他克莫司固体脂质纳米粒制备及理化性质研究

他克莫司固体脂质纳米粒制备及理化性质研究 南方医科大学级硕士学位论文 他克莫司固体脂质纳米粒制备及理化性质研究‘‘’ 课题来源:广东省自然科学基金 业 专 名 称 皮肤病与性病学 学位申请人 王瑞华 指 导 教 师 张堂德教授 孙乐栋教授 答辩委员会主席 李其林教授 答辩委员会成员 杨慧兰教授 杨 斌教授 邓列华教授 朱慧兰教授 论文评阅人 邱贤文 教授 杨文林教授 年月日广州硕士学位论文 他克莫司固体脂质纳米粒制备及理化性质 研究 硕士研究生:王瑞华 指导教师:张堂德教授;孙乐栋教授 摘 要 研究背景 他克莫司,,,商品名普乐可复是疏水性、中 性大环内酯类新型免疫抑制剂,由日本藤泽药公司于年首次从 链霉菌肉汤培养基中分离得到,目前已能全合成。它的作用机制和环孢素相 似, 都是通过阻断细胞受体介导的信号传导途径发挥作用,但免疫抑制方面是环 孢 素的.倍。由于它的分子量相对较小,可以穿透表皮屏障,为避免全身不 良反应的发生,已制成外用制剂治疗各种免疫性和炎性皮肤病。在日本, 年.%他克莫司软膏就被批准使用。在年月,在加拿大公司进行 了期临床试验。美国在年月首次通过局部外用.%他克莫司 软膏治疗成年人中重度特应性皮炎,使用.%他克莫司治疗大于岁 的儿童和需要长时间间歇治疗的患者。年月他克莫司软膏在中国上市, 用于治疗多种皮肤疾病。外用他克莫司治疗特应性皮炎和其他细胞介导的皮 肤病具有良好的效果,并且没有外用糖皮质激素样的不良反应,深受皮肤科 医 师信赖。 外用他克莫司常见的局部不良反应:烧灼感是最常见的不良反应,.%的他 克莫司软膏发生率为%一%;.%浓度的他克莫司软膏约为%.%,个 别患者用药后可以引起过敏性接触性皮炎、酒渣鼻样肉芽肿性发疹、水 痘样疹、病毒性疣等。口服他克莫司是肝、肾移植的一线药物,常见的不良反摘要 应有肾毒性和神经毒性,此外还有高血压、糖尿病、肥厚性心肌病、急性造血 功能停滞、免疫过度抑制、颅内感染,以及恶心、呕吐、低磷血症、多尿症、 高脂血症、感觉异常、视力障碍、皮肤异常等症状。但绝大多数外用他克莫司 的病人不太可能出现像移植病人那样的高水平的系统暴露,仅有少数病人可能 会出现低水平的系统暴露,是安全性研究最多的疾病,虽然随着治疗受累 面积的增大,系统吸收也会增加,但是随着皮肤炎症和屏障功能的改善,他克 莫司的吸收量也会随之减少,这可能是外用他克莫司不易产生系统性损害的一 个原因。但基于具有较强的免疫抑制作用和潜在的系统暴露问题,长 期使用的安全性问题倍受人们关注。由于缺乏长期安全性的和存在致癌的 潜在风险,美国要求外用他克莫司在包装上加黑框警告,这是关于 药物副作用最严厉的警告。根据等病例和文献复习,在外用他克莫司 使用者中,有例出现癌症,包括例成年和例儿童小于岁。肿瘤 出现的时间在外用他克莫司治疗后的.天。肿瘤的类型例为淋巴瘤, 例为皮肤肿瘤,包括鳞状细胞癌、皮肤肉瘤和恶性黑色素瘤,大多数皮肤肿瘤 发生在使用药物的区域,肿瘤的发生和局部使用此药的持续时间和剂量有 关。 理论上,使用此药的时间越长,系统暴露血药浓度累积水平越高,肿瘤发 生的机会就越大。 固体脂质纳米粒 ,是世纪年代初发展起 来的新一代亚微粒给药系统,它是以固态的天然或合成的类脂如三酰甘油、卵 磷脂等为载体,将药物包裹在类脂核中经不同方法制成的粒径在之 间的固态胶粒给药体系。药物由于被包封于的生理相容耐受性好的固体脂 质骨架中,从而实现了更好的控释和缓释效果。制备纳米粒的材料较多,大致可 分为聚合物和脂质材料,前者制成的纳米粒称为聚合物纳米粒 ,后者称为固体脂质纳米粒 ,。固体脂 质纳米粒的优点有:降低副作用,减少对局部应用的刺激性;可同时增溶 不同脂溶性的药物;降低毒性和溶血作用;药物分散性好,有利于吸收,提 硕士学位论文 高生物利用度等优点。目前常用的固体脂质纳米粒制备方法有高压均质法、超 声分散法、微乳法和溶剂挥发法等。而与这些方法相比,乳化蒸发法制备固体脂 质纳米粒具有所用设备简单、操作简便、适合工业化生产、制得的固体脂质纳 米粒粒径大小均匀和有较高的可重复性等优点,且无需均乳或超声等高能乳化 』 过程,即实现了低能乳化,因此是一种值得推广应用的制各方法。 作为局部给药的主要优点是:避免化学不稳定药物的降解和调节药物 的释放曲线,与口服给药相比,局部给药,可减轻系统的毒副作用。同时,由 于脂质生理相容性好,对皮肤无刺激;纳米粒微小颗粒使其紧密的接触角 质层,使具有良好的黏附性,可在皮肤表面形成连贯的具有闭塞效应的膜, 闭塞效应还可增加皮肤的水合作用从而减少水分的散失,随着纳米粒粒径的变 小或局部浓度的升高黏附性增强,从而进一步增进皮肤的水合作用,提高 药物对皮肤的渗透率。同时,具有缓控释作用,在表皮、真皮形成药物储 库,增加药物在皮肤组织中的滞留量,直接持久地对病变细胞起作用,降低药 物的全身性吸收。国外研究者对固体脂质纳米粒在经皮给药系统中的应用进行 了深入研究,克霉唑、维生素棕榈酸脂、酮康唑、遮光剂、抗紫外线剂、咪 唑类抗真菌药物、辅酶以及抗关节炎药伐地考昔和塞来考昔已被成功制成 局部用经皮给药系统,并取得了理想的药物释放效果和皮肤靶向作用。 