肾移植后移形细胞癌患者外周血中树突细胞的变化

肾移植后移形细胞癌患者外周血中树突细胞的变化 实用器官移植电子杂志? 2013 年第 1 卷第 4 期? Prac?J?Organ?Transplant ( Electronic?Version ) , ?July?2013, Vol.1, No.4 ?211? ?论著? 肾移植后移形细胞癌患者外周血中 树突细胞的变化 马麟麟,丰琅,武俊杰,解泽林,唐雅望,孙雯,郭宏波,林俊,张磊,田野 (首都医科大学附属北京友谊医院泌尿科,北京 100050)【 摘 要 】 目 的 观 察 肾 移 植 后 新 发 泌 尿 系 统 移 形 细 胞 癌 患 者 外 周 血 中 树 突 细 胞(dendritic cells, DCs) 及 其 亚 群 髓 样 DC(mDC) 和 浆 细 胞 样 DC(pDC) 的 变 化, 探 讨 其 在 移 植 后 肿 瘤 发 生 的 现。 方 法 收 集 9 例 肾 移 植 术 后 并 发 泌 尿 系 统 移 形 细 胞 癌 病 人, 检 测 肿 瘤 切 除 术 前、 术 后 外 周 血 中 白 细 胞 总 数 和 单 个 核 细 胞 数(PBMNC) ; 应 用 流 式 细 胞 术 测 定 DCs 及 其 亚 群 的 数 量 和 mDC/pDC。7 例 肾 移 植 后 两 年 以 上 肾 功 能 稳 定 病 人 作 为 肾 移 植 长 期 存 活 对 照,30 例 普 通 泌 尿 系 统 移 形 细 胞 癌 病 人 作 为 肿 瘤 对 照,15 例 健 康 志 愿 者 作 为 正 常 对 照。 结 果 3 组 病 人 DCs 总 数 均 低 于 正 常 人 群, 长 期 存 活 病 例 mDC 降 低 幅 度 最 为 显 著 (P<0.05) 。 两 组 肿 瘤 病 例 与 肾 移 植 长 期 存 活 病 例 比 较,DCs 及 亚 群 均 无 差 异( 均 P>0.05) 。 移 植 后 肿 瘤 病 人 pDC 明 显 降 低,mDC 与 pDC 比 值 明 显 高 于 其 他 各 组 ( 均 P>0.05) 。 与 移 植 后 肿 瘤 病 人 不 同, 普 通 肿 瘤 病 人 mDC 明 显 降 低,pDC 降 低 不 明 显。 肿 瘤 切 除 后, 两 组 肿 瘤 病 人 的 mDC 和 pDC 均 有 不 同 程 度 增 长。 结 论 DC 及 其 亚 群 的 变 化 在 肾 移 植 后 肿 瘤 及 普 通 肿 瘤 病 人 之 间 有 所 不 同, 其 变 化 差 异 提 示 免 疫 状 态 失 衡 与 肾 移 植 肿 瘤 的 发 生 密 切 相 关。 通 过 监 测 外 周 血 DCs 及 亚 群 的 变 化, 可 能 有 助 于 预 测 肾 移 植 后 肿 瘤 免 疫 监 视 状态和肿瘤的复发。【关键词】 肾移植 ; 移形细胞癌 ; 树突细胞 ; 髓样 树突细胞 ; 浆细胞样树突细胞 Diversify characteristics and implication of dendritic cells subsets in transitional cell carcinoma after kidney transplantation MA Lin-lin, FENG Lang, WU Jun-jie, XIE Ze-lin, TANG Ya-wang, SUN Wen, GUO Hong-bo, LIN Jun, ZHANG Lei, TIAN Ye. Affiliated Beijing Friendship Hospital of Capital Medical University, Beijing 100050, China Corresponding author : MA Lin-lin, Email : malinlin1009@126【Abstract 】 Objective To analyze the diversify trend characteristics and implication of dendritic cells (DCs ) and its subsets myeliod DC (mDC ) and plasmacytoid DC (pDC ) in peripheral blood of transitional cell carcinoma after kidney transplantation, and to