副溶血弧菌对西施舌致病性及其外膜蛋白研究（可编辑）

副溶血弧菌对西施舌致病性及其外膜蛋白研究（可编辑） 副溶血弧菌对西施舌致病性及其外膜蛋白研究 福建农林大学 硕士学位论文 副溶血弧菌对西施舌致病性及其外膜蛋白的研究 姓名:李萍 申请学位级别:硕士 专业:临床兽医学 指导教师:王寿昆 20090401副溶血弧菌对西施舌致病性及其外膜蛋白的研究 中文摘要 副溶血弧菌功是一种革兰氏阴性嗜盐菌,其引起的 疾病,发病率高,流行范围广,危害严重。弧菌病害是限制我国海洋鱼类贝类 等 海洋经济动物养殖业发展的最主要因素之一,我国对鱼类的相关报道较多, 但对 贝类的相关报道较少。 西施舌等无脊椎动物不能产生免疫球蛋白,缺乏抗体介导的特异性免疫反 应。研究表明,合适的免疫刺激剂可以增加生物机体非特异性免疫能力,提高 其整 体抗病机能。 锄砌 外膜蛋白 是细菌表面的有效抗原之一,用细 菌制备的疫苗,可保护机体抵抗同型或异型菌的攻击,其具有免疫原性且 能诱导保护性免疫反应已经得到证实,而且利用现代生物技术很容易提取, 因此研制开发疫苗具有广阔的前景。 对细菌耐药性的监测和耐药机制的研究已成为当今十分活跃的世界性热门 课,研究多种致病菌对抗生素的耐药性,可为耐药性的监控和多种细菌病 的防 治提供科学依据。 鉴于此,本实验通过副溶血弧菌对西施舌人工感染,连续观察,发现副 溶血弧菌对西施舌具有很强的致病性,死亡率随感染剂量的增加而增大,外 观病 理变化显著,取患病西施舌肠道、斧足、出水管、生殖腺、外套膜做石蜡切 片后 观察,各部分均出现了不同程度的病理特征,尤其上皮细胞变化显著; 以十二烷基肌氨酸钠法提取.法测定其蛋白分子量, 法测定浓度,发现不同培养条件温度、、培养基对 有不同的影响;培养时间对.无影响。 用.免疫西施舌后攻毒,连续观察,测得对西施舌免疫保 护率高于全菌灭活苗,并且高浓度免疫保护率高于低浓度免疫保护 率,各项免疫指标抗菌活力、溶菌活力、吞噬能力都有不同程度的提高。用 药敏纸片法测定了副溶血弧菌、鳗弧菌、拟态弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单 胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌种细菌对种抗生素的耐药性,发现不同 细菌对不同抗生素有不同程度的耐药: 综上所述,本实验通过副溶血弧菌对西施舌的致病性研究,外膜蛋白 的提取和不同培养条件下的,.对西施舌非特异性免疫的初步 研究以及种细菌的药物敏感实验,为珍贵贝类细菌性疾病病理研究,疫苗 的研究,贝类非特异性免疫以及耐药性的监控提供了理论依据。 关键词: 外膜蛋白; 副溶血弧茵; 西施舌; 非特异性免疫; 抗生素 御咖 倒, , , ,谢 . . ., . , . . . . ,. . , . , .., , 诵 . , . , , , , .,,, ? ;? 、? ,? 曲. / . 矿,矿 矿矿, , 砒 , , . , , ,? . : ; ;; ; 独创性声明 本人声明,所呈交的学位毕业论文,是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果,并且是自己撰写的。尽我所知的研究成果。与我一同对本研 究做 出贡献的同志,都在论文中作了明确的说明并表示了谢意,如被查有侵犯他 人知 识产权的行为,由本人承担应有的责任。 .。? 靴弹蚴敝?镒轹孪讶啸 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位毕业论文的规定,即学 校有权送交论文的复印件,允许论文被查阅和借阅;学校可以公布论文的全 部或 部分内容,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密,在 年后解密可适用本授权书。 不保密,本论文属于不保密。 影 学位毕业论文作者亲笔签名: 日期.莎多?一 肝彳 指导教师亲笔签名: 日期: ?石玩 。/。。第一章前言 副溶血弧菌的毒力因子和致病机理 副溶血弧菌 巧是一种革兰氏阴性嗜盐菌,主要分布 于沿岸海水、海河交界处咀及鱼类和贝类等海产品中,是海水养殖主要的病 源苗 之一。由弧菌引起的疾病,发病率高,流行范围广,危害严重,每年都造成极大 的经济损失【。此外副溶血弧菌还存在于食品中,人感染可引起严重的肠胃 炎等 疾病嘲. 溶血毒素 溶血毒素是副溶血弧菌最主要的致病因子,日前研究认为副溶血弧苗主要的 溶血毒嘉有、和。 耐热直接溶血毒素胁基因是副溶血弧菌最主要的毒力基因,临床上 分离的超过%是阳性株,即神耐川试验阳性株?,而环境中分离的副溶 血弧菌只有%~%是阳性株,现象长期以来被作为判定副溶血弧菌有无 致病性的一个重要指标,并在临床上得到广泛的应用。