol/L,dNTPs各 200Umol/L,KCl10mmol/L,(NH4)2SO48nmlol/ L,MgC122mmol/L,Tris—HCl(PH9.0)10mmol/L, NP400.5%,TaqDNA聚合酶1U.总体积20L,其 中模板液5肛L热循环参数:arm基因扩增为93? 3O37?9O72?120S共35周期,预变性均为3 min.观察:PCR产物1O肛L与溴甲酚兰指示剂2L 混匀后点样于2琼脂糖凝胶,100伏电泳30rain后 置入凝胶成象仪中观察并数码结果. 表1erln基因检测引物序列 基因名称序列(5,一3,)产物长度(bp) ?1l2? 2结果 江西医学院2006年第46卷第1期ActaAcademiaeMedicinaeJiangxi2006,Vol461Nol 6O株耐甲氧陌林葡萄球菌(MRS)表型耐红霉 紊的为57株,经erm基因扩增检测49株出现 533bp的目的条带,阳性率为85.96(49/57).其 中36株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)中表 型耐红霉素的为35株,其中有34株检出erm基因, 两者符合率为97.149,6;24株耐甲氧西林溶血葡萄 球菌中表型耐红霉素的为22株,其中有15株检出 erm基因数,两者符合率为68.18.两组细菌数 据统计使用电子表格MicrosoftExcel软件处理,组 间率比较采用卡方检验,P<0.05,差异非常显着. (部份标本的电泳见图1). 图1ermPCR电泳图 (M{分子量标记,由上而下分别为50,100,150,200,250,300, 400,500,600,700,800,900,1000bp.Pt阳性对照,Nt阴性对照.St标 本阳性) 3讨论 红霉素是一类广谱的大环内酯类抗生素,随着 临床应用的增多,红霉素也和其他抗生素一样,出现 了病原菌耐药性问题,耐药率在不断攀升.据上海, 深圳2002年度的调查,耐甲氧西林凝固酶阴性的葡 萄球菌(MRCNS)红霉素耐药率在8o左右[矗]. 2003年江苏常州的学者李立等报道MRCNS为红 霉素耐药率在89.1[4].本试验6o株耐甲氧西林 葡萄球菌对红霉素耐药率已高达95(57/60). 细菌对大环内酯类抗生素耐药机制分三个途 径:作用靶位的改变,灭活酶的产生,主动外排系统 的参与.作用靶位的改变是细菌对大环内酯类抗生 素耐药的主要机制.耐药菌位于质粒或染色体上的 甲基化酶结构基因erm,在药物的诱导下被活化合 成甲基化酶,使位于核糖体50S亚单位的23SrRNA 的腺嘌呤甲基化,导致抗生紊不能与结合部位结 ?[5] 口0 Erm机制是金黄色葡萄球菌产生红霉索抗性 的主要原因,金黄色葡萄球菌主要靠ermA,ermB, ermC以及ermF这四个基因的产物来甲基化修饰 碱基而得到红霉索抗性的J.本试验表型耐红霉素 的35株MRSA中有34株检出erm基因,两者符合 率为97.149,6,充分证实了这一论点. MRSH对大环内酯类抗生素耐药机制比MR— SA复杂的多.22株表型耐红霉索的MRSH只有 15株检出erm基因数,两者符合率为68.189,6,说 明了MRSH对红霉素耐药除了获得erm基因外, 可能还存在灭活酶的产生,主动外排系统的参与等 耐药机制.已有研究发现葡萄球菌(金黄色葡萄球 菌,溶血葡萄球菌)可产生达福普汀乙酰转移酶,喹 奴普丁水解酶或林可酰胺核苷酸转移酶,进而破坏 MLSB(大环内酯类一林可霉素一链阳菌素B)或林 可酰胺类抗生素L7].国外文献还报道了葡萄球菌获 得msrA基因后通过主动转运的形式而对红霉素耐 药L8].MRSH是否存在这些基因,还有待进一步研 究. 参考文献: C13底建辉,沈叙庄,王咏红.等.甲氧西林耐药凝固酶阴性葡萄 球菌抗生素耐药性及耐药基因的研究[刀.中华实用儿科杂志, 2003,18(8)481—483. 汪复,朱德妹.上海地区细菌耐药性监渊[J].中国抗感染化疗 杂志,2002,1t1—9. 杨健?陈升汶?何林,等.1998~2000深圳医院细菌耐药性监渊 [刀中国抗感染化疗杂志.2002.1z7一z9. 李立,应冠一,麋祖煌.等.耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌 红霉索耐药erm基因检测[J].现代实用医学.2003,15(6).345 — 346. 王明贵?张婴元.细菌对大环内醣类抗生素耐药机制的研究进 展[J].国外医药抗生素分册,2000.21(1)13—15. 李凌凌.张部昌,马清钧.红霉素抗苗作用及细菌产生红霉寨抗 性的机制口].国外医药抗生素分册.2004,25(1):12--16. 置毅.大环内醣类抗生素的研究进展[J].国外医药一合成药, 生化药,制剂分册.2001.22(3)I134--136. RobertsMC.SutcliffeJ,courvalinP.eta1.Nomenclaturefor macrolideandmacrolide-lincosamide-streptograminBresis- tancedeterminants[J].AntimicrobAgentsChrmother,1999. 1Z:2823—2830.