confer the profile of DCs and subsets in de novo malignant tumor after kidney transplantation. Methods White blood cell (WBC ) and mononuclear cell (PBMNC ) in peripheral blood of9 transitional cell carcinoma patients after kidney transplantation were measured before and 1 day after tumorectomyDCs' quantity, subsets and mDC/pDC were detected using flow cytometry. 7 renal transplantation patients who had been survived over two years and 30 patients with transitional cell carcinoma of bladder were included in this research as long term control and common tumor control. 15 volunteers ( control group ) were studied as healthy controls. Results The levels of DCs of all the patients groups were lower than healthy people control group, the total mDC level of long term survival group was the lowest (P<0.05 ). Compared with long term survival group, there was no difference in DCs with two subset of tumor groups ( all P>0.05 ). The pDC level of the transitional cell基金项目: 国家重点基 础研究发展计划 ( 2009CB522401 ) ; 国家自然科学基金 ( 30772170 )? 通讯 作者: 马麟麟, Email : malinlin1009@126?212? 实用器官移植电子杂志? 2013 年第 1 卷第 4 期? Prac?J?Organ?Transplant ( Electronic?Version ) , ?July?2013, Vol.1, No.4 carcinoma patients after kidney transplantation was decreased and the ratio of mDC/pDC was significantly higher than other groups (all P>0.05 ). Different from carcinoma after kidney transplantation, mDC in patient with transitional cell carcinoma of bladder were decreased significantly and pDC level decreased slightly. After tumorectomy, mDC and pDC levels in both groups were increased with different extent. Conclusions Changes in DCs and their subsets were different between the carcinoma patients after kidney transplantation and common transitional cell carcinoma of bladder. This difference suggested that disequilibrium of immune system of kidney transplant recipient should be response to carcinoma after kidney