阳性株含有瑚堪因的 个拷贝棚和,超过%的阳性株中具有表达优势,等】 通过纯化并克隆了相应基因,发现硒基因之间具有%以上的相似性,可以 通过基因的保守序列对副溶血弧菌进行的快速检测。 相对耐热直接溶血毒素卿能产生一种与?,无关的新的溶血毒素, 它与有相似的免疫原性,有部分交叉的抗原性,由基因编码,具有溶血 作用和肠毒素作用,和的氨基酸序列具有%的同源性阁。 不耐热溶血毒素是一种非典型的磷脂酶,在卵磷 脂条件下才有溶血活性,能够熔解人和马的红细胞,主要分泌于蝴胞外。但其 在 中的功能和致病性尚未清楚嘲。编码的基因砌具有种属特异性,位于染色 体上,为、,的快速检测提供了程好的依据。 .其他主要致病因子 屎素酶 研究表日尿素酶和椭关系密切,尿素酶阳性的副溶血弧菌通常 也携带扩基因口朋,两者存在着正向相关,尿素酶结构基因耵和衲两者的关联与它们在染色体上的遗传连锁有关。 蛋白酶等【】研究发现,在其没有和基因的情况下,有微弱的溶血 现象发生,并在其胞外蛋白中分离到一种分子量为的丝氨酸蛋白酶蛋白酶 ,其可以溶解红细胞但对热敏感,是副溶血弧菌的一个潜在的毒力因子。 .副溶血弧菌的致病机理 是一种孔蛋白,能够通过在细胞膜形成小孔通道从而使细胞内外的离 子浓度发生一定的改变,当细胞渗透压的改变超过细胞的调节能力时,细胞就会发 生病理和形态学的变化,并导致细胞的膨胀甚至死亡,在高浓度范围内会破 坏上皮细胞而增加副溶血弧茵的侵袭力,并使胆汁酸浓度增加【们。作为一种 肠毒素,能够通过刺激肠黏膜上的腺苷酸环化酶活性以及影响肠上皮细胞中离子 的正常运输而引起分泌性腹泻【。 另外,等刁从副溶血弧菌的染色体上克隆了一段包括砌基因和 合成尿素酶的基因簇的区域,发现在砌阳性的副溶血弧菌中,有个开放阅读 框架存在于和其他基因之间,并与大肠杆菌的镍转运操纵子具有较高的 同源性,而在这段区域的末端存在一种类似插入序列的元件,该区域通过插 入序列的调节机制被引入副溶血弧菌中,并且在靴基因簇附近存在与结合的 镍转运体系的基因,而该基因可能与镍在细菌细胞质膜上的转运相关。 是一种非典型的磷脂酶,本身没有溶血活性。而属于何种磷脂酶仍 然存在一定的争议,因此对其的致病机理研究还需进一步完善,目前多利用 其种属 特异性的特点对副溶血弧菌进行快速检测。 细菌外膜蛋白的研究现状 细菌外膜 是革兰氏阴性菌细胞壁中的特有结构,位于细 ,约占细胞壁干重 菌胞浆膜内膜和肽聚糖层的外侧,包围整个细菌,厚 的%,是典型非对称性的磷脂双层结构【】,由脂质双层、微孔蛋白、脂蛋白、 脂 多糖组成的 图.在细菌的生命活动中有营 养摄取、代谢物质的运输、细菌正常形态的持续以及物质的合成、抗药等重 要作 用。了解的结构和功能有助于揭示其诱发保护的机理,了解在诱导免 疫应答是与免疫细胞的相互作用,并为确定的有效最小抗原结构和研制 菌苗奠定基础 曼圈 圈外膜蛋白的结构 】的生理功能 要作用足维持外膜的完整。此外,大肠埃希氏菌的还可作 为不同噬菌休的受体,在受体细胞的充分连接和与受体结合的大肠埃希氏菌素的 内转功能上所必需四。大肠埃希氏苗的 构成了 的孔,此孔径允许营养物 质快速透过细胞外膜。在 缺乏的细胞中,四环素丰动溢现象是 一种抵抗机制.当和整合成 时,以不带电荷形式穿过外 膜的功能区.体现了微孔蛋白对带不同电荷抗生素过筛性质的离选择反应?。 构成了 的孔,此种孔能把胆汁盐排斥在细胞外,并 能减慢营养物质透过膜的速度。大肠埃希氏苗外膜嗜铁体夏台物的主动转移足由 和外膜受体蛋白和.?蛋白复合物介导的所需能量 由胞浆膜上的化学电势能来提供。的免疫原性 细菌表面的肯效抗原除了鞭毛以外,还有脂多糖和外膜蛋, 虽然有良好的像护作用,但卫因为某蝗副作用而受到限制。而则以其性质 温和,反应轻微,效果良好等优点受到了关注。 动物机体的免疫系统受到抗原刺激后.免疫细胞对抗原分子识别并产生一系列的连锁反应。抗原特异性淋巴细胞淋巴细胞、淋巴细胞对抗原识别、 活化、增殖、分化,最后产生免疫效应因子,表现为体液免疫和细胞免疫。 用丙酮灭活的鼠伤寒沙门氏菌及该菌的微孔蛋白和分别免疫小白鼠,结 果表明用微孔蛋白和比用丙酮灭活菌有较高的淋巴细胞增殖反应。空肠 弯杆菌的在体外对小白鼠脾淋巴细胞也具有较好的多克隆激活作用,是一种特异性较高、抗原性较强的。用鼠伤寒杆菌 免疫小白鼠即可 诱导产生特异性抗体并保护倍细菌量的攻击,同时还可诱导产生变 态反应,表明御具有较强的免疫原性和细胞免疫能力‘】。不仅存在于细菌中的 天然对免疫细胞有激活作用,就是人工合成肽也有同样的作用。 铁是细菌生长所需的营养物质,在动物组织中细菌获得的铁含量远远低于其 生长需要,铁限制环境导致细菌代谢和外膜成分的改变。等【发现 在铁贫乏的环境中,大肠埃希氏菌合成了一种低分子量的铁螯合物和在铁含量充 足时不能合成的。