腺嘌呤对大鼠下丘脑-垂体-肾上腺皮质（HPA）轴的影响_20608

腺嘌呤对大鼠下丘脑-垂体-肾上腺皮质（HPA）轴的影响_20608 腺嘌呤对大鼠下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴的影响 [标签:来源] 作者:李淑雯 ，吴清和，黄萍，操红缨，石孟 【摘要】 目的通过研究腺嘌呤对下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴的影响，阐明其导致“肾 虚多尿”的机制。方法利用酶联免疫分析法分别检测正常组及腺嘌呤组血中促肾上腺皮质激 素释放激素(CRH)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、醛固酮(ALD)的含量;采用RT-PCR与免疫 组化的方法检测垂体ACTH mRNA及蛋白的表达。结果与正常组比较，腺嘌呤可显著减少大鼠 血中CRH、ACTH、ALD含量;并可下调垂体ACTH mRNA及蛋白的表达。结论腺嘌呤可影响HPA 轴的功能导致水液代谢的功能障碍，研究结果从内分泌系统调节的角度阐明了腺嘌呤导致“肾 虚多尿”的机制。 【关键词】 腺嘌呤; 肾虚多尿; 下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴 Abstract:ObjectiveTo explain the mechanism of deficiency of the kidney and diuresis by discussing the influence of adenine on HPA. Methods The contents of CRH、 ACTH、ALD in blood were determined, mRNA and protein expressions of ACTH with ELISA ,RT-PCR and IHC technologies in model group and control group.ResultsCompared with control group , adenine could remarkedly decrease the contents of CRH、ACTH、 cAMP in rat blood and mRNA and protein expressions of ACTH. ConclusionAdenine can decrease the contents of CRH、ACTH、ALD in rats blood and mRNA and protein expressions of ACTH by adjusting HPA. The results of the experiment expound the mechanism of deficiency of the kidney and diuresis adenine from HPA.. Key words: Adenine; Deficiency of the kidney and diuresis;HPA 下丘脑-垂体-肾上腺皮质系统(HPA)为人体重要的神经内分泌调节系统，调节着机体内 环境和外环境之间的相互平衡，内分泌系统功能障碍是虚证的重要表现之一，阴虚的患者通 常表现出HPA轴功能的亢进，而阳虚的患者通常表现出HPA轴功能的抑制。肾气充足，能温 煦膀胱，固摄有权，膀胱开阖有度，维持水液的正常代谢。若由于先天禀赋不足，或病后失 调，素体虚弱导致肾气不足，下元虚冷，失去固摄与司膀胱开阖作用，膀胱气化制约功能失 调，因而出现多尿、遗尿、小便失禁等，因此肾虚多尿的患者通常表现出HPA轴功能的抑制。 腺嘌呤模型为研究较多的“肾阳虚”模型，其引起“肾阳虚”表现的机制主要为代谢产物机 械性阻塞肾小管使肾组织中与糖、脂肪、蛋白质代谢有关的多种酶活性受到抑制，影响肾组织能量代谢因而导致畏寒肢冷、活动减少、反应迟钝、多尿等肾阳虚的表现,1,，其除引起肾阳虚的明显症状外，还会导致多尿的发生，目前对其在影响水液代谢方面的机制研究较少。本研究通过检测腺嘌呤对HPA轴各组成因素含量的影响，探讨了其影响HPA轴，导致水液代谢异常的机制所在，并从分子水平初步提示了作用靶点。 1 材料与方法 1.1 动物 SD大鼠，SPF级，雌雄各半，体质量160,180 g，由广东省医学实验动物中心提供，合格证号:2007A003。 1.2 药物与试剂腺嘌呤，上海昊化化工有限公司产品。