研究目的 以硬脂酸作为他克莫司经皮给药载体,对其处方组成、制备工艺、形态、 粒径、包封率、差示扫描量热、稳定性、体外释放进行研究。期望通过这种新 型微粒给药系统用于皮肤局部给药,减少他克莫司经皮使用的副作用,同时使 更多的药物贮留在皮肤内,以增加局部药物浓度减少系统吸收。 研究方法 .处方前工作:本章确立了他克莫司的体外方法。经紫外扫描确定了 药物的最大吸收波长为,采用高效液相色谱法法测定固体脂 质纳米粒中他克莫司的含量,最终确定检测条件:色谱柱:,流动相:乙腈. 摘要 水.磷酸::,柱温:,检测波长:,进样量:山。在此条 件下进行一系列的曲线制备、精密度、回收率、重现性等试验验证 方法适合他克莫司含量的测定。此外进行测定了他克莫司在不同介质中的溶解 度及他克莫司的油/水分配系数,为后续制备工艺的选择提供参考: .固体脂质纳米粒制备工艺的选择:固体脂质纳米粒常用的制备方法有微 乳法、薄膜.超声分散法、乳化蒸发.低温固化法等。三种方法各有优缺点,通 过制备方法的比较发现,乳化蒸发.低温固化法适合他克莫司制备;通过 考察不同的脂质载体、表面活性剂、有机溶剂的选择并进行正交设计实验筛选 最优处方。 .他可莫司固体脂质纳米粒包封率测定的研究。分别采用鱼精蛋白法,低 温高速分离、葡聚糖微柱凝胶法测包封率,最终确定适合本实验的方法为微 柱 离心法;并对微柱离心法进行一系列的验证:葡聚糖凝胶.对游离他克莫司 的吸附、对空白脂质体的吸附及对固体脂质纳米粒样品中他克莫司的吸附。 该 方法准确可靠、快速简单、专属性好,适用于他克莫司包封率的测定。 .对他克莫司形态、粒径的观察及差示扫描量热法、一衍射确定最后 处方后药物在脂质体中的形态。 .他克莫司稳定性研究:分别取批制备好的他克莫司样品,放 置于室温和?冰箱,、、天观察样品的外观及粒径的测量;将. 混悬液于离心分钟,观察有无药物结晶或脂质沉淀析出。 .取.混悬液及相同浓度的原料药,置于透析袋中 截留分子量.,两端夹紧后置带塞锥形瓶中,加入释放 介质.,将锥形瓶避光放入?恒温摇床中,每分钟 振荡次,于.、、、、、、、、、、、和时取样 ,然后补加相同体积的。将样液经.滤膜过滤,经测药物 峰面积,并计算其浓度。按照公式??.?计算 累积扩散释药量,并计算累积释药百分率,绘制体外释放曲线。 硕士学位论文 .统计学处理 采用.软件和进行数据统计,数据以士表示,计算 值,采用】正交设计进行方差分析,当?.时,差异显著,有统计学 意义。 结果 .确立了他克莫司的体外分析方法。经紫外扫描确定了药物的最大吸收波 长为,采用法测定固体脂质纳米粒中他克莫司的含量,药物在 .上/范围内线性关系良好,得线性方程:.一.., 最低检出限为:./,日内、日间精密度均小于%,平均回收率为 ~.%之间,方法简便、可行。 .测定了他克莫司在不通介质中的溶解度,为后续制备工艺的选择提供参 考。他克莫司在生理盐水、. 、和油酸中的溶解度分别为 ./、./、./和./。结果表明他克莫司在油中不溶, 在生理盐水和表面活性剂溶液中微溶,在. 中略溶。 颓定了他克莫司的油/水分配系数,其在为.的中油/水分配系 数为.,亲脂性较差,不易透过脂质屏障,因此药物本身透皮渗透较差。 .确定他克莫司的制备方法:乳化蒸发.低温固化法,通过对单因素及 正交设计的考察,最终制得稳定的他克莫司乳液,测得粒径衄, 分散指数.,粒度分布窄;其表面带负电,电位为..士., 包封率为.%,投射电镜粒子成圆形或椭圆形,大小较均匀,无团聚现象, 由和.衍射得出他克莫司以无定形的形态而非结晶状态包封于纳米粒中, 在存放天的纳米粒粒径及包封率无明显变化变化,.混悬液 于离心分钟,离心后无分层,无药物结晶及脂质析出现象 .确定使用葡聚糖.微柱离心法分离未包括的药物测包封率。葡聚糖凝 胶.对游离他克莫司的吸附游离药物吸附率为.%.%。微柱对空白 脂质体的回收率桂后/牲.计算得回收率分别为.%、.%、.%和 摘要 .%,分别为.%、.%、.%和.%;微柱对固体脂质纳米粒样 品中他克莫司的吸附率...%,值...%。方法准确可靠,快 速简单,测定固体脂质纳米粒包封率所需时间短,专属性好,样品用量少且稀 释倍数小,适用用他克莫司包封率的测定。 .他克莫司体外释放实验:在前他克莫司原料药约%药物释放出 来,而他克莫司中的他克莫司仅有%释放出来,随后.表现为 持续缓慢释放,在累计释放量约为%。 结论 .他克莫司体外分析方法方法简便、准确可行;他克莫司在水中的溶解度 很低,要经皮给药,必须通过一定的方法增大他克莫司的溶解度,才能实现较 好的透皮性能:他克莫司的油/水分配系数:其在为.的中油/水分配 系数为.,亲脂性较差,不易透过脂质屏障,因此药物本身透皮渗透较差。 .通过对多种包封率测量方法的比较,最后选择葡聚糖.微柱离心法分 离未被包括的游离药物进一步测定包封率,方法准确可靠,快速简单,测定固 体脂质纳米粒包封率所需时间短,专属性好,样品用量少且稀释倍数小,适用 用他克莫司包封率的测定。 .通过采用乳化蒸发.低温固化法制备他克莫司,在单因素考察的基础 上,采用正交设计优化、筛选最佳处方,并对优化条件下制备的他克莫司 进行了质量评价、研究、体外释放和稳定性考察。结果表明,他克莫司适 合以乳化蒸发.低温固化法进行包裹,优化制备的他克莫司混悬液的 粒径、?电位及包封率均较为理想,并且在冷藏条件下天内理化性质 基本稳定。 关键词:他克莫司 固体脂质纳米粒包封率稳定性 硕士学位论文 : :., , . . , 嬲 ? ., . . .% . 。.% ..? % ; , . 嬲 . , . / .% ;%~%,.% %~%, 、俄、 、 .、【 , . , 、 、 、 , ,,.. ,、析, . , ,.% . , ’ . . , ,, .眦 硕士学位论文 , , .,,. . : ; ? ; ;、 .曲 , ,. , : ;;、 曲., , . : ; ; .,, . , . ,, ‘‘ ’ . 了. ,. : ,, ,,? . , ,, ,,, 、 . 、 ,. .: . ; . :: ;? ,; ::.; :, :,; :山.,,,. , 衔/ . : : . 硕士学位论文 ,? , ? ., , ? 、 . . 、 . 一 : 、 ?? . :、. ,?. , .’ 、 、 . ? .一 ,、、. , . ? ., .. /。.,,,,,, , , ,,, .. . . 一 嬲:宰?一一 ; ; ;. ... 士. ,.. . . . , :... :. .?/ ; /; %;. .%, . .,. , ,, ./:,./、./ ./ . 、硕士学位论文 . . .艏 /, . ., . . . : 一 ,、 ., ;, . .%. ., . ,. . , . . ., ,...,.%~.% .%、.%、.%、.%, .%,.%, .? .%,.%; . .%. .%, ,, , . , . .: %. % . , 媳 廿弱 . ; %. .; 、 , . . /, .,... :. ,,, . . . ?硕士学位论文, . 一 、、 . . 、, , :; ; ; 硕士学位论文 目 录 摘 要??..甜?.. 第一章 前言 他克莫司的研究进展? 固体脂质纳米粒的研究进展?。 第二章处方前工作?. 材料与仪器?. 方法与结果?讨论?。 ?本章小结??. 第三章 他克莫司固体脂质纳米粒制备工艺及理化性质的研究?. 材料和仪器?.. 方法与结果?. 讨论?. ?本章小结??一 全文总结. 参考文献缩略语词汇表?. 成 果 致 谢? 南方医科大学学位论文原创性声明?. 统计学审稿证明??硕士学位论文 第一章前言 他克莫司,,,商品名普乐可复是疏水性、中 性大环内酯类新型免疫抑制剂,由日本藤泽药公司于年首次从 ; 链霉菌肉汤培养基中分离得到,目前已能全合成】。它的作用机制和环孢素相 似,都是通过阻断细胞受体介导的信号传导途径发挥作用。但免疫抑制方面是 ? 环孢素的倍。由于它的分子量相对较小,可以穿透表皮屏障,为避免全身 不良反应的发生,已制成外用制剂治疗各种免疫性和炎性皮肤病。外用他克莫司 常见的局部不良反应【】:烧灼感是最常见的不良反应,.%浓度的他克莫司软 膏发生率为%一%;.%的他克莫司软膏约%一%,个别患者用药后可 以引起过敏性接触性皮炎、酒渣鼻样肉芽肿性发疹、水痘样疹、病毒性疣 等。但基于具有较强的免疫抑制作用和潜在的系统暴露问题,长期使用的 安全性问题倍受人们关注。由于缺乏长期安全性的资料和存在致癌的潜在风险, 美国要求外用他克莫司在包装上加黑框警告,这是关于药物副作用最 严厉的警告【】。 固体脂质纳米粒 ,是世纪年代初发展起来 的新一代亚微粒给药系统, 它是以固态的天然或合成的类脂如三酰甘油、卵磷 脂等为载体,将药物包裹在类脂核中经不同方法制成的粒径在之间 的固态胶粒给药体系。药物由于被包封于的生理相容耐受性好的固体脂质骨 架中,从而实现了更好的控释和缓释效果。作为局部给药的主要优点是:避 免化学不稳定药物的降解和调节药物的释放曲线,与口服给药相比,局部给药, 可减轻系统的毒副作用。同时,由于脂质生理相容性好,对皮肤无刺激;纳 米粒微小颗粒使其紧密的接触角质层,使具有良好的黏附性,可在皮肤表面 形成连贯的具有闭塞效应的膜】,闭塞效应还可增加皮肤的水合作用从而减少 水分的散失,随着纳米粒粒径的变小或局部浓度的升高黏附性增强,从而进 一步增进皮肤的水合作用,提高药物对皮肤的渗透率。同时,具有缓控释作第一章前言 用,在表皮、真皮形成药物储库,增加药物在皮肤组织中的滞留量,直接持久 地对病变细胞起作用,降低药物的全身性吸收】。国外研究者对固体脂质纳米 粒在经皮给药系统中的应用进行了深入研究,克霉唑、维生素棕榈酸脂、酮康 唑、遮光剂、抗紫外线剂、咪唑类抗真菌药物、辅酶以及抗关节炎药伐地 考昔和塞来考昔已被成功制成局部用经皮给药系统,并取得了理想的药物释放效 果和皮肤靶向作用。 