在制各菌苗时所用的培养基常含有高水平的铁,因此这些 菌苗不可能含有产生大肠埃希氏菌铁调节,又因为铁调节具有被动免疫 保护作用,因此在制备菌苗时所用的培养基应限制铁的含量。。在铁含量限制条件 下培养的脑膜炎双球菌,用其免疫小白鼠产生的抗体可被的铁限制诱 导所识别,也能与完整的细胞发生反应,表明的为表面暴露的抗 原【删。很多研究表明,培养条件温度、时间、、培养基等影响的表 达。 用细菌制备的疫苗,可保护机体抵抗同型或异型菌的攻击。细菌个体很 小,提取费时费力,但随着分子生物学的发展,通过遗传工程大量获取 的设想已成为现实。 . 的致病作用 病原菌的致病作用必须能够逃避或适应宿主的防御,许多研究已证实,某些 细菌的在细菌致病过程中起着重要的作用。 有助于细菌对宿主细胞的吸附,与细菌的菌毛一样,吸附可以引起病原 体的内转和入侵,也能引起细菌的外部产物释放到真核细胞表面。大肠埃希 氏菌 :的一种具有免疫原性,并且可能为一种很重要的致病因素 【。 【冽等发现禽源鼠败血棒 有助于细菌逃逸机体的免疫防御。 状杆菌的有抗吞噬作用,针对这种蛋白的抗体也能够保护火鸡抵抗致 死量的鼠败血棒状杆菌的攻击。用大肠埃希氏菌 基因对突变体进行矫正 后重新获得同等的毒力。引起蜂窝织炎的禽大肠埃希氏菌分离株都有种铁 调节,这些蛋白均与其血清抗性有关。因此,细菌的通过抗吞噬、抗补体 及抗血清杀菌作用而对细菌的致病过程起着非常重要的影响。 细菌的的致病作用。往往是在完整的细菌中才可表现,并与其它致病因 子协同作用。迄今为止还没有试验来证明提纯的和表达的具有致病性 而提纯的和通过基因工程表达的具有良好的免疫原性和保护作用的 事实早已证实。利用具有免疫保护作用的性质制作疫苗,应考虑到细菌在不 同条件下成分会发生改变,因此需要对其生长条件进行控制,使其向有益于 作为保 护性疫苗的方向发展。 贝类免疫系统和机理的研究进展 贝类养殖是我国海水养殖支柱产业之一,目前,贝类的病原体主要包括细菌、 真菌、孢子虫、鞭毛虫、纤毛虫、变形虫、吸虫、绦虫、线虫、腹足类和一些甲 壳类?】。世纪年代,新的贝类病原体被发现,比如:牡蛎中发现的立克次氏体 和支原体【】。随着贝类养殖业的迅速发展,其病害越来越严重,现在已成为贝 类养殖业发展的“瓶颈问题,研究贝类免疫学,以解决贝类养殖中的病害问题 已经迫在眉睫。 .血细胞的分类和结构 由于学者们运用的材料和不同,对贝类血细胞的结构和分类尚无统一的 标准。在世纪.年代学者们主要依据血细胞中颗粒的有无及对染色的反应 将贝类血细胞分成不同的类型。目前化学染色、显微镜技术、流式细胞技术、单 克隆抗体、免疫探针技术、密度梯度离心、酶细胞化学等几种技术在贝类血细胞 分类的研究中有了新的进展。等【通过细胞化学染色方法将栉孔扇贝的血 细胞分为颗粒细胞和透明细胞。刘东武等网用流式细胞术将中国蛤蜊 和紫石房蛤 两种贝类的血细胞分为透明细胞、小 颗粒细胞和大颗粒细胞类; 等【】利用流式细胞仪结合细胞化学染色将美 洲牡砺的血细胞分为颗粒细胞、非颗粒细胞和小颗粒细胞,将菲律 宾蛤仔 衄血细胞分为颗粒细胞和非颗粒细胞。 等【通过形态观察和细胞化学研究,认为 存在类血细胞,命名 , 为嗜酸性颗粒细胞、无颗粒细胞 、桑葚样细胞 并发现类细胞在吞噬作用和血细胞凝集等过程中表现不同的功能。一般认为, 贝类血细胞应分为大类:颗粒细胞、透明细胞和纤维细胞。 .血细胞的功能 血细胞是贝类抵御系统的最重要的部分,可进行炎症、伤口修复、呼吸爆发、 吞噬和包囊等作用。 吞噬功能 贝类的主要防御手段是由血细胞完成的吞噬作用, 吞噬作用能够清除入侵的病原体包括细菌、原虫、大分子物质及无机颗粒等。当 外界条件改变,尤其是动物受到外界抗原物质刺激时,贝类的主要表现就是吞噬 反应和炎症反应例,而且其血细胞吞噬外来异物时,清除的速率大小取决于细 胞表面的特征。在大多数报道的贝类中,吞噬作用主要是由颗粒细胞完成的,颗 粒细胞表现出很高的吞噬能力,而且其吞噬能力与年龄无关,将吞噬过 程分为趋化、接触、内化个阶段。 呼吸爆发 在呼吸爆发过程中测定已在很多贝类血细胞中报道过。 等对紫贻贝血细胞吞噬作用的化学发光进行了分析,收集不同密度梯 度离到的血细胞,最终确定最大化学发光活性是由嗜酸性粒细胞造成的,由 此认为伴随吞噬作用的活性自由基主要由嗜酸性粒细胞产生。贝类的血细胞会释 放一些毒性物质来杀灭和消化病原微生物,这些毒性物质中有一类是血细胞在吞 噬过程中经历呼吸爆发释放的活性氧中间体。 其他免疫功能除吞噬作用之外,炎症、包囊、损伤修复、移植排斥等也是 血细胞参与的免疫功能,血细胞在这些过程中表现出不同的功能,这些功能的核 心问题是血细胞对异物即非我的识别机制,目前这方面的研究工作较 少。 . 