transplantation. Monitoring the level of DCs and subsets is helpful for the forecast of tumor immunity surveillance and cancer relapse 【Key words】 Kidney transplantation ; Transitional cell carcinoma ; Dendritic cell ; Myeliod dendritic cell ; Plasmacytoid dendritic cell树突细胞(dendritc cells,DCs)作 为专职抗原 入 选 标 准 同 移 植 后 肿 瘤 病 例。 健 康 志 愿 者 作 为 正 常 呈 递 细 胞, 不 但 在 诱 导 移 植 免 疫 耐 受 中 发 挥 关 键 性 对 照 组, 排 除 免 疫 性 疾 病、 病 毒 感 染、 手 术、 急 慢 的 作 用, 而 且 在 抗 肿 瘤 免 疫 中,DCs 通 过 递 呈 肿 瘤 性炎症等影响免疫系统的疾病。 抗 原、 激 活 T 淋 巴 细 胞 抗 肿 瘤 功 能、 以 及 直 接 参 1.2 研究方法 与 杀 伤 肿 瘤 细 胞 等 作 用, 成 为 肿 瘤 免 疫 研 究 和 临 床 1.2.1 临床研究方法 治 疗 学 的 关 键 热 点。 移 植 后 新 发 肿 瘤 正 在 成 为 长 期 病 人 入 组 后 记 录 人 口 学 资 料、 了 解 病 史、 记 存 活 移 植 病 人 的 重 要 死 亡 原 因。 而 移 植 宿 主 的 免 疫 录 病 情 和 相 关 治 疗 情 况。 分 别 于 术 前、 术 后 第 1~ 调 节 状 态 与 抗 肿 瘤 免 疫 之 间 的 平 衡, 无 疑 对 移 植 后 3 天 采 集 外 周 静 脉 血 以 乙 二 胺 四 乙 酸(EDTA) 抗 肿 瘤 的 预 防、 监 测 和 治 疗 有 重 要 意 义。 本 研 究 通 过 凝, 进 行 流 式 细 胞 分 析 和 血 常 规 检 测。 正 常 对 照 组 观 察 肾 移 植 后 泌 尿 系 统 移 形 细 胞 癌 病 人 外 周 血 DCs 和 长 期 存 活 随 访 病 例 均 一 次 性 留 取 外 周 静 脉 血 标 及 亚 群 的 状 态, 并 与 普 通 人 群 移 形 细 胞 癌、 长 期 存 本, 用 于 血 常 规 和 流 式 细 胞 分 析 检 测 DCs 及 亚 群。 活 肾 移 植 病 人 和 健 康 志 愿 者 进 行 比 较, 了 解 移 植 后 普 通 肿 瘤 对 照 病 人 分 别 于 肿 瘤 切 除 手 术 前 和 术 后 第 肿 瘤 病 人 的 DCs 及 亚 群 是 否 存 在 特 征 性 变 化, 分 14 天 留 取 标 本。 外 周 血 中 单 个 核 细 胞(peripheral 析其可能的临床意义。 blood mononuclear cell,PBMNC)数量以公式计算 : 1 临床资料及方法 PBMNC 绝 对 值 = 淋 巴 细 胞 绝 对 值 + 单 核 细 胞 绝 对 1.1 研究对象 值。DC 检测结果表达为百分数(cells% gated) 。病 例 来 自 曾 经 在 本 院 接 受 肾 移 植 手 术, 发 生 肾 1.2.2 细胞学实验研究方法 + 移 植 后 新 发 原 肾 肾 盂 输 尿 管 移 形 细 胞 癌, 于 2010 髓样 DC (mDC) 以抗人 HLA-DR (PE/Cy5)/ + - 年 9 月 至 2011 年 12 月 期 间 入 本 院 接 受 手 术 治 疗 的 CD 1 1c (PE ) 双 阳 性 、LIN 1 cocktail (FITC ) 表 示 ; 浆 + 病 人。 入 选 条 件 : ? 移 植 肾 功 能 正 常 ; ? 观 察 期 无 细 胞 样 DC (pDC ) 以 抗 人 HLA-DR 标 记 (PE/Cy 5 )/ + - 急、 慢 性 感 染 性 疾 病, 如 急 性 呼 吸 道 感 染 和 伤 口 等 CD123 (PE) 双 阳 性、LIN1 cocktail (FITC, 谱 并 发 症、 肝 炎 活 动 期 ; ? 无 严 重 骨 髓 抑 制 ; ? 原 发 系 1 混合抗体,lineage cocktail, 包括: CD3、CD14、 病均为慢性肾炎导致的肾功能衰竭, 无免疫性疾病, CD16、CD19、CD20、CD56) 表 示。 