他克莫司的研究进展 他克莫司原名,是年由日本滕泽制药公司从土 壤真菌链霉菌 中所提取到的一种大环内酯类免疫 抑制剂,当时实验命名后正式命名为他克莫司,商品名为普乐可复 ,年等首次用于肝移植,取得良好效果。和环孢素 免疫抑制作用十分相似【】,但的作用约是的 倍。的结构属于元大环内酯类抗生素见图,由亲免疫性蛋 白的结合区段与结合后发挥免疫抑制效应的效应区段两部分组成,具有高度脂溶 性,分子量为.,广泛分布于各组织中,具有强大的免疫抑制作用。其作用机 理主要是抑制细胞活化过程中.、、、吖等基因的转录,降低 .和转铁蛋白的表达,抑制细胞因子合成,抑制细胞针对胸腺依赖抗原的 抗体形成。和分别与作用靶细胞内环亲和素和结合蛋刍 ,结合形成复合体,这类复合体的靶分子为一种称之为 /钙调蛋白依赖性的/磷酯酶,使磷酯酶活性受 到抑制,并且阻止活化细胞核子 ,的去 磷酸化,进而阻止了向细胞核内转移,影响.等基因的转录【】。最早 口服和静脉滴注用于骨髓移植和肝肾移植后预防排斥反应,在器官移 植中的应用非常广,临床主要用于各种急性排斥反应【】。但该药的有效血药浓度 范围较窄。国外推荐的治疗窗浓度并不适合我国肾移植接受者。血药浓度稍高, 硕士学位论文 即可出现毒副作用,如:轻微的肾毒性、神经毒性及高血压、失眠、恶心等;稍低则 出现排斥反应。由于他克莫司的系统治疗具有一定毒副作用,目前对于外用制剂 的应用推广正成为一个新的热点。在日本,年.%他克莫司软膏就被批准 使用。在年月,在加拿大公司进行了期临床试验。美国在 年月首次通过局部外用.%他克莫司软膏治疗成年人中度到重度特应性皮 炎,使用.%他克莫司治疗大于岁的儿童和需要长期间歇治疗的成人患者。 年月他克莫司软膏在中国上市,用于治疗多种皮肤疾病。外用他克莫司治 疗特应性皮炎和其他细胞介导的皮肤病具有良好的效果,并且没有外用糖皮质 激素样的不良反应,深受皮肤科医师信赖。 图他克莫司的化学结构式 ..他克莫司在皮肤科中的应用 他克莫司的作用机该药可穿透细胞膜与胞内特异性受体结合, 选择性作用于钙离子依赖的信号传导途径,使钙调磷酸酶失活,抑制依赖活化 细胞核因子基因的转录,包括一些早期细胞激活所需的细胞因子如粒细胞.巨 噬细胞集落刺激因子.及.、.、.等。体外实验证实了外用 他克莫司对肥大细胞脱颗粒有抑制作用,这一作用抑制了炎症介质.和.受 体的产生。此外,它还减少角质形成细胞中.和其受体的结合。环孢素由于分第一章前言 子量过大不能穿透皮肤,而他克莫司直接作用于表皮抗原递呈树突状细胞和白 细胞。此外,局部外用他克莫司具有刺激表皮树突状细胞产生和下调免疫 球蛋白亲和力,还可能干扰表皮细胞因子网络和/淋巴细胞的平衡,这些都 可能是他克莫司在皮肤科外用有效的机。 目前美国食品与药品管理局已批 特应性皮炎 准他克莫司软膏作为二线药物用于治疗本病,并得到了广泛地应用。 等【】对例轻中度儿童患者进行了多中心双盲实验,分别外用赋形剂、. %的他克莫司软膏,每日次,治疗周后,有效率分别是.%、.%;另外 等对例成人患者进行随机双盲对照试验,分别外用.%、. %的他克莫司软膏及赋形剂,每日次,治疗周后,结果三组的有效率分别为. %、.%和.%。且他克莫司软膏组在严重度指数及湿疹面积明显下降, 瘙痒症状较对照组显著改善。他克莫司软膏由于其疗效好、不良反应少、安 全 性高,已成为治疗中重度的一线药物。 银屑病:欧洲多中心银屑病研究小组采用双盲安慰剂对照实验】, 治疗例中、重度寻常型银屑病患者,口服剂量..//,治疗组明 显高于对照组,并且副作用轻微。外用他克莫司治疗银屑病的慢性斑块状皮 损无 效,因为其较难渗透入肥厚的皮损,但如在前一晚先外用%的水杨酸软膏除去 鳞屑后,再用%他克莫司软膏封包连续 ,则有效,比外用.%卡泊三醇软 膏要好。但它对于皮肤易渗透的部位,如面部皮损有效,因此处皮损较薄,易 于 渗透,并且由于它不会增加眼内压,故用于眼周是安全的【】。 白癜风:本病可能与细胞和体液免疫介导有关,而他克莫司能抑细胞的 活化,阻止前炎症性细胞因子的产生和释放。~..等【】对例白癜风患者 使甩他克莫司软膏治疗进行前瞻性研究。在个月治疗结束后例.%患 者出现色素再生。年以上的白癜风患者对他克莫司软膏反应良好。活动期白癜 风患者的色素再生优于稳定期白癜风。头颈部局限性白癜风患者%对治疗有反 应,但是局限性和寻常型白癜风没有明显的统计学意义。头颈部的平均色素再 硕士学位论文 生优于躯干和四肢部位。外用他克莫司软膏治疗白癜风特别是头颈部是有效的, 耐受性也较好。 目前已有研究报道外用他克莫司软膏治疗的皮肤病中,可能对下列疾病有 效::红斑狼疮、龟头炎、斑秃、坏疽性脓皮病、硬化性萎缩性苔藓、白色糠疹、 过敏性接触性皮炎、蕈样肉芽肿、扁平苔藓、血管炎、硬皮病、皮肌炎、毛囊 角化病、鱼鳞病、斑秃、结节病等。 他克莫司软膏的临床应用已证明‘它对免疫性和炎症性皮肤病有良好的疗 效,其疗效与中等强度的糖皮质激素相似,但局部不良反应少。并且不会出现长 期外用糖皮质激素后所致的色素改变和皮肤萎缩等不良反应,反而能逆转已引 起的皮肤萎缩,故为皮肤科临床药物治疗中的一个新选择以及糖皮质激素外用 制剂的一种良好的替代药。