贝类体液活性因子 贝类的体液中不存在血细胞和血细胞系统以及免疫球蛋白,所以其体液 免疫的手段主要包括由血细胞分泌的各种水解酶类,非特异的抗菌肽类,高等动 物细胞因子类似物,调理素和凝集素等来完成。 贝类血细胞中的水解酶类是重要的非特性免疫手段,这些酶由血细胞的溶酶 体与质酶融合后分泌到胞外,参与贝类的移植、包囊、损伤、病原物清除等过程。 在贝类中已发现有类儿.,几.,.,,样细胞因子存在,可以刺 激高等动物血细胞的增殖与分化,激活免疫功能。 .对外源致病菌的反应等】认为贝类对病原菌的抗性由多基因控制特异性;而且对不同 致病菌的抗性之间有紧密的协同作用。许多进入体内的细菌在凝集素的作用下很 快会成团,接着吞噬细胞将其吞噬,然后进行细胞内消化而杀死这些细菌。对 大多数可降解的物质,通过血细胞渗出来处理跨上皮运输。牡蛎能有效的消灭 致病性细菌和酵母。部分微生物能在注射后 内在组织生长,血细胞数量 因受病原刺激而增加。但在消除病原菌方面血细胞种类比数量更为重要。 抗生素的主要作用机理 等【认为抗生素的作用机理主要有以下五种: .抑制细胞壁的合成 青霉素、万古霉素等抗生 素作用于某些有细胞壁的真菌、细菌,而对宿主本身没有毒性作用。通过抑制细 胞壁的肽聚糖的合成,引起细胞壁通透性改变,大量水分进入细胞浆中而引起细 胞的裂解。 .抑制蛋白质的转录或合成 链霉素、庆大霉素 等主要作用于细菌核糖体的亚基,改变它的形状,导致不能被正常地 翻译而引起蛋白质合成受阻。 .破坏胞浆膜的完整性抗真菌的药物,如两性霉素,主要 是与真菌细胞胞浆膜上的一些磷脂成分结合,破坏胞浆膜的完整性,从而导 致细 胞的裂解。 .影响细菌的代谢途径磺胺类抗菌药,因与氨基苯甲酸 的类似,可以竞争性结合对氨基苯甲酸酶,使四氢叶酸盯减少, 而是合成嘌呤和嘧啶核苷酸的重要辅酶。细菌体内严重缺乏,从而导致 细菌细胞内的代谢混乱而引起细菌的死亡。.抑制核酸的合成 一些核苷酸的 类似物,可以插入到或链中, 导致或复制过程中的错配,而干扰其正常的功能。而喹诺酮 、氟喹诺等可以特异性地抑制解旋酶的活 性,抑制细菌复制时解螺旋,导致复制的受阻。 本论文研究的目的和意义 弧菌病害是限制我国海洋鱼类贝类等海洋经济动物养殖业发展的最主要因 素之一,副溶血弧菌引起的疾病,发病率高,流行范围广,危害严重。近年来我 国对海水养殖鱼类细菌性病原的报道较多,但对贝类的相关报道较少。研究 副溶 血弧菌对西施舌的致病性,可为某些珍贵贝类细菌性疾病病理方面的研究提供可 靠的理论依据。 细菌表面的有效抗原除了鞭毛以外,还有脂多糖和外膜蛋白? ,脂多糖虽被证实能提供良好的保护作用,却又因某些副作 用使其应用受到限制。而?则以其性质温和、反应轻微、效果良好等优点受 到了关注。细菌制备的疫苗,可保护机体抵抗同型或异型菌的攻击,其具 有免疫原性且能诱导保护性免疫反应已经得到证实,而且利用现代生物技术很容 易提取,因此研制开发疫苗应具有广阔的前景。研究不同培养条件对 的影响以及其对贝类的非特异性免疫效果,可为向保护性疫苗的方向 发展提供理论依据。 对细菌耐药性的监测和耐药机制的研究已成为当今十分活跃的世界性热门 课题,研究多种致病茵对抗生素的耐药性,可为耐药性的监控和多种细菌病的防 治提供科学依据。 第二章副溶血弧茵对西施舌的致病性研究 西施舌 属于瓣鳃纲,真瓣鳃 目,蛤蜊科,腔蛤蜊属,其 具有很高的营养和食用价值,在贝类中可与鲍鱼媲美,是海产珍品之一,有“海 珍之首”之誉。 目前为止,部分学者对西施舌的生活史【】、核型分析【蚓、增养殖【孓刀及免 疫学四生理生化【等进行了研究,分子生物学方面的研究也有少量报道,但 未有病理方面的报道,鉴于副溶血弧菌的流行特点及西施舌的价值,预用人工感 染的方法,研究副溶血弧菌对西施舌的致病性,对某些珍贵贝类疾病的防治提供 可靠的理论依据。 材料和方法 .实验材料 实验动物试验用西施舌购自福州南台农贸市场,用玻璃缸饲养,温度 ?,盐度%,.左右的自然海水,按正常饲喂、正常通气并换水,随机分组, 每组只。 菌株致病性副溶血弧菌福建省出入境检疫局 .主要仪器和试剂 仪器:超净工作台、光学显微镜、生化培养箱、冰箱、电子天平、超纯水仪、 切片机干燥箱、低速离心机、立式压力蒸汽锅 试剂:蛋白胨、酵母浸膏、结晶紫、氯化钠、氢氧化钠、酒精、二甲苯、 福尔马林、冰乙酸、苦味酸、重铬酸钾、硫酸石蜡、蛋白甘油、苏木精、伊红、 中性树胶 .主要工作液 布恩氏固定液 重铬酸钾硫酸洗液 盐酸酒精 副溶血弧菌增菌液 染色液 .实验方法 ..人工感染 将细菌接种于副溶血弧菌增菌液,培养,低速离心收集菌体,弃上 清,灭菌生理盐水重悬,重复离心次,弃上清,重悬。 /不同浓度,每只 用稀释涂布平板法四测定菌浓度,稀释成. 斧足注射菌悬液.,每天正常饲喂并通气换水,连续饲养观察,随时 发病症状及死亡情况。 取患病西施舌肠道,斧足,出水管,生殖腺,外套膜等组织制作石蜡 切片,采用染色法,在显微镜下观察各组织的病理变化并拍照。 ..石蜡组织切片的制作程序【 固定一修块一脱水一包埋一切片一髓染色一拍照 所取组织布恩氏固定液固定,不少于。 载玻片及盖玻片的制备 新载玻片用重铬酸钾硫酸洗液浸泡后,自来水冲 洗,烘干后%酒精浸泡,浸泡后烘干,用绸布擦拭。 组织包埋及切片从固定液中取出组织块,修块,水洗%酒精 %酒精%酒精%酒精%酒精无水酒精两次, 每次一:二甲苯与无水酒精甲苯至组织完全透明一溶化石蜡浸蜡 一包埋一修蜡块一切片 ,粘附于涂有蛋白甘油的载玻片上一将玻片置 于?温箱内过夜。 苏木素.伊红脏染色程序将烘干切片二甲苯两次脱蜡,每次一 无水酒精次,每次一%酒精%酒精%酒精% 酒精一水洗一苏木精一水洗一盐酸酒精分化水中蓝化 一伊红一水洗一干燥一中性树胶封固一干燥一光学显微镜观察各组织病理 变化。 结果与分析: .人工感染后连续观察死亡情况 表.人工感染后连续观察西施舌死亡情况死亡率随感染剂量的增大而增加, 感染剂量. ..×死亡率分别为 %、%、%;为当感染剂量为.× /时,实验西施舌在第全 部死亡,.×/时,第全部死亡;而对照组则无死亡。细菌密度越 高,死亡率越高,而且死亡集中,潜伏期相对较短;反之则潜伏期长,死亡持续 时间亦长表.。 .宏观病理变化 患病西施舌闭壳肌松弛无力,两片贝壳不能紧密闭合,斧足伸出壳外图, 对刺激的反应迟钝,壳缘壳内有大量粘液,离水不久体液溢出,与自然死亡的 西施 舌很相似。解剖后对比健康西施舌图.可以发现软体部分相当消瘦,肉色又 乳白色变成淡黄色图.,,剖开腹腔对比健康西施舌图.可见腹腔呈现 灰白色图,消化道内无食物,或者有少量的食物。 .微观病理变化 见图.~.: 圈茹囵 一囵 尹二旦 图.健康的西施舌 图内脏团学现灰白色.消化道内无食 物或者有少带的食物 ?? ?, 盯 爹 ‘习??眄 圈 。二二一:‘兰?.一 一一.? 图健康两施舌内脏团 图击健康肠管×。 .嚣 ?九 图健康肠管山排列整齐的单层柱状 图病变肠管纤毛萎缩脱落.上皮细胞变 纤毛上皮纤毛致密肌肉组织和结缔组织 形,脱落甚至溃散× 构成× 曙 . ”‘ 不, ? 』 ×四 ×翻病变足部肌肉结构琉松,部分肌纤维 圈一足由致密结缔组构成, 表皮背有单 断裂,背覆上皮大量脱落 层柱状纤毛上皮× ?“ 锄 × × 图病变出水管上皮细胞排列紊乱,肌 幽健康出水管上皮细胞紧凑规则,肌肉 屡痛细胞溃散× 层有致密结缔组织勾成.整齐有序× ?‘ ? 四 ? . %? 衄? × 陶.健康生殖腺滤泡为长椭圆形或者圆 圈.病变生直腺很多滤泡和鲇缔组织消 形.结构清晰,中问有壤松结缔组:填充 失.有血,炎性织【没润× × ? 睫 . 亡.: 】四% 锄,髂 × 蚓.病变外套;上皮松敞脱落,结缔组; 圈健康外套膜皮细胞规则有序,结 溶解× 缔组织整齐完整 ?. ?.? 女讨论 副溶血弧菌是养殖的常见致病菌,也是双壳类软体动物的致病菌之一,据报 道,目前已有个国家发生了副溶血弧菌病,侵染种海洋鱼类【】彳艮多研究 表明多种病原对水产养殖的病理危害。。 本研究发现,副溶血弧菌对西施舌亦有很强的致病性,感染剂量.× ..×均出现不成程度的死亡,外观病理变化明显,通过病理切片可以发现, 西施舌肠道,斧足,进出水管,生殖腺,外套膜均有病变。用肌肉注射的方法 将细菌茵夜注入到健康西施舌的斧足中,细菌可能经血淋巴循环到达其他组 织器 官细胞中生长繁殖,副溶血弧菌致病因子破坏了肠道,斧足,出水管,生殖腺, 外套膜细胞的正常结构,使生理机能衰退直至死亡。此在病理组织学上,为西 施 舌的弧菌病提供了重要的依据。 贝类的主要防御手段吞噬作用,其能够清除入侵的病原体包括 细菌、原虫、大分子物质及无机颗粒等,当外界条件改变,尤其是动物受到外界 抗原物质刺激时,贝类的主要表现就是吞噬反应和炎症反应。 吞噬作用的过程大致可以分为趋化、黏附、内吞以及杀伤消化四个阶段。研 究证明贝类血细胞可以向外源颗粒趋化靠近。贝类具有开放式循环系统,器官浸 浴在血淋巴中,血管也没有完整的内皮系统,血细胞可以较自由地到达广泛的器 官和组织,与外来物质的接触较为充分,血细胞靠近异物后首先发生黏附,随后血 细胞伸出伪足对异物进行包裹,伪足相接触后细胞质膜融合,形成吞噬体 进入细胞细胞完成对异物的吞噬后,通过两条途径对其进行处理。 一是吞噬体与溶酶体融合。其内容物被溶酶体中的水解酶类消化降解,另一条途 径通过伴随吞噬作用的呼吸爆发 产生大量活性氧自由基,杀伤 吞入的微生物。由于病原体的大量繁殖,使得细胞免疫机能发生“错乱”,吞噬 细胞可能难以分辨异物与自身物质的差别,误对大小结构与细菌线粒体等细胞器 相似的异物加以吞噬,线粒体的缺乏,导致整个细胞功能的衰退,最终死亡。 第三章不同培养条件对外膜蛋白的影响 细菌外膜 是细菌表面的有效抗原,在细菌生命活动中起 重要作用,并且其具有免疫原性早已得到证实。