【doc】重金属离子对黑框蟾蜍蝌蚪生长发育的影响

【doc】重金属离子对黑框蟾蜍蝌蚪生长发育的影响 重金属离子对黑框蟾蜍蝌蚪生长发育的影 响 2008年5月 May2008 华南师范大学(自然科学版) JOURNALOFSOUTHCHINANORMALUNIVERSITY (NATURALSCIENCEEDITION) 2008年第2期 No.2,2008 文章编号:1000—5463(2008)02—0100—05 重金属离子对黑框蟾蜍蝌蚪生长发育的影响 江彬强,陈伟庭,李东风 (华南师范大学生命科学学院,广东广州510631) 摘要:采用红细胞微核和观察生长指标分析的探讨了Pb2,Cu2,Hg3种重金属离子对黑眶蟾 蜍蝌蚪生长发育的影响.结果明,Pb",cu",Hg使黑眶蟾蜍蝌蚪红细胞核异常率明显提高,其 平均红细胞核异常率分别达到3.76‰,2.2O‰,2.81‰,与对照组相比增长了6.52,3.40和4.62倍. 重金属离子在一定的处理时间和质量浓度下对黑眶蟾蜍蝌蚪红细胞有显着的诱突变作用.另外,实 验组的体长,尾长,体质量均低于对照组,Pb2处理组中的蝌蚪出现了明显的畸形现象. 关键词:重金属离子;生长发育;红细胞微核异常;蝌蚪;黑框蟾蜍 中图分类号:Q958.116文献标识码:A EFFECToF舰AWMETALIONONGROWTHOFTADPOLEOF TOAD(BUFOMELANOSTICTUSSCHNEIDER) JIANGBin—cang,CHENWei—ting,LIDong—feng' (SchoolofLifeScience,SouthChinaNormalUniversity,Guangzhou510631,China) Abstract:TostudytheeffectofPb,CuandHgonthegrowthanddevelopmentof tadpole(B咖melanostictusSchneider),micronucleiofredbloodceUswereobservedand growthtargetWaSanalyzed.TheresultshowedthatPb,Cu,Hgcouldraisetheeryth— rocytesofabnormalnucleusremarkablyandtheiraverageratewere3.76%0,2.20%0, 2.81%口respectively.Comparedtothecontrolgroup.theerythrocytesofabnormalnucleus rateincreasedto6.52,3.40and4.62timesrespectively.Theexperimentindicatedthat theheavymetalioncouldinducearemarkablemutagenesisoftadpole'Sredbloodcellsun— dercertaintreatmenttimeandconcentration.Inaddition,thebodylength,taillengthand bodyweightoftadpoleofthe~eatedgroupwaslowerthanthatofthecontrolgroup,andthe obviousmalformationappearedinthetreatedgroupbyPb"oftadpoles. Keywords:heavymetalion;growth;abnormalnucleusoferythrocyte;tadpole;8ufomel— anostictusSchneider 收稿日期;2007—03—20 基金项目:广东省科技资助项目(粤科计字2003.174) 作者简介:江彬强(1982一),男,广东梅州人,华南师范大学2002级本科生,现为华南 理工大学研究生;李东风(1958一), 男,吉林长春人,华南师范大学教授,主要研究方向:动物生理 学,Email:dfliswx@126.COrn. ?通讯作者 第2期江彬强等:重金属离子对黑框蟾蜍蝌蚪生长发育的影响101 随着现代工业的快速发展,水域污染日益严重.当水中重金属离子的质量浓度达到 一定 程度时,就会对水生动物产生一定的毒害作用.两栖动物中蛙类蝌蚪具有特殊生理 特性,可利 用皮肤呼吸.由于皮肤渗透性较强,对水中污染物的累积作用反应敏感,是监测环 境变化的良 好指示动物.结合蝌蚪的形态,行为以及某些生理指标等方面的变化可在短期内监测到环境 因子微小的变化. 据报道,重金属对蝌蚪影响作用主要是以急性毒性试验为主.研究表明,随着重金属离子 质量浓度的增加,对蝌蚪的毒性也不断增强.