全 血 标 本 标 如红斑狼疮等 ; ?肿瘤无远处转移。 记 方 法, 均 采 用 小 鼠 抗 人 单 克 隆 免 疫 荧 光 抗 体 标 记同 期 住 院 的 普 通 泌 尿 系 统 移 形 细 胞 癌 患 者 作 为 细 胞。 单 克 隆 抗 体 FITC 标 记、 抗 人 HLA-DR 抗 体 肿 瘤 对 照 组, 排 除 伴 随 慢 性 炎 症、 多 发 肿 瘤 或 远 处 PE/Cy5 标 记、CD11c 和 CD123 均 为 PE 标 记 ; 小 转 移 病 例。 选 择 肾 移 植 后 存 活 超 过 2 年 且 肾 功 能 稳 鼠 Ig G1 和 Ig G1α 作 为 同 型 对 照。 以 上 抗 体 均 购 定的移植病人, 作为移植术后长期存活病例的对照, 自 美 国 BD 公 司, 流 式 细 胞 检 测 仪 进 行 三 色 分 析。实用器官移植电子杂志? 2013 年第 1 卷第 4 期? Prac?J?Organ?Transplant ( Electronic?Version ) , ?July?2013, Vol.1, No.4 ?213? 采 用 美 国 Becton Dickinson 公 司 生 产 FACS Calibur 宾。1 例使用抗胸腺细胞球蛋白 (ATG) 诱导疗法, 流 式 细 胞 仪 检 测, 分 析 方 法 和 细 胞 标 记 方 法 按 照 0.01 mg/kg 连 续 3 天 ; 3 例 接 受 抗 CD25 单 克 隆 抗 BD 公司试验及流式细胞检测方法进行。 体 20 mg/ 次, 分 别 于 手 术 当 天 和 第 4 天 两 次 静 脉 1.2.3 病理学研究方法 注 射。5 例 未 接 受 诱 导 治 疗。9 例 病 人 肾 移 植 后肿 瘤 切 除 手 术 后 活 体 病 理 学 标 本 保 存 于 4% 甲 临 床 不 曾 诊 断 和 治 疗 排 斥 反 应。 至 发 现 肿 瘤 时 肾 醛 水 溶 液。 标 本 按 照 病 理 科 常 规 活 体 标 本 处 理 方 法 脏 平 均 存 活 71.6 个 月, 全 部 病 人 始 终 保 持 良 好 的 由病理科完成, 普通石蜡切片后苏木素 - 伊红 (HE) 移 植 肾 功 能, 平 均 血 肌 酐 83 μmol/L, 平 均 尿 素 氮 染色。病理学诊断依据 WHO 2004 年病理分级标准 4.4 mmol/L, 尿 常 规 检 查 中 尿 蛋 白 阴 性。 没 有 病 人 确 定 肿 瘤 的 病 理 级 别, 标 本 由 2 名 病 理 科 医 生 共 同 发生移植后感染、糖尿病等并发症。 完成诊断。 长 期 存 活 病 人 中 6 例 为 活 体 亲 属 供 肾,1 例 尸 1.2.4 统计学分析 体 供 肾, 平 均 移 植 肾 存 活 31.43 个 月。 术 后 常 规 三采 用 SPSS 13.0 统 计 软 件, 均 数 以 算 数 平 均 值 联 免 疫 抑 制 剂 维 持 治 疗, 分 别 有 4 例 以 他 克 莫 司 为 表 示, 计 数 资 料 的 比 较 采 用 Mann-Whitney 法, 组 基 础 药 物 和 3 例 以 环 孢 素 A 为 基 础 药 物 ; 5 例 联 合 间 比 较 采 用 单 因 素 方 差 分 析,P<0.05 为 差 异 有 统 使 用 吗 替 麦 考 酚 酯,2 例 联 合 西 罗 莫 司。ATG 和 抗 计学意义。 CD25 单 克 隆 抗 体 诱 导 各 3 例,1 例 未 接 受 诱 导 治 2 结 果 疗, 诱 导 方 法 同 前。 至 纳 入 观 察 时,7 例 平 均 血 肌 2.1 临床资料 酐 120 μmol/L, 平 均 尿 素 氮 5.97 mmol/L ; 3 例 尿 常 2.1.1 人口学资料 规检查中显示一过性微量白蛋白。健 康 对 照 组 15 例, 男 性 8 例, 女 性 7 例 ; 平 2.1.3 肿瘤的诊 断治疗 均 年 龄 35.5 岁, 均 符 合 入 组 标 准。 长 期 存 活 病 例9 例 移 植 后 肿 瘤 病 人 在 随 访 中 因 镜 下 或 肉 眼 血 7 例入选,男性 6 例,女性 1 例 ; 平均年龄 31 岁。 