利用具有免疫保护作用的性 质制作疫苗,应考虑到细菌在不同条件下成分会发生改变,因此需要对其生 长条 件进行控制,使其向有益于作为保护性疫苗的方向发展。 材料和方法 .实验材料 菌株为致病性副溶血弧菌,福建省出入境检疫局提供。 .主要仪器和试剂 仪器: 超净工作台、生化培养箱、低速离心机、高速冷冻离心机、电泳仪、 超声波细胞粉碎仪、移液枪、立式压力蒸汽锅、紫外分光光度计 试剂:蛋白胨、酵母浸膏、结晶紫、氯化钠、三羟基氨基甲烷、盐酸、/ 乙醇、丙烯酰胺、,.丙烯酰胺、溴芬蓝、、过硫酸铵、甘油、.巯基 乙醇、、甘氨酸、考马斯亮蓝、磷酸、盐酸、乙醇、牛血清白蛋白、标准蛋 .,?.、 白 & .,.主要工作液 . .缓冲液. 缓冲液 .缓冲液. %分离胶 %浓缩胶 %溶液 %过硫 酸铵 电极缓冲液 .% 蛋白上样缓冲液 染色液 脱色液 的.缓冲液 .方法 .. 细菌外膜蛋白的提取【朋 将细菌接种于增菌液,培养; . 低速离心收集菌体,用 /的缓冲液洗涤次 ;于波长处读取菌夜的值,若值大于., 则能收集到足够的外膜蛋白; . /的.缓冲液,超声波破碎 沉淀加入 ”; 离心,,取上清; 离心 ,弃上清; 的.缓冲液中,作用; 沉淀溶解于含.% 离心 ,弃上清; . 用 /的缓冲液洗涤沉淀次; 沉淀溶于重蒸水,.?保存; .. .聚丙烯酰胺凝胶电泳 采用非连续缓冲系统垂直板电泳参照的方法【叼 电泳槽板的清洗和安装 先将电泳玻璃平板洗干净,用%乙醇擦净,晾干, 固定: .凝胶配制和注胶按比例配制好浓缩胶.%和分离胶%; 将分离胶混匀后沿玻璃板壁缓缓注入已准备好的凝胶模子中,注胶过程中防 止气 泡产生,胶液加到玻璃板项部处,立即用注射器覆盖厚的水层进行 水封,大约后垂直静置聚合,倾去水封层的蒸馏水,再用滤纸条吸去多余 水分。立即将浓缩胶液注入到已聚合的分离胶上方直至距玻璃板上缘.处, 插好样品梳。样品梳得下端应距离分离胶,浓缩胶高约,聚合后,取出 样品梳。用窄条滤纸吸去样品凹槽内多余的水分,将电极缓冲液搅入到贮槽 内, 即可准备加样: 样品处理准确吸取蛋白质样品,在蛋白样品中加入蛋白上样缓冲液, 水浴加热,蛋白质在和.巯基乙醇的作用下变性,形成紧密的棒状 .蛋白质复合; 上样冷却的室温后,用移液枪加样; 电泳加样后,,接通电源,当溴酚蓝即将跑出时,即可停止电泳;电泳约 需; 染色 电泳结束后将凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中,至于水平摇床上 染色,然后用水洗去凝胶表面的染料,放入考马斯亮蓝脱色液中,于 ?脱色,期间要经常更换脱色液,直到蛋白区带清晰,用直尺分别量取各条带 的距离; 以相对迁移率阑为横坐标,相对分子量为纵坐标,在半对数坐标 纸上作图,可得到一条直线,然后根据未知蛋白的迁移率,在半对数坐标上查 出 其对应的分子量。 ..不同培养条件的设定 常规培养条件?. 增菌液 培养条件的设定【伽 条件一不同温度 ?时间培养基同常规培养条件 . . . 温度时间培养基同常规培养条件 条件二不同 条件三不同时间 温度培养基同常规培养条件 条件四不同培养基含增菌液不含 温度时间同常规培养条件 ..考马斯亮蓝法测外膜蛋白的含量【删 蛋白试剂的配制称取考马斯亮蓝溶于%乙醇,加入 。 %磷酸/,将溶液用水稀释到 标准蛋白溶液 用牛血清白蛋白配成./的溶液,用系列稀 释为./,./,./,./,./,./,以此个 浓度的光吸收值做标准曲线。 取待测蛋白溶液.血于小试管中,加入蛋白试剂,充分振荡混合, 后和标准蛋白溶液一起于测定光吸收值。 以.皿双蒸水及蛋白试剂作为空白对照。 以每次标准蛋白溶液的光吸收值为标准曲线,算出待测蛋白溶液的蛋白含 量。 结果与分析 .常规培养下主要蛋白条带 在常规培养:?. 增菌液,通过,的大致分子量是 图;图 的.图谱? .不同温度和不同对的影响 在不同温度?、、?,主要蛋白条带数目无差 异.均出现了条带,而以培养时表达的以为晟多:不同 .、.、.条什下要蛋白条带数目亦无明显差异,亦出现了条带,而 以口 .培养时,以为最少。 .培莽时.以为最少. 其他条带没有明显差异图:图 在不同培养时间、不同培养基的.图谱 ‘ ‘ :】;;;增茁液;: 墨 讨论 是革兰氏阴性菌外膜的重要结构,本实验研究结果表明其在不同的 培养条件温度时间培养基下,表达有所不同。培养时表达的 .培养时,以为最少, .培养时, 以为最多; 以为最少;而在不同培养时间,主要蛋白无明显差异;铁对细菌 生长繁殖至关重要,革兰氏阴性菌存在铁调节蛋白,培养基条件下低分子 区域出现了微量条带。 的外膜蛋白作, 孙建和等【提取嗜水气单胞菌.、、 发现其电泳图谱均含有、、、、等条主要带, 温度影响的表达,培养时表达的以为最多,而?培养是 表达最多的是的条带。 黄新新掣翻认为迟钝爱德华菌在不同培养温度、值和不同培养条件下, 主要蛋白无明显差异。其在、、、麦康凯琼脂及高铁培养基上生长后, 主要基本一致,均有和条带,并且指出主要在细菌功能 上有重要作用,其基因相对保守,而高分子区域微量蛋白稍有区别外,可能与摄 取营养有关。 刘霜【】研究表明在缺铁的培养基中,高温?诱导下鳗弧菌和 表达的最主要外膜蛋白分子量为左右;而仅在缺铁时哈维氏弧 菌.在?、?、?三个温度下的主要外膜蛋白各不相同。 本实验发现在培养基条件下低分子区域出现了微量条带,推测 可能与营养摄取有关。 不同培养条件对细菌的影响不同,如何选择最优条件提取目的 是亟待解决的问题。第四章对西施舌非特异性免疫的初步研究 当病原体侵入宿主时,病原体和宿主之间会发生各种反应。一方面,病原体 试图在宿主体内存活,另一方面,宿主试图清除或隔离病原体。现在,许多学者 用病原微生物来胁迫贝类,并在几天后收集其血淋巴,从血浆中鉴定与细胞毒作 用和其他抗菌活性有关的体液因子,分析血细胞的吞噬能力和免疫杀伤过程【蚓。 用免疫西施舌后攻毒,测其免疫保护力及各项免疫指标,如抗菌活力, 溶茵活力和吞噬能力的变化,确定.对西施舌的非特异性免疫效果。 方法和材料 .实验材料 西施舌购自福州南台农贸市场,用玻璃缸饲养,采用温度?,盐度 %.左右的自然海水,按正常饲喂、正常通气并换水 菌株副溶血弧菌 .主要仪器和试剂 超净工作台、生化培养箱、冰箱、电子天平、干燥箱、超纯水仪、 低速离心机、高速冷冻离心机、超声波清洗仪、立式压力蒸汽锅、倒置显微 镜、 紫外分光光度计、本实验室自制、氯化钠、瑞士染色液 .方法 ..免疫保护力的测定【’】 免疫 实验西施舌随机分为组,每组只,第一组每只斧足注射粗 ./,第二组每只斧足注射./,第三组每只斧足注射菌体灭 活疫苗./,第四组为阴性对照组每只斧足注射灭菌生理盐水.,第五组 为空白对照组不注射。 攻毒 免疫接种后,斧足注射活菌液./只,浓度为鼬,攻 毒后正常饲养、正常通气并换水,连续观察天,统计死亡率,计算免疫保护 力。 免疫保护力.免疫组西施舌死亡率/空白对照组西施舌死亡率×% ..免疫指标的测定分组及实验方法同免疫保护力测定试验,攻毒后连续观 察; 取血于攻毒后,.,,,,, 心脏取血 制备血清将收集的血液按:.加生理盐水于,离心, 收集上清液即为西施舌血清,?保存 抗菌活力 按照王雷等】的方法测定 按照王雷等【】的方法测定 溶菌活力 / 血液中吞噬细胞吞噬能力的测定【明将培养小时后,用灭菌生理盐 水配成 /浓度的菌悬液。每.血细胞悬液加入混匀,?水 浴冰浴中止反应,血涂片染色观察,检测,计算吞噬百分率和吞噬 指数 % 个细胞中吞噬有细菌的细胞数/ 个细胞内吞噬细菌的总数/ 结果与分析 .免疫保护力结果 攻毒后实验组和对照组西施舌的死亡情况表.,注射外膜蛋白 ./ ./以及全菌灭活苗实验组的免疫保率分别为%、% 和%。 表 对西施舌的免疫保护作用 .抗菌活力测定结果 图 幽抗茁活力测定站果 拦?西施舌血清的抗菌活力在注射和全菌灭活苗后显著上升,注射 副在达到最高,随后逐渐下降:注射仉/在出现一个 小的峰值,之后在达到最高峰值,随后逐渐下降. 实验组和全菌 灭活苗组差异不显著., 实验组的两施舌血靖的抗苗于舌 力显著高于全菌灭活苗组 ,对照组均维持在较低水平.实验组均 显著高于对照组 。 .溶苗活力测定结果图幽溶苗活力测定结果 州 ?懈 西施舌血清溶苗活力在注射和全苗灭活苗后显著上升,在达到毋 高.随后连渐下降;注射 /实验组的西施舌血清的抗苗活力显著高 于 /实验组.:阴性对照组和空白对照组的均维持在较低水 平,实验组均显著高于对照组 。 .吞噬能力的测定结果 .吞噬百分率 图. 髑吞噬百分率测定结果实验组西施舌血清吞噬百分率先上升后下降,在达到 最高,、 和实验纽基本无变化:?实验组的血清抗茁活力均显著商于对照组 。 . 吞噬指数 图倒吞啦指数测定结果” 全苗灭活茴先上升后下降,达到最高,变化不显著;实 验组先上升后下降, ./实验组在达到最高, ., 在达到晟高: 实验组吞噬指数均显著高于对照组 , 实验组存噬指数均显著高于全菌灭活茁组 。 讨论 西施舌等无脊椎动物不能产牛免疫球蛋白,缺乏抗体介导的特异性免疫反 应.它们只能通过血细胞的各噬作用、血清的凝集作片以及血清中各种非特 异性 免菠因子的抑茁与杀菌作等非特异性免疫反应来抵御各种外来病原的侵害 。已有的研究表明【.,合适的免疫刺激荆可以增加牛物机体非特异性免疫能 力.提高其整体抗病机能。 本实验结果表明剐溶血弧菌对西施舌有。定的免疫保护作用, 实验组免疫保护力高于全菌灭活苗实验组,且高浓度的免疫保护力高于低 浓度的免疫保护力。