他克莫司也可与糖皮质激素联合外用或序贯使用:发 挥协同作用,将各自的不良反应减至最小,故应用前景广阔。但除了对特应性皮 炎外,治疗其他皮肤病的临床资料都是开放性和小规模的,有些是个例报告。故 .“ 今后对以上各种皮肤病进行多中心、随机、双盲和对照试验是必要的。。。 .外用他克莫司目前存在的问题 外用他克莫司的局部不良反应【】:外用他克莫司主要有烧灼感、红斑、’瘙 痒等局部副作用.烧灼感是最多见的不良反应,.%的他克莫司软膏发生率为 %%;.%浓度的他克莫司软膏%一%;一般随时间的推移而迅速下 降。烧灼感多为轻中度,且多为自限性,在.%他克莫司软膏中,%烧灼感持 续时间在至 之间平均 ;儿童长期用.%他克莫司软膏,每日 次,平均用 ,用药部位烧灼感.%、瘙痒.%、皮肤感染.%。等 报告的局部不良反应见表。第一章前言 表外用不同浓度他克莫司的不良反应发生率% / % 不良反应 .%他克莫司软膏.%他克莫司软膏 基质 种类 . . . 皮肤烧灼感 . . 皮肤麻刺感 . . 毛囊炎 . 从 . 皮肤感染 . . 痤疮 . . 感觉过敏 . 囊肿 . 外用他克莫司的全身不良反应:基于具有较强的免疫抑制作用和潜在的系统 暴露问题,长期使用的安全性问题倍受人们关注。由于缺乏长期安全性的资 料和存在致癌的潜在风险,美国要求外用他克莫司在包装上加黑框警告, 这是关于药物副作用最严厉的警告。尽管研究人员对的黑框警告存在 广泛争议,但外用他克莫司经皮吸收造成的系统暴露,以及长期系统暴露可 能 给人体带来的潜在危害仍然值得探索。根据等【】病例报告和文献复习, 在外用他克莫司使用者中,有例出现癌症,包括例成年和例儿童小于 岁。肿瘤出现的时间在外用他克莫司治疗后的.天。肿瘤的类型例为淋巴 瘤,例为皮肤肿瘤,包括鳞状细胞癌、皮肤肉瘤和恶性黑色素瘤,大多数皮 肤肿瘤发生在使用药物的区域,肿瘤的发生和局部使用此药的持续时间和剂 量 有关。理论上,使用此药的时间越长,系统暴露血药浓度水平越高,肿瘤 发生的机会就越大。特应性皮炎是外用他克莫司安全性研究最多的疾病, %的儿童患者和%的成人患者他克莫司血药浓度低于/,而根据普特彼 说明介绍,成人患者单次或多次应用.%他克莫司软膏后,血中他克莫司 硕士学位论文 峰浓度介于检测不出至 /之间,一项例患者的大样本调查显示,% 患者的血药浓度值低于/,这些均提示应用他克莫司后存在低水平的吸收。 药代动力学研究显示成人外用他克莫司后的系统水平,浓度.时间曲线下 的最大面积为. /。两例患外生殖器硬化性苔藓的岁女 童用.%他克莫司软膏每日次,并监测了血液他克莫司水平,其中一例的血药 浓 度为. /,而另一例未测到。在使用频率低每天次、使用面积小外阴 不到总体表面积%的情况下,他克莫司血浓度已有. /,如果使用面积 较大,血浓度可能会增加。综合征是常染色体隐性遗传性皮肤病,临 床表现为鱼鳞病样红皮病,由于本病伴有特应性体质,临床常误诊为特应性 皮 炎。有作者报告例儿童.综合征患者,用.%他克莫司处理红皮病损害, 出现明显的经皮吸收和高血药浓度现象。患者在停药后的他克莫司血药浓度 为./,另一例患者甚至在后仍有/的高浓度,这个浓度已超出他 克莫司系统性安全的范围对于器官移植病人他克莫司服药、时后的血药浓 度要求在?/,也说明他克莫司经皮吸收的能力不可忽视,但由于用药时间 短暂,未观察到副作用。研究显示他克莫司比吡美莫司具有更强的皮肤渗透 性, 这是由于他克莫司较少与皮肤蛋白结合,因此更易经皮吸收【。他克莫司经 皮吸收的生物利用度估计在.%到%之间,明显比外用糖皮质激素高小于 %,而他克莫司口服的生物利用度也仅在%左右。在某些病理条件下皮肤的 屏障功能被破坏,如严重或综合征,可能导致外用他克莫司潜在的 系统暴露增加,而且他克莫司的系统暴露水平与其皮肤应用面积成正比。令 人 关注的是血药浓度为./低水平暴露也能引起系统性副作用,如糖尿病、白 细胞下降和腹泻等。肾组织中的他克莫司浓度比外周血浓度高,因此,他克莫 司低水平暴露也能导致肾毒性。 固体脂质纳米粒的研究进展 在新药的研发过程中,越来越多的数据显示,由于药物自身理化性质的限制, 第一章前言 可能会使一些新药在单独应用时不能充分发挥作用,甚至使一些很有希望的药物 由于不符合药物动力学要求而遭到淘汰。于是,脂质体、微乳聚合物、纳米粒等 一系列药物载体被发展起来,药物载体输送系统亚微粒的研究已成为药物新剂型 研究中活跃的领域。纳米粒又称毫微粒,是一类由天然或合成的高分子材料制成 ’ 的纳米级固态胶体颗粒,粒径为~,分为纳米球和纳米囊。:药物被包埋 或溶解在纳米粒的内部,也可吸附或偶合在其表面。其既能改变药物的释放速度, 又能提高生物利用度、影响药物的体内分布,并在靶向给药和选择性吸收等方面 取得了显著的成就【】。然而,以上几种给药系统又存在某些不足之处,如一般的 脂质体具有药物易于渗漏等缺点、在体内外不稳定;聚合物纳米粒在制备过程 中可能带来有潜在毒性的物质,如残留单体、有机溶剂、聚合反应引发剂等,所用 的生物可降解性高分子材料在细胞吞噬降解后也常产生细胞毒性。