尿 接 受 B 超、CT 等 检 测, 分 别 于 移 植 后 15~131共 有 9 例 移 植 后 原 肾 肾 盂 输 尿 管 移 形 细 胞 癌 病 个 月 被 诊 断 为 原 肾 盂 输 尿 管 移 形 细 胞 癌, 平 均 发 人 入 选, 其 中 男 性 1 例, 女 性 8 例 ; 发 现 肿 瘤 时 年 生 于 肾 移 植 术 后 71.6 个 月。9 例 病 人 全 部 接 受 患 侧 龄 41~60 岁, 平 均 年 龄 56 岁, 明 显 高 于 健 康 对 照 原 肾、 输 尿 管 全 长 切 除 术 加 膀 胱 输 尿 管 乳 头 切 除 和 肾 移 植 后 长 期 存 活 病 人( 均 P<0.05) ; 原 发 病 术。同时肿瘤不同程度和范围地累及肾盂、 输尿管, 均 为 临 床 诊 断 慢 性 肾 炎, 未 进 行 病 理 类 型 检 验, 均 3 例 同 时 累 及 膀 胱。4 例 为 双 侧 原 肾 盂、 输 尿 管 和 没 有 明 确 的 马 兜 铃 酸 类 药 物 的 服 用 史。 术 前 全 部 病 膀胱移形细胞癌, 5 例为单侧发病。 3 例病人因肾盂、 例 接 受 血 液 透 析 治 疗 4~25 个 月 不 等, 平 均 3.7 个 输 尿 管 移 形 细 胞 癌 接 受 手 术 治 疗 1 次 ; 4 例 因 双 侧 月。2 例 接 受 活 体 供 肾 移 植,7 例 尸 体 肾 脏 移 植。 发 现 肿 瘤 先 后 手 术 2 次 ; 接 受 肾 盂、 输 尿 管 和 膀 胱 肿瘤对照组 30 例均符合入组条件。 其中男性 24 例, 手 术 治 疗 肿 瘤 3 次 和 4 次 的 各 有 1 例。30 例 普 通 女 性 6 例 ; 年 龄 42~84 岁, 平 均 64.73 岁, 与 正 膀 胱 癌 患 者 手 术 均 采 取 同 一 术 式 : 经 尿 道 膀 胱 肿 瘤 常 对 照 组 比 较 差 异 有 统 计 学 意 义(P<0.05) ; 与 移 切除术。所有病例术后行病理学诊断。 植后肿瘤组之间没有差异。 2.2 检验结果 2.1.2 肾移植临床经过 2.2.1 血常规检验结果9 例 接 受 肾 移 植 手 术 时 年 龄 41~56 岁, 平 均 肾 移 植 两 组 白 细 胞 总 数 与 健 康 对 照 组 和 普 通 肿 49.5 岁。 术 后 肾 功 能 恢 复 顺 利, 常 规 接 受 以 他 克 瘤 组 比 较 差 异 无 统 计 学 意 义(P>0.05) , 见 表 1。 莫 司 和 环 孢 素 A 为 基 础 免 疫 抑 制 剂 的 三 联 维 持 治 说 明 肾 移 植 术 后 经 过 较 长 时 间 调 整, 造 血 系 统 已 经 疗,8 例 联 合 使 用 吗 替 麦 考 酚 酯,1 例 联 合 咪 唑 立 恢 复 正 常 状 态。 与 正 常 人 群 相 比, 肿 瘤 两 组 和 肾 移?214? 实用器官移植电子杂志? 2013 年第 1 卷第 4 期? Prac?J?Organ?Transplant ( Electronic?Version ) , ?July?2013, Vol.1, No.4 植 长 期 存 活 病 例 的 淋 巴 细 胞 总 数 偏 高、 单 核 细 胞 总 突 细 胞 有 抑 制 作 用, 手 术 切 除 肿 瘤 可 以 缓 解 这 一 作 数偏低, 说明免疫水平受到肿瘤和免疫抑制剂影响。 用。 与 移 植 后 肿 瘤 不 同, 普 通 肿 瘤 病 人 mDC 明 显 尤 其 长 期 存 活 病 例 与 正 常 人 群 之 间 比 较 差 异 有 统 计 降低,pDC 降低不明显。 学意义(P<0.005) 。 2.2.3 病理检查结果9 例 移 植 后 肿 瘤 中 5 例 肿 瘤 直 径 大 于 3 cm, 最 表 1? 各组血细胞学检查结果 大 肿 瘤 体 积 达 9 cm×6 cm×4 cm。7 例 病 理 学 诊 断 例 WBC LN MO PBMNC 为 肾 盂、 输 尿 管 乳 头 状 移 形 细 胞 癌 ? 级, 有 4 例 侵 组别 9 9 9 9 数 (×10 /L) (×10 /L) (×10 /L) (×10 /L) 犯 至 肌 层,2 例 可 见 周 围 淋 巴 结 转 移。2 例 病 理 学 健康对照组 15 7.24 1.69 0.55 2.50 ?a 诊 断 为 肾 盂、 输 尿 管 非 乳 头 状 浸 润 性 移 行 细 胞 癌 长期存活组7 8.64 2.01 0.41 2.42 移植后肿瘤组9 9.63 1.92 0.42 3.41 ?