大鼠CRH(促肾上腺皮质激素释放激素)、ACTH(促肾上腺皮质激素)ELISA试剂盒，大鼠醛固酮酶联免疫试剂盒(ELISA)，由美国ADL公司提供，批号:RT110371;Trizol reagent，美国Invitrogen公司提供;cDNA试剂盒，立陶宛Fermentas公司提供;Rabbit Anti-ACTH抗体为武汉博士德生物工程有限公司产品，目录号为BA0003，批号为20080501;EnVisionTM为DAKO公司产品，目录号为K5007，批号为104958-005(组分为HRP ARABBIT/MOUSE，SUBSTRATE BUFFER，DAB+ CHROMOGEN);抗原稀释液为广州深达生物制品技术有限公司产品，目录号为SA0701，批号为8060501;多聚赖氨酸(Polo-L-Lysine)和APES为武汉博士德生物工程有限公司产品，目录号为AR0003，批号为20080501。 1.3 仪器酶标仪，RT-2100C自动酶标仪，美国RAYTO公司产品;PCR扩增仪(DNA Thermal Cycler )，Biometra 公司产品;WO-9413B型凝胶成像分析系统，北京六一仪器厂产品;DYCP-31系列水平电泳仪，上海申能博彩生物科技有限公司产品;酶标仪:RT-2100C自动酶标仪，美国RAYTO公司产品;BINDER培养箱，USA产品;LEICA TP 1020组织全自动脱水机，德国LEICA公司产品;LEICA EG 1160生物组织包埋机及冷冻机，德国LEICA公司产品;CS-VI摊片烤片机，湖北孝感医用仪器有限公司产品;RS-18生物组织全自动染色机，湖北孝感医用仪器有限公司产品。 1.4 动物分组与给药根据改良Aston方法,2,对实验大鼠进行尿量筛选，将合格SD大鼠，随机分为正常组、腺嘌呤组，雌雄各半，腺嘌呤组按腺嘌呤150 mg/kg剂量灌服大鼠4周，每周测量体质量1次，调整造模给药剂量。于给药后第4周，用代谢笼收集24 h尿液检测尿量，眼眶静脉丛采血分别检测CRH、ACTH、ALD，颈椎脱臼处死，迅速取出垂体，一部分浸泡于10%中性福尔马林溶液中，组织梯度酒精脱鑫，二甲苯透明，常规石蜡包埋、切片，备免疫组化之用，其余两只作为一个标本，置于液氮中用于RT-PCR检测。 1.5 血中CRH、ACTH、ALD含量的ELISA法检测取血样用ELISA法检测，按照试剂盒说明书步骤进行。 1.6 RT-PCR法检测垂体ACTHmRNA的表达用Trisol试剂盒提取垂体总RNA，取1 μl进行RT-PCR分析。PCR引物由上海生物工程公司合成，ACTH引物序列为上游5’-GGGCAAGCGCTCCTACTCC-3’，下游5’-GGGGCGTCTGGCTCTTCTC-3’，依引物，PCR扩增目的片段长度为300 bp;同时扩增3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceral-dehydephosphate dehydrogenase，GAPDH)为内参照，其序列为上游5’- GGCAAGTTCAATGGCACAGT -3’，5’- AAGGTGGAGGAATGGGAGTT -3’，依引物设计，PCR扩增目的片段长度为725bp;实验过程按试剂盒说明书进行，PCR反应参数为94? 60 s，62? 60 s，72? 60 s，共32个循环，最后72? 充分延伸10 min。反应结束后，取PCR产物5μl于0.25 g/L琼脂糖凝胶上电泳，密度扫描分析PCR产物带，用Gel-pro 4.0凝胶分析软件分析结果。各组ACTH mRNA的表达水平以相对表达量即ACTH mRNA与GAPDH的比值来表示。 1.7 免疫组化法检测垂体ACTH蛋白的表达采用采用DAKO EnVision二步法显色系统，按照试剂盒说明依次切片脱蜡和水化、抗原修复、滴加一抗、EnVision孵育、DAB显色，最后二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察蛋白表达情况。 1.8 统计方法实验数据以?s表示，组间差异的显著性检验运用SPSS 13.0软件提供的非参数检验和单因素方差分析方法。 2 结果 2.1 一般情况观察结果与正常组比较，腺嘌呤组大鼠用药腺嘌呤灌胃1周后，出现畏寒肢冷、蜷缩拱背、多尿、活动减少、反应迟钝、喜扎堆、体毛枯疏、多尿等明显肾阳虚表现。 2.2 24 h尿量变化表1结果显示，与正常组比较，腺嘌呤组大鼠24 h尿量显著增加(P<0.01)。表1 腺嘌呤对大鼠24h尿量的影响(略) 2.3 对血浆促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)的影响表2结果显示，与正常组比较，腺嘌呤组大鼠血中CRH明显下降(P<0.01)。表2 腺嘌呤对大鼠血中CRH的影响(略) 2.4 对血浆促肾上腺皮质激素(ACTH)的影响表3结果显示，与正常组比较，腺嘌呤组动物血浆ACTH明显下降(P<0.01)。