因此人们 将 目光逐渐转向了由体内降解、生理相容的天然脂质材料作为载体的脂质纳米粒。 固体脂质纳米粒 ,是近年来正在发展的一种新型给 药系统。是以固态的天然或合成的类脂如三酰甘油、卵磷脂等为载体,将药 物包裹于类脂核中通过不同方法制成的粒径在~之间的固态胶粒给药 体系。与脂质体和微乳相比,药物由于被包封于的生理相容耐受性好的固体 脂质骨架中,从而实现了更好的缓释和控释效果。制备纳米粒的材料较多,大致 可分为脂质材料和聚合物,前者制成的纳米粒称为固体脂质纳米粒 。 ,,后者称为聚合物纳米粒 具有可控制药物释放、生理相容性好及良好的靶向性等优点。以前对的研究 主要集中于静脉和口服给药,近年来也开始应用于皮肤和黏膜给药系统,并呈现 出良好的发展态势。虽然 在载药量、稳定性等方面尚存在一些问题,但其 作为一种很有希望的新型载体系统,目前还处于研究阶段,其在靶向和缓控释 方面仍是非常有吸引力的,相信它的发展和完善必将会使人类传统用药发生一 场全新变革。 硕士学位论文 .固体脂质纳米粒在皮肤科应用的优势 增强药物的稳定性:对于传统的/剂型,亲脂性药物在水相和乳滴之间存 在分配过程。最初溶解在水相的药物会发生降解向乳滴中分配,而乳滴中未降解 的药物将会分配到水相。这种状况也存在于脂质体中,在磷脂双分子层中的亲脂 性药物也会在两相中进行不断的分配,这将加速药物的降解过程。与齐和脂质 体相比,固体脂质纳米粒的纳米粒子与外水相之间不存在药物分配现象,故更好 的保护药物分子,使其不发生降解,提高了稳定性。 提高包封效应及皮肤成膜性:固体脂质纳米粒具有良好的皮肤黏附性,而且 其黏附性随着其粒径减小而增加。当纳米粒子黏附于皮肤表面后,纳米粒子之间 相互堆积,故只剩非常小的小孔供皮肤表面水分蒸发。通过方程可知,小 孔表面水饱和蒸汽压显著降低,进而导致皮肤表面水分蒸发量明显减少。 和】假设纳米粒子以单分子层、六角形的形式黏附在皮肤表面,建立了 纳米粒子在皮肤表面成膜的模型,纳米粒子在毛细管力作用下相互融合、变形,在 二 皮肤表面形成一层膜,因此产生“包封效应” 。建立了 在体外将滤纸封于烧杯口并根据烧杯内水分蒸发量来测定“包封因子” 的方法,之后,等对药物粒径、性质、结晶度及其脂质类型对包 封效应的影响进行了全面系统的研究,得出粒子结晶度高、低熔点脂质、粒径小 时能够产生最大程度包封效应的结论。包封效应可以通过增加纳米粒子浓度和 调节纳米粒子粒径大小来控制。 增强皮肤水合作用:纳米粒子在皮肤表面能够产生封包效应,使皮肤表面水 分流失减少,故增加皮肤的水合作用。在体应用时,纳米粒子也能够增强皮肤的水 合作用,只是其作用机制与体外试验有所不同。等【】对名志愿者进 行了在体试验,使用 测定了皮肤的水合作用。结果表明,固体 脂质纳米粒能将皮肤的水合作用提高%。皮肤水合作用与脂质类型无关,无论 是使用混合脂质纳米结构脂质载体还是使用单一脂质固体脂质纳米粒均能 产生水合作用。 第一章前言 提高皮肤外用局部制剂的物理稳定性:从年公司推出新型脂质体 载体以来,脂质体在化妆品领域和药物制剂得到了广泛的应用。尽管如此,物理稳 定性差一直都是困扰脂质体制剂的主要问题。脂质体与表面活性剂之间以及脂 质体极易发生融合而导致该类制剂贮存期短【】。而固体脂质纳米粒、纳米 结构 脂质载体等固体纳米粒子在贮存过程中仍能保持其固态粒子状态,很大程度上保 证了制剂的物理稳定性。 提高皮肤靶向性:用于局部治疗的皮肤制剂,药物经皮吸收后直接作用于病 变部位发挥药效,而在血中药物浓度极低,从而降低了口服给药对肝肾等器官的 不良反应以及胃肠道的刺激,提高了用药的安全性、增加了患者的依从性。通常, 皮肤靶向和一定的皮肤透过量是治疗所必需的,皮肤靶向可以使不良反应最小 化。包封效应可以促进药物的透皮吸收,促进皮肤水合作用,并保证药物能够在 局部起效。等】将肾上腺皮质激素泼尼卡酯包封于固体脂质 纳米粒中经皮给药,并用胶带剥离法测定了渗入皮肤的药量。结果表明,固体脂质 纳米粒能显著提高泼尼卡酯在上层皮肤中的累积渗透量,并且纳米粒皮肤靶向机 制与其处方组成有关。 硕士学位论文 第二章处方前工作 在进行系统研究之前,首先要通过对处方前研究来考察药物的基本性质并建 立相关实验研究方法,以保证后续工作顺利进行。本章研究了他克莫司的理 化 性质,并建立了体外分析方法,为处方设计提供参考。 材料与仪器 材料 他克莫司对照品含量%,上海同田生物技术有限公司,批号: 乙腈为色谱纯,其他化学试剂均为分析纯。 仪器 高效液相色谱仪日本岛津公司;电子天平电子天平; 紫外检测器日本岛津;水浴恒温振荡器江苏金坛环字仪器?。 ?方法与结果 他克莫司体外分析方法的建立 .他克莫司检测波长的选择 精密称取他克莫司适量,用.的乙腈溶液溶解,乙腈定量稀释成适当 浓度的溶液。以乙腈为空白,按紫外分光光度法,在波长范围内进 行紫外扫描,选择最大吸收波长作为检测波长。选择高效液相作为分析 方法。 .色谱条件 色谱柱:,流动相:乙腈.水.磷酸::,柱温:?,检测波 长:,进样量:,在此条件下,空白不干扰测定,见图.。第二章处方前工作 他克莫司标准品 破乳后的. 空白 图.他克莫司的色谱图 空白 他克莫司标准品破乳后的. ; .. 一; 硕士学位论文 分析方法确证 .标准曲线的制备 精密称取他克莫司对照品,用乙腈溶液溶解,分别用流动相配制成.、、 、、、、./的标准溶液系列,经.微孔滤膜虑过,按上述 色谱条件操作,以他克莫司的峰面积与浓度作图,他克莫司质量在.?/ 内与峰面积呈良好的线性关系,得线性方程:...产., 最低检出限为:.上/,所有的样本经.微孔滤膜过滤。 .重现性实验 精密称取他克莫司对照品,分别用流动相配制成、、上/的标准溶 液,进样山,计算他克莫司含量,重复测定次。试验结果见表.。 表.重现性测定结果舻 .精密度实验 精密称取他克莫司对照品,分别用流动相配制成、、/的标准溶 液于日内间隔相等时间分别测定次,计算日内;同法每日测定次, 连续测定天,计算日间。结果见表.,.。结果表明,该方法的精密度 良好。第二章处方前工作 表日间精密度测定结果 由试验结果可知,日内、日间均小于%,说明该法的同内、日间精 密度良好。 .稳定性实验 去.咖的他克莫司对照品溶液,分别于、、、、、、进 行测定,结果见表。由结果可知,样品在内性质稳定。 ‘ 表稳定性试验结果 .回收率实验 硕士学位论文 精密量取高、中、低浓度的他克莫司溶液,分别加相应处方比例的辅料, 用乙腈溶解、超声,经.微孔滤膜虑过,法测定,结果见表..由 结果可知,该方法回收率良好。 表回收率试验结果?由以上结果可知在此色谱条件下,系统稳定,专属性高、 重现性和准确性 均良好。 中他克莫司的含量测定 精密量取他克莫司混悬液,置于容量瓶中,加入适量超 声提取,定容至刻度,摇匀,经.微孔虑膜虑过后,法测定, 跟进标准曲线方程计算他克莫司的浓度,求得含量。 他克莫司的溶解性 他克莫司,是继环孢素以后的又一细胞因子合成抑 制剂。分子式:,熔点:.,分子量.。他克莫司属 于难溶性药物,本品在乙腈、丙酮中易溶,在甲醇、乙醇溶解,在水中不溶。 药物的溶解度对于的制备、释放以及包封率都产生重要影响。本文采用 第二章处方前工作 、 法测定他克莫司在不同介质中的溶解度。分别向生理盐水、. 、油酸中加入过量他克莫司,?水浴振荡,然后离, 取上清液过.岬的微孔滤膜,用测定药物浓度,测定次,求平均值, 他克莫司在生理盐水、. 、巧、油酸中的溶解度分别为.‖、 .‖ .‖、.‖。 他克莫司的油/水分配系数 药物的亲脂性是影像包封率的一个重要因素。测定药物亲脂性最常用 的方法是测定药物的油/水分配系数。本文采用摇瓶法测定他克莫司的油/ 水分配系数。采用正辛醇为油像,为.的为水相,在经水饱和过的正辛 醇溶液中加入定量的他克莫司溶解后,与水共同置于锥形瓶中,密封,于 振荡器上剧烈振荡后,?水浴中振荡,静置分层,分别吸取水相和 油相,法测定他克莫司在两相中药物的浓度比值即油/水分配系数。 。 相/水相./..,为. ?讨论 本章确立了他克莫司的体外分析方法。经紫外扫描确定了药物的最大吸 收波长为,采用法测定固体脂质纳米粒中他克莫司的含量,药物 在..蚓范围内线性关系良好,日内、日间精密度均小于%,平均 回收率为.%之间,方法简便、可行。 本章测定了他克莫司在不同介质中的溶解度,为后续制备工艺的选择提 供参考。结果表明他克莫司在油中不溶,在生理盐水和表面活性剂溶液中微 溶, 在. 中略溶。他克莫司在水中的溶解度很低,要经皮给药,必须通过 一定的方法增大他克莫司的溶解度,才能实现较好的透皮性能。 药物药效的产生首先要求药物分子通过生物膜。生物膜相当类脂屏障, 这种屏障的作用与药物的亲脂性有关。油/水分配系数是药物亲脂性的量度。 本 章测定了他克莫司的油/水分配系数,其在为.的中油/水分配系数为 硕士学位论文 .,亲脂性较差,不易透过脂质屏障,因此药物本身透皮渗透较差。 ?本章小结 本章确立了他克莫司的体外分析方法。经方法学考察,所建立的分析方法 可行,重现性好,准确度高。测定了他克莫司在不同介质中的溶解度和油/水 分 配系数,为后续制备工艺的选择提供参考。 第三章他克莫司固体脂质纳米粒制备工艺及理化性质的研究 第三章他克莫司固体脂质纳米粒制备工艺及 理化性质的研究 固体脂质纳米粒制备方法主要有以下几种:高压匀质法、溶剂.挥发法、微 乳法、薄膜超声法、乳化蒸发.低温固化法等。不同制备方法制得固体脂质纳米 的粒径、包封率不同,对药物和载体材料的要求也不同。在参考大量文献的基 础上,通过分析他克莫司的性质及比较各种制备方法,选择适合他克莫司的固 体脂质纳米粒的制备方法:乳化蒸发.低温固化法。乳化蒸发法制备固体脂质纳 米粒分为两阶段。第一阶段是脂质材料和表面活性剂在水相中进行乳化,该阶段 是纳米乳粒的形成过程。第二阶段是纳米乳液的固化过程。实验表明,低温稀释 有利于纳米颗粒的形成。可能是快速降温使得乳液快速固化,有利于以晶型的 形成,并减少了脂质颗粒间的碰撞聚合几率;同时稀释相中的稳定剂覆盖于颗粒 的表面,进一步阻碍了脂质颗粒间的相互聚合,从而得到稳定均匀的固体脂质纳 米粒。