~ ? 级, 均 浸 润 至 肾 脏 实 质 ; 其 中 1 例 已 达 肾 脏 普通肿瘤组 30 6.83 1.91 0.42 2.50 被 膜。 普 通 膀 胱 癌 中 低 分 级 20 例, 高 分 级 10 例,? 注: WBC: 白细胞计数, LN: 淋巴细胞计数, MO: 单核细胞计数, a 均无淋巴结及远处转移。 PBMNC : 单个核细胞数 ; 与健康对照组比较, P<0.05 3 讨 论 2.2.2 树突细胞及亚群测定结果(表 2) 随 着 肾 移 植 受 者 存 活 时 间 逐 年 增 长, 随 之 而 来与 健 康 对 照 组 比 较, 其 他 3 组 患 者 DCs 总 的 移 植 后 恶 性 肿 瘤 越 来 越 普 遍。 有 专 家 预 测, 未 来 数 均 低 于 正 常 人 群。 长 期 存 活 病 例 最 为 显 著, 其 20 年 恶 性 肿 瘤 将 取 代 心 血 管 病 名 列 带 有 功 能 移 植 [1] 中 诱 导 TH1 型 免 疫 应 答 的 mDC 降 低 幅 度 最 明 显 器 官 长 期 存 活 受 者 的 第 一 位 死 亡 原 因 。 移 植 后 (P<0.005) 。 提 示 长 期 存 活 病 人 有 免 疫 耐 受 倾 向。 肿 瘤 发 病 率 是 普 通 人 群 肿 瘤 发 病 率 的 3.56 倍, 发 [2] 同 时, 两 组 肿 瘤 病 例 与 肾 移 植 长 期 存 活 病 例 的 DCs 病 年 龄 也 比 普 通 同 龄 人 群 提 前 了 10 年 , 还 有 病 及 亚 群 比 较 均 无 差 异( 均 P>0.05) 。 说 明 免 疫 抑 理 分 级 高 和 易 复 发 的 特 性。 而 移 植 后 所 必 须 的 免 疫 制 剂 和 恶 性 肿 瘤 对 DCs 及 亚 群 同 样 存 在 负 性 影 响, 抑 制 状 态 使 移 植 后 肿 瘤 的 基 础 研 究 和 临 床 治 疗 陷 入 表 现 为 抑 制 循 环 中 DCs 的 数 量。 移 植 后 肿 瘤 病 人 更加复 杂的困境。 mDC 与 pDC 比值明显高于其他各组 (均 P>0.05) , 与移植免疫相似的是 T 细胞在肿瘤免疫应答反 而 pDC 在 肿 瘤 切 除 术 前 比 正 常 对 照 低 50% , 比 普 应 中 同 样 具 有 主 要 组 织 相 容 性 复 合 体(MHC) 限 通 肿 瘤 组 低 30% ; 提 示 移 植 后 肿 瘤 宿 主 的 免 疫 失 制 特 性, 必 须 依 赖 抗 原 递 呈 细 胞 对 肿 瘤 抗 原 进 行 衡 可 能 受 到 来 自 免 疫 抑 制 剂 和 恶 性 肿 瘤 的 双 重 影 识 别、 加 工 和 呈 递 才 能 启 动 抗 肿 瘤 免 疫 反 应, 并 需 响。 不 论 普 通 膀 胱 癌 还 是 肾 移 植 后 肿 瘤, 当 肿 瘤 切 要 DCs 提 供 双 重 刺 激 信 号 完 成。 在 抗 肿 瘤 免 疫 中, 除 后 mDC 均 有 不 同 程 度 增 长。 提 示 恶 性 肿 瘤 对 树 DCs 对 肿 瘤 特 异 性 抗 原 的 交 叉 呈 递 是 激 活 肿 瘤 特 异 表 2? 各组患者肿瘤切除术前后 DCs 及亚群 年龄 DCs mDC pDC 组别 例数 P 值 P 值 mDC/pDC P 值 (岁,x) (%,x) (%,x) (%,x) 健康对照组 15 35.5 0.30 0.20 0.10 1.97 ?a ?a ?a 长期存活组7 31.0 0.15 0.09 <0.05 0.07 <0.05 1.02 <0.05 ?ab ?ab ?ab 移植后肿瘤组9 56.0 (术前)0.21 0.16 <0.05 0.05 <0.05 3.35 <0.05c c c >0.05 >0.05 <0.05 ?abc ?abc ?abc (术后)0.29 0.20 >0.05 0.07 >0.05 3.45 <0.05 ?ab b ?ab 普通肿瘤组 30 64.7 (术前)0.18 0.11 <0.05 0.08 <0.05 1.45 <0.05c ?ac c >0.05 >0.05 <0.05 b b bc (术后)0.21 0.13 >0.05 0.08 >0.05 1.55 <0.05注 : a : 与正常对照组比较 ; b : 移植后肿瘤组与普通肿瘤组比较 ; c : 与长期存活组比较