表3 腺嘌呤对大鼠血中ACTH含量的影响(略) 2.5 对血中醛固酮(ALD)的影响表4结果显示，与正常组比较，腺嘌呤组大鼠血中Cort、ALD明显下降(P<0.01)。表4 腺嘌呤对大鼠血中ALD的影响(略) 2.6 对垂体ACTH mRNA表达的影响见图1，及表5。结果显示， ACTH mRNA的相对拷贝数与内参做对比，得到ACTH mRNA表达的相对比值，结果表明腺嘌呤组大鼠垂体ACTH mRNA表达比正常组明显降低(P<0.01)。表5 缩泉丸对肾虚多尿大鼠垂体ACTHmRNA影响(略) 2.7 对垂体ACTH蛋白表达的影响见图2,3。结果显示，正常组大鼠ACTH细胞阳性物质定位于细胞浆和细胞膜，呈卵圆形、三角形及多角形。核周细胞质中有阳性颗粒，胞质呈棕黄色，高倍镜下呈颗粒状，染色深、排列紧密，垂体前叶、中间量散在强表达，垂体后叶表达较弱;与正常组比较，腺嘌呤组大鼠ACTH细胞阳性物质定位于细胞浆和细胞膜。垂体前叶基本未见表达，垂体中间叶表达明显减少，呈现弱阳性。 3 讨论 HPA 轴在人体的水液代谢中发挥了重要的调节作用。HPA轴通过调节下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)的合成和释放，刺激垂体分泌促肾上腺皮质激素(ACTH)，ACTH通过激活肾上腺皮质细胞膜上腺苷酸环化酶(AC)，促进cAMP生成，cAMP作为激素的第2信使，广 泛存在于一切细胞中，参与调节细胞生理生化过程而影响生物的生长、分化和细胞对激素的效应，是三磷酸腺苷(ATP)经AC作用的产物，可调节肾脏保水作用。cAMP与Ca2+协调发挥调节Na+、K+平衡生理效应，进而调节醛固酮的分泌影响水液代谢。ACTH为HPA轴的重要组成部分，其功能的降低一定程度上反映了HPA轴功能的低下。ACTH由腺垂体促肾上腺皮质激素细胞分泌而来，通过HPA轴发挥作用，即传递到肾上腺皮质引起类固醇激素的合成和分泌。其可与相应受体结合直接刺激醛固酮的分泌，是控制肾上腺皮质激素合成和分泌的重要因素;也可通过第2信使cAMP，协同Ca2+调节醛固酮的合成,3,。ALD最主要的生理作用是促进肾远曲小管和集合管潴钠、排钾，以维持体液容量和渗透压的平衡。血浆醛固酮浓度增高时，钠排出减少，大量的钠在肾小管内被重吸收，Na+的重吸收伴有K+的排出，在钠重吸收的同时，水的重吸收也增加，尿液排出减少。当其浓度减少时，钠排出增加，水的重吸收减少，尿量也随之增加,4,。给予ACTH后，血浆中这些激素的水平会很快升高;相反，ACTH分泌不足将导致类固醇激素产生相应减少。此外，肾阳虚证出现的一系列症状，如畏寒肢冷、腰膝酸软、尿频、多尿、精神萎靡等都与HPA轴功能低下密切相关。本实验研究结果也发现，腺嘌呤组大鼠血中CRH含量下降，因此其作用于垂体促进ACTH分泌的功能也可能会受到影响，从而导致血中ACTH含量的减少，ALD水平也因此而下降。ACTH的作用包括促进肾上腺皮质释放皮质激素，也是维持机体肾上腺正常形态和功能的重要激素。肾上腺皮质束状带与网状带细胞膜上存在ACTH特异性受体， ACTH与受体结合，可促进胆固醇酯转变为胆固醇，提供激素合成的原料。同时ACTH为HPA轴的重要调控激素，其含量的下降一定程度上反映了此轴功能的低下，并由此而引起“肾阳虚”的表现。RT-PCR与免疫组化实验结果表明，与正常组比较，腺嘌呤组大鼠垂体ACTH mRNA表达减少，ACTH蛋白阳性表达量减少，区域缩小，仅在中间叶有表达，前叶未见。说明腺嘌呤会导致垂体ACTH mRNA表达下调，ACTH蛋白阳性反应产物减少。ACTH mRNA和蛋白表达的减少使得ACTH功能减弱，HPA轴功能也相应减退。ACTH与肾上腺皮质束状带和网状带上的ACTH受体结合减少，因而通过肾上腺皮质对盐皮质激素合成与分泌的促进作用减弱，导致钠、钾离子转运的异常引起多尿。此研究结果从影响HPA轴功能的角度阐明了腺嘌呤导致“多尿”的机制。 【参考文献】 ,1,邵命海，肖 静，王毅兴，等(从“肾主生殖”角度评价腺嘌呤与氢化可的松诱导的肾阳虚模型,J,.上海中医药杂志，2008，2:57. ,2,王 蕾，姚东云，马红梅，等(中药利尿药理实验动物筛选方法探讨,J,.中国比较医学杂志，2006，11(11):694. ,3,Jun-Ho La,Tae-Sik Sung,Hyun-Ju Kim.Peripheral corticotropin releasing hormone mediates post-inflammatory visceral hypersensitivity in rats,J,.世界胃肠病学杂志(英文版) ,2008，14(5):731. ,4,张秀珍.内分泌代谢疾病与肾脏,M,.上海:复旦大学出版社，2004:35.