此外,环境条件和重金属种类对不同蛙类蝌蚪的 毒性也有所不同.而多种金属离子联合作用时,共同毒性又呈现拮抗,协同作用]. 广东经济在迅速发展的同时也产生了严重的环境污染.因此,研究重金属离子对蝌蚪生 长发育的影响,对广东地区环境变化的生物监测具有重要意义. 1材料与方法 1.1材料 4月中旬捕捉成熟的雌雄黑框蟾蜍,将其放于养殖池中产卵,以孵化7d龄的蝌蚪作为实 验材料. 试剂:乙酸铅,硫酸铜,硝酸汞,甲醇,磷酸缓冲液(pH=6.8),体积分数为10%Giemsa染 液(下同),Alsver液,体积分数为75%的酒精(下同). 1.2方法 将乙酸铅,硫酸铜,硝酸汞溶解后配成1000mg/L的母液,取若干母液稀释成不同的质量 浓度,在每个质量浓度中放进2O只蝌蚪,观察其存亡状况得出蝌蚪在Pb?,cu",Hg3种重 金属离子中可存活的浓度范围.然后根据此质量浓度范围将3种重金属离子分别设置4,8, 12,2O,32;0.005,0.01,0.02,0.04,0.08;0.01,0.02,0.04,0.08,0.12mg/L;同时设对照组1 个,每组放人出膜7d左右,大小相当的正常蝌蚪4O尾,3,4d换水并喂食1次.观察记录各 样本中蝌蚪的存活及生长情况.适时测量蝌蚪的体长,尾长和体质量. 在30d后从经处理后的每组中随机捞出蝌蚪,转移至自来水中,取血制片.用眼科镊子将 蝌蚪尾部剪断,让血液流出,然后滴到预先加有Alsver液的载玻片上,作血涂片,晾干,用甲醇 固定10min,10%Giemsa染液(pH值6.8)染色I3,15min,水冲洗,晾干.每只蝌蚪制作1张 涂片.在光学显微镜镜下观察,每张涂片观察1000个细胞左右,记录具有微核和核异常的细 胞数,观察结果以千分率(‰)表示. 2结果 2.1重金属离子对黑眶蟾蜍蝌蚪体长,尾长和体质量的影响 实验结果表明,随着Pb",cu",Hg质量浓度的增加,黑眶蟾蜍蝌蚪的体长,尾长和体质 量并没有明显规律性变化.3种金属离子与对照组中蝌蚪生长对比情况见图1,与对照组相 比,Pb",cu",Hg影响下的蝌蚪平均体长,尾长和体质量都略小一些. Pb", cu",Hg能使蝌蚪个体差异性增加.蝌蚪的体长约为1.1,2.4cm,根据此体长区 102华南师范大学(自然科学版)2008年 域划分为小型个体(1.1—1.52.0 cm),中型个体(1.5—2.Ocm) 大型个体(2.0—2.5cm)3个范1.4 围.对照组中蝌蚪以中型个体大i-- 小为主,比例达到50%一80%. 在Pb",cu",Hg'作用下蝌蚪0.4 中型个体比例有不同程度下降, 其余2种个体大小的蝌蚪特别对照 是小型个体的蝌蚪比例则有较图1重金属离子对黑眶蟾蜍蝌蚪体长,尾长和体质量的影响比较 大的增加.(图中各实验组的蝌蚪平均体长从左到右依次是1.66,1.73,1.7o,1.89cm, 平 此外,Pb+作用下的蝌蚪在均尾长是?.,?06,?o4,L15,平均体质量是0'03'0'.'._o4'._047) 生长发育中出现严重的畸形现象,而cu'和Hg'处理组中则未见此现象..其症状为:尾部和 胸腹连接处严重弯折,已影响到蝌蚪的正常游动,有些蝌蚪的后腿不能自由伸展张开,有时其 粪便排泄物呈白色,cu'和Hg'处理组中蝌蚪排泄物呈灰黑色. 2.2重金属离子对黑眶蟾蜍蝌蚪红细胞的影响 Pbn,cun,Hg'3种重金属离子对黑眶蟾蜍蝌蚪红细胞的影响情况如表l所示.结果表明, Pbn,cun,Hg'3种重金属离子使蝌蚪红细胞核异常率显着提高.对照组核异常率为0.50%o,而 Pbn, cun,Hg'3种离子的平均核异常率达到3.76%o,2.20%o,2.81%o,分别增长了6.52,3.4o和 4.62倍.其中设置的各个质量浓度中,红细胞核异常率最低的是0.005(nlg?L)/Cun, 为 1.24%o,比对照组增长了1.48倍;最高的是32(mg?L)/Pbn,达到6.68%o,增长了l2.36倍. 表1重金属离子对黑眶蟾蜍蝌蚪红细胞影响情况 第2期江彬强等:重金属离子对黑框蟾蜍蝌蚪生长发育的影响103 随着3种重金属离子质量浓度的增加,蝌蚪红细胞的核异常率也有缓慢增加,其中Pb处理 组上升趋势较为明显.同时方差分析显示,Pb",cu",Hg3种重金属离子对蝌蚪红细胞的 影响,其组内,组间的P值>0.05,差异并不显着. 黑眶蟾蜍蝌蚪红细胞的核异常现象以微核和胞内双核为主(见图2),其中微核所占总核 异常细胞比例达到54.6%,双核的比例是30.6%.而其余核异常现象出现较少.主要有微核, 双核,核碎裂,8字形核,核固缩,分裂不均匀和核空洞等. ????? ??圈??A为正常红细胞,B和C为微核,D和E为双核细胞,F为核碎裂,G为"8"字型核,H为核固缩,I为分裂不均匀.J为核空洞, 标尺:9.5 图2黑眶蟾蜍红细胞核异常情况 3讨论 3.1重金属离子对黑眶蟾蜍蝌蚪体长,尾长,体质量的影响 实验显示,Pb?,cu,Hg影响黑眶蟾蜍蝌蚪的平均体长,尾长和体质量,均小于对照组 中的蝌蚪,且蝌蚪的个体差异性都有所上升.这说明Pb",cu",}Ig对黑眶蟾蜍蝌蚪生长发 育有一定的影响作用.有所不同的是,Pb",cu",Hg3种重金属离子的质量浓度增加对蝌蚪 生长的抑制作用差异性不大.黄德军-6等研究镉对花背蟾蜍蝌蚪生长发育时发现,当镉质量 浓度过高时,在蟾蜍体内可能存在镉一镉拮抗作用,镉的毒性作用因此受到抑制而减弱. Pb", cu",Hg在黑眶蟾蜍体内可能也存在类似的拮抗作用.随染毒时间不断延长,Pb", cu",Hg在蝌蚪体内的累积量不断增加,当重金属累积量达到一定程度时便出现拮抗作用, 并使其毒性作用稳定在一个比较接近的水平.因此,不同质量浓度条件下Pb",cu",Hg对 黑眶蟾蜍蝌蚪生长的影响并没有显着性变化. 另外,Pb处理组中蝌蚪畸形现象严重,症状大多为尾部弯折.这一实验现象与尤静 等 人研究相似.他们认为畸形现象可能与蝌蚪尾部神经最早发育,而铅对神经系统有很大毒害 作用有关.重金属离子主要以呼吸道,消化道和皮肤3种途径进人动物的体内.铅对各种组织 均有毒性作用,其中对神经系统和造血系统的影响比较显着.动物体内未被吸收的铅会随粪 便等排泄物排除体外,所以Pb处理组的蝌蚪排泄物呈白色.铜在动物体内主要以有机络合 104华南师范大学(自然科学版)2008年 物的形式存在,对造血过程起重要作用.实验采用的硝酸汞属于无机汞,其毒性比有机汞要 弱,汞离子对动物的肾功能有破坏作用,并且能影响生殖和发育L1"].实验中Pb'处理组中 出现严重畸形的蝌蚪,而cu?和Hg处理组中未见此现象.这可能是因为3种重金属离子的 毒性和毒害作用部位不同所导致的,其真实原因尚待进一步研究. 3.2重金属离子对黑眶蟾蜍蝌蚪红细胞的影响 Pbn, cun,Hg3种重金属离子能够使黑眶蟾蜍蝌蚪红细胞的核异常率大幅度提高,最 大程度的增长达到12.36倍,说明Pb?,cu",Hg对蛙类蝌蚪具有较大毒害作用.随着Pb", cu?,Hg浓度的上升,蝌蚪红细胞核异常率缓慢提高,表明重金属离子随质量浓度的升高,其 毒性不断增大,这与前人研究报道结果一致j.而不同重金属离子质量浓度条件下,蝌蚪红 细胞的核异常率并没有显着差异,这与宏观方面体长,尾长和体质量的变化相一致,或许也是 与Pb?,Cu?,Hg在体内可能存在拮抗作用有关. 核异常是综合的细胞核损伤指标.核异常现象主要有:微核,双核,核碎裂,核固缩,"8"字 形核,核内空泡,核变形等.实验中蝌蚪红细胞核异常情形中微核占大多数,比例达到54.6%. 实验结果与贺维顺等在蝌蚪红细胞微核和核异常监测水污染的研究相似H.另外值得注意 的是,双核现象在红细胞核异常情形中也占据相当大的地位,占总核异常数的30.6%.双核的 外形和染色程度均和微核相似,仅形体大小有所差异.究竟双核现象如何形成和有何作用,与 微核有何联系尚还需要进一步的研究和探讨. 3.3蟾蜍蝌蚪在生物监测中的意义 生物监测是环境监测的重要手段,具有理化监测元可比拟的综合性,真实性和灵敏性,能 够反映出长期的环境污染对生态系统的综合影响信息,对于低质量浓度的甚至痕量的污染物 可迅速做出反应,显示出症状.目前环境监测主要以理化监测为主,缺乏环境标准相应的生物 监测指标. 在以往运用毒陛实验方法研究中,认为cu对中华大蟾蜍蝌蚪的安全质量浓度是0.026l mg/LlL4;汞对泽蛙蝌蚪的安全质量浓度是0.023mg/LJ.而本实验中,在O.02mg/LCu和 Hg条件下,黑眶蟾蜍蝌蚪红细胞的核异常率是2.28%o和2.36%o,分别是对照组的4.56倍和 4.72倍.因此,Cu和Hg在0.023—0.026mg/L下对于蟾蜍蝌蚪并非是安全质量浓度.可 见,通过微核实验,应用蛙类蝌蚪监测水体的水质与其他检测方法相比,具有独到 的灵敏性. 蟾蜍在中国分布很广,蟾蜍蝌蚪对环境因子变化敏感,利用蟾蜍蝌蚪作为指示动物监测水 环境污染有一定的实用前景【"J.通过微核试验,应用蟾蜍蝌蚪可快速检测出环境的变化,对 建立环境标准的生物监测指标,实现环境的生物监测有重要意义. 参考文献: [1]徐士霞,李旭东,王跃招.两栖动物在水体污染生物监测中作为指示生物的研究概况[J].动物学杂志, 2003.38(6):l1O—l14. 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