【doc】脊髓分级压迫损伤病理组织学改变与磁刺激运动诱发电位相关 …

【doc】脊髓分级压迫损伤病理组织学改变与磁刺激运动诱发电位相关 … 脊髓分级压迫损伤病理组织学改变与磁刺 激运动诱发电位相关 … 整四茎堂堂塑(『FourthMilMedUnivf1999;20(4)309 #afro亏t{ ,'研究嫁着文章编号;l000—2790(1999)04—030913 脊髓分级压迫损伤病理组织学改变与磁刺激运动诱发电位相关性研究 vR ? 扬哲.,茎—连:?陈君长,丛丹丹.?赵龙拄,袁国莲.R舌.? 关键词;脊髓损镐 中图号:R68 弛 病理形态学;运动请发电桩 ' -,'__?-_-一 文献标识码;A 摘要目的:探讨脊髓分级压迫损伤的病理改变磁刺激 诱发电位之间的相关性方涪:选用41只成年家猫.随机分为 对照组,轻中,重度损伤4组.应用磁刺激运动诱发电位 (MEPs)对脊髓压迫前,压迫后30rain,6h,1wk.2wk及4 wk做动态观察,观察血管,神经细胞,神经纤维及中央管的病 理改变.结果:轻和中度损伤的病变是可逆的,而重度损伤导 致神经细胞的町逆改变和运动功能丧失.轻度损伤MEPs 潜伏期在损伤后30min及6h比术前分别延长0.37倍和 0.38倍.至4wk复原{中度损伤MEPs潜伏期延长0.77倍和 0.81倍.重度组延长1a22倍和l_361倍中度损伤组有部 分恢复而重度组无明显变化.结论:脊髓分级压迫损伤病理组 织学变化与运动功能和MEPs之问在统汁学上具有明显相关 性 Correlationofthemagneticmotorevokedpotential techniquewithpathologicalchangesassociatedwith spinalcordinjuryinadultcats IIYoFcn,.YANGZheL.SUMin,CHENfun— Chang..CONGDan—Dan,ZHAOLongZhu, yA?G?一L. .IaboratoryofOrthopedics,SecondAffiliatedCol一 [ege,DepartmentofPathology,Xi'anMedicalUni versity,Xi'art710004.China,.HospitalofXi'art HighwayUniversity Keywords:spinalcord;injury vokedpotentials AbstractAIM:Todeterminethepathologicalchanges(PC) ofthespinalcordcausedbyinjuryandtheircorrelationwith valuesobtainedbytheMagneticMotorEvokedPotentials (MEPs)techniqueMETHODS;Westudiedspinalcords from41adultcatsthat~-eredividedinