柠檬酸发酵

柠檬酸发酵 【实验目的】 1. 了解柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸液体发酵及中间方法。 2. 了解并记录黑曲霉培养过程中培养基中基质的变化与产物的形成情况； 【实验原理】  黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过酵解途径（EMP）和 HMP 途径转变为丙酮酸；丙酮酸由丙酮酸氧化生成乙酸和二氧化碳， 继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶 A，然后在柠檬合成酶的作用下生成柠檬酸。黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA 循环中的酮戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA 循环变成“马蹄形”，代谢流汇集于柠檬处，使柠檬酸大量积累并排出菌体外。 【实验用品】 1. 实验主要仪器 摇床；离心机；超净工作台；恒温培养箱；灭菌锅；分析天平；蒸发器；分光光度计；容量瓶；滤布；布氏漏斗；滴定管；水浴锅；试管、烧杯、500ml 三角瓶等若干0.1429mol/LNaOH，1%酚酞试剂，pH 计，3,5 二硝基水杨酸试剂， 0.1429mol/LNaOH，1%酚酞试剂，pH 计，3,5 二硝基水杨酸试剂，葡液(A 液：1％结晶紫 95％酒精溶液：B 液：1％草酸铵溶液。取 A液 20mL，B 液 80mL混合，静置 48 小时后使用 2. 材料 菌种 黑曲霉 【方法步骤】1.柠檬酸发酵菌种培养基1升（蔗糖合成培养基：蔗糖140g， NH4NO3 2g， KH2PO4 2g， MgO4.7H2O 0.25g， FeCl3.6H2O 0.02g， MnSO4.4H2O 0.02g， 麦芽汁20ml， 用水定溶至1000ml）分装、灭菌。 1.4 接种  活化的黑曲霉孢子（约0.5%）接种入培养基中，在33-36℃，200-300r/min的摇床中20h左右，培养后菌体浓度应达60万～150万/ml，菌丝球为致密形的，菌球直径不应超过0.1mm，菌丝短，且粗壮，分支少，瘤状，部分膨胀为优。注：进行下一步操作前应用显微镜检测菌球的生长状况，若菌丝细长则说明黑曲霉已经提前进入柠檬酸发酵时期，会导致后期的柠檬酸产量降低。 发酵过程检测 2.4.1 还原糖、柠檬酸的检测 发酵 0、24、48、72h分别各取下两瓶检测还原糖（残糖）、柠檬酸含量，以观察发酵过程中黑曲霉的耗糖与柠檬酸的生成速率； 2.4.2 pH 值的检测 每隔 12 小时检查 pH 值。  2.4.3 黑曲霉菌丝形态的观察 每隔 12 小时镜检黑曲霉菌丝的形态变化。 【检测方法】1、黑曲霉镜检  直接取一滴发酵液于载玻片上，用盖玻片密封后镜检。 2、pH 的跟踪测定：pH 试纸。  3、还原糖（残糖）的测定 糖度计。 4、柠檬酸的测定：钙盐法、碱滴定法 1. 实验主要仪器设备  恒温水浴，离心机；分析天平；蒸发器；分光光度计；pH 计；滤布；布氏漏斗；滴定管；水浴锅；试管、烧杯、500ml 三角瓶等 2、实验药品 0.1429mol/LNaOH，1%酚酞试剂，碳酸钙，95%乙醇，浓硫酸  【方法步骤】  1. 发酵液过滤  各组将发酵液合并量取发酵液总体积，离心或过滤除去菌体及残渣，准确计量取滤液（取5ml滤液，测定柠檬酸含量）。  2. 碳酸钙中和沉淀  柠檬酸与碳酸钙发生中和反应，形成难溶的柠檬酸钙沉淀，碳酸钙的添加量根据滤液中柠檬酸的重量添加，比例约为柠檬酸：碳酸钙=2.1：1。 边搅拌边缓慢加入碳酸钙，以防止产生大量气泡。碳酸钙加完后放置85℃恒温水浴中加热，保温搅拌30分钟，趁热过滤，并用沸水洗涤柠檬酸钙沉淀。  3.  酸解将柠檬酸钙沉淀物取出，称量，加入2倍量的水，调匀。然后加热至85℃，加入硫酸，硫酸的添加量根据碳酸钙的量计算，碳酸钙与硫酸的摩尔比为1：2。加完硫酸后，继续保温，搅拌30分钟，趁热过滤，得清亮的棕黄色液体，取样测定柠檬酸的含量，并准确计量柠檬酸液体积。  4. 离子交换法进一步去除杂质（见专业实验课本，本实验不做这步）  5. 结晶  注：本实验用下面的检测方法测定柠檬酸的含量。 【检测方法】  柠檬酸的测定：一般检测发酵过程中的总酸，精确吸取 1ml 的发酵液过滤液于100ml锥形瓶中，加入少量的去离子水，加 2-3 滴0.1%酚酞指示剂，用 0.1429mol/L NaOH 溶液滴定，滴定微红色计算用去的 NaOH 毫升数，计为柠檬酸的百分含量（每消耗 1mlNaOH 1% 的酸度）