在单因素考察的基础上,采用正交设计优化、筛选最佳处方和制备 工艺,并对优化条件下制备的他克莫司进行了质量评价和稳定性考察。 在固体脂质纳米粒的制备过程中,脂质材料、表面活性剂、乳化温度、转 速、相体积比和工艺参数的选择均影响最终的质量,根据预实验结果,从 处方因素和制备工艺两方面研究了固体脂质纳米粒的制备过程。 材料和仪器 材料 他克莫司对照品含量%,上海同田生物技术有限公司,批号; 他克莫司原料药含量%,武汉富驰有限公司;硬脂酸上海化学试剂有限 公司;山嵛酸甘油酯法国佳法赛公司:单硬脂酸甘油酯广东东巨试剂有 限公司;一葡聚糖凝胶、卵磷脂、,和哟;乙 腈为色谱纯,其他试剂均为分析纯。 硕士学位论文 仪器 高效液相色谱仪日本岛津公司:.型粒径分析仪英国 公司;恒温振荡培养箱..型上海博讯实业有限公司; 磁力搅拌器.上海雷驰器械有限公司:透射电镜汀 .: 型低温超速离心机日本公司:差示扫描量热仪 ,德国;.衍射/.,日本;电子天平 电子天平。 ?方法与结果 制备工艺的考察 .制备方法的考察 根据实验室条件、结合文献,选择以下几种方法制 备.。 , 方法:微乳法【】:将熔融的他克莫司、硬脂酸、卵磷脂、 和啕与水在混合搅拌制成微乳,将其倒入倍冷水中冷却并 稀释,即得。 方法:薄膜一超声分散法【】:将药物和脂质等溶于有机溶剂中得脂质溶 液,将溶液至于磨口梨形瓶中,于恒温水浴上用旋转蒸发仪减压蒸去有机溶 剂, 形成均匀类脂膜。加入含有表面活性剂的水相,使类脂水合,超声分散,微孔 滤膜过滤,冷却,即得。 方法:乳化蒸发低温固化法】:将药物与脂质溶于有机溶剂中构成 油相,将表面活性剂溶于水中构成水相,加热至相同温度,在机械搅拌下将油 相注入水相中,继续搅拌将有机溶剂蒸发,所得混合物快速分散于另外的低 温 水相中,搅拌即得。 采用微乳法制备时,脂质粒子在固化过程也是稀释过程常用稀释比 :~:故分散液的固体含量较低,且需使用大量的乳化剂,毒性较大。薄 膜超声分散法制备时,形成的类脂膜水化困难,且制备的纳米粒径较大, 第三章他克莫司固体脂质纳米粒制备工艺及理化性质的研究 包封率较低。采用乳化蒸发.低温固化法操作简单,装置简单,纳米粒的粒径、 包封率均较为理想,且纳米粒胶体溶液外观形态较好。故选择乳化蒸发低温 固 化法制备他克莫司。 .单因素考察.胶体溶液的处方与工艺 固定其它条件,改变单个因素,以粒径和包封率为主要考察指标,同时观 察其形态、均匀性来考察其处方和工艺。 ..脂质材料的选择 在固定主药用量,药物与脂质的重量比:,药物与卵磷脂重量 比:,表面活性剂组成: :及用量, 乳化温度士?,搅拌速度/,乳化时间.,相体积比有 机相/水相,:的情况下,分别选用硬脂酸,单硬脂酸甘油酯,山嵛酸甘油酯 做载体,制备他克莫司。上述脂质材料对的影响结果见表一。本研 究采用硬脂酸为载体的纳米粒粒径小,呈正态分布,分散指数小,稳定性较 好, 保存三个月未无沉淀。山嵛酸甘油酯为载体的纳米粒粒径较大,包封率低, 且不稳定,放置两周瓶底就见有沉淀;单硬脂酸甘油酯为载体的纳米粒粒 径较小,但是纳米粒中的药物不能被测出。 表.不同脂质材料对的影响、加 . ..表面活性剂种类及用量的选择 在固定主药用量,药物与硬脂酸的重量比:,药物与卵磷脂重 量比:,乳化温度士?,搅拌速度/,乳化时间.,硕士学位论文 相体积比有机相/水相,:的情况下,选用不同种类、不同配比、不同用量 的表面活性剂,如喇,洛沙姆,、吐温.等制备.。 结果见表.、.。由表可知,将两种表面活性剂泊洛沙姆合用且 体积比:卦备出的纳米粒大小均匀,包封率高,稳定性最好,而其他辅料所 得纳米粒径大小不均,包封率不够高,且稳定性差,表面活性剂的用量对包封 率有显著的影响。 表不同表面活性剂对的影响.表.表面活性剂用量对.的影响 .为...有机溶剂的选择 在固定主药用量,药物与硬脂酸的重量比:,药物与卵磷脂重 :,表面活性剂组成 川 :及用量, 乳化温度士?,搅拌速度/,乳化时间.,相体积比有 第三章他克莫司固体脂质纳米粒制备工艺及理化性质的研究 机相/水相,:的情况下,参考文献【】选用乙醇、二氯甲烷和丙酮制备纳米 粒。因为二氯甲烷和丙酮对脂质材料硬脂酸的溶解度比较大,而卵磷脂在 乙醇中的溶解度也较大,且药物在乙醇和二氯甲烷中的溶解度较大,选择混 合 有机溶剂进行制备,结果见表。由表可知,以二氯甲崩丙酮:为有机 溶剂时,包封率较低,且不够稳定。而以乙醇/氯甲烷:粒径最小,包封 率最高,且个月保存未出现沉淀,稳定性较好,最终确定该有机溶剂配合为 制备.有机溶剂乒 表不同有机溶剂对.的影响、? ..主药量选择 在固定药物与硬脂酸的重量比:,药物与卵磷脂重量比:,表面 活性剂组成: :及用量,乳化温度士 ?,搅拌速度/,乳化时间.,有机溶剂乙醇/二氯甲烷:, 相体积比有机相/水相,:的情,况下,分别选用主药,,制备 .胶体溶液,以包封率为评估标准,考察主药量对纳米粒的影响。结 果见表.,由结果可知,主药量对包封率有明显的影响。 表.主药量对包封率的影响 、加