抗莳力是贝类重要的免疫学指标,当外来物质微牛 物或者免疫试剂进入机体以后,西施舌对外来物质的刺激丰要表现为吞噍反 应 和产生一系列的抗菌物质.如抗菌肽等.从而产牛抗苗力,达到抗菌作用奉实 验结 果表明.外膜蛋白可以提高西施舌血淋巴的的抗菌力。 溶菌酶足吞噬细胞杀菌的物质基础,体内有许多组织和体液巾都含有溶苗 酶。其能破坏和于肖除侵体内的异物.从咖担负起机体防御的功能‘删。串 实验结果表明,.能提高西施舌血淋巴的溶菌力。 副溶血性弧菌诱导西施舌血淋巴对细菌的吞噬能力和吞噬指数均有不 同程度的提高。 合适的免疫增强剂来提高机体的非特异性免疫能力已成为当前重要的发展 方向。第五章对副溶血弧菌等种细菌的药物敏感实验 细菌耐药性是细菌产生对抗生素不敏感的现象,产生原因是 细菌在自身生存过程中的一种特殊表现形式。天然抗生素是细菌产生的次级代谢 产物,用于抵御其他微生物,保护自身安全的化学物质。人类将细菌产生的这种 物质制成抗菌药物用于杀灭感染的微生物,微生物接触到抗菌药,也会通过改变 代谢途径或制造出相应的灭活物质抵抗抗菌药物。 耐药性可分为固有耐药 和获得性耐药 。固有耐药性又称天然耐药性,是由细菌染色体基因决定、代代相传, 不会改变的,如链球菌对氨基糖苷类抗生素天然耐药;肠道.杆菌对青霉素天 然耐药;铜绿假单胞菌对多数抗生素均不敏感。获得性耐药性是由于细菌与抗生 素接触后,由质粒介导,通过改变自身的代谢途径,使其不被抗生素杀灭。如金 黄色葡萄球菌产生肛内酰胺酶类抗生素耐药。细菌的获得性耐药可因不再接 触抗 生素而消失,也可由质粒将耐药基因转移到染色体而代代相传,成为固有耐药。 对细菌耐药性的监测和耐药机制的研究已成为当今十分活跃的世界性热门课题 【刀 。 副溶血弧菌,溶藻弧菌,拟态弧菌,鳗弧菌,大肠杆菌,金黄色葡萄球菌, 嗜水气单胞菌是危害严重的几种细菌,本章研究种抗生素类药物对其体外抑 菌的作用。通过在琼脂平皿上贴药敏片,测量抑菌圈的直径来确定药物的抑菌作 用,为耐药性的监控和多种细菌病的防治提供科学依据。 材料和方法 .实验材料 ..抗生素种: 奥复星 麦迪霉素 氟哌酸 多粘菌素 丙氟哌酸 万古霉素 复方新诺明 氟霉素 痢特 氯洁霉素 红霉素.美满霉素强 力霉素 四环素 新霉素卡 庆大霉素丁胺卡那霉素 那霉素 先锋必素 毒霉素 菌必治 复达欣 苯唑青霉 氨苄青霉素 先锋霉素 羧苄青霉素氧哌嗪青霉素 先锋霉素头孢呋肟先锋霉素 ..菌株 副溶血弧菌 溶藻弧菌 拟态弧菌福建省出入境检疫局提供 鳗弧菌大肠杆菌 金黄色葡萄球菌嗜水气单胞菌本实验室 .主要仪器和试剂 仪器:超净工作台、生化培养箱、冰箱、电子天平、干燥箱、三角爬、 低速离心机、立式压力蒸汽锅、超纯水仪、移液管、药敏纸片 杭州微生物试剂有限公司 试剂:蛋白胨、酵母浸膏、结晶紫、氯化钠、氢氧化钠、营养琼脂 .方法 收集菌体将细菌接种于副溶血弧菌增菌液,培养,低速离心 收集菌体,弃上清,灭菌生理盐水重悬,重复离心次,弃上清,重悬。 倒平板将.营养琼脂加入蒸馏水中,高压灭菌, 冷却至?左右,采用无菌操作技术倒入培养皿中,倒培养基时右手拿 盛有培养基的三角瓶底部,左手持培养皿,在火焰旁拔下棉塞,瓶口通过火 焰, 此时稍打开皿盖以容纳瓶口为限,将瓶口放入皿内稍冷却后,将营养琼脂倒 入,盖好皿盖,水平静置待凝。 待培养基凝固后,用无菌移液管将稍稀释后的菌悬液加入./,用无菌三 角爬均匀涂布。 贴药敏纸片 无菌操作置入药敏纸片,?恒温培养观察抑茵圈的有无 及测量其直径。 药敏实验结果判定标准直径咖 “.一表示抑菌圈直径? ,判定为耐药; “一表示抑菌圈直径在衄,判定为低敏; “一表示抑菌圈直径在衄,判定为中敏; “一表示抑菌圈直径 ,判定为高敏。结果与分析 利用药敏纸片法测定了副溶血弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、鳗弧菌、大肠 杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌对种抗生素的敏感性,表.,表., 图.,图,图.。 表. 种细菌对种抗生素药物敏感程度的数目种副溶血弧菌溶藻弧菌拟态弧 菌鳗弧菌 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌嗜水气 单胞菌 种细菌的药敏试验结果 表 早肥困 弧茵 弧菌 耄【::?藿溪?慕喜五?嚣鳗弧菌耄盏蓍奔誓言蓄器 弧菌 /片 们圃了帅 卅卅 . 卅 哪咖 . ‘卅 卅 ? 一.卅 . 卅 研血 什 ’ 十 一 ‘瑚 . 。 卅 卅 卅 咖蛐 . 哈 . 十十 卅 卅. . 抖 抖卅 卅 . 什卅 . ? 抖 . 什 抖 . 什 一 , 卅什卅 柑 . 卅 . 卅 ? 卅卅 什 卅 . 卅 什卅 . . 卅 嘶 抖州抖 . 卅 什卅 。瑚啪如?如如加 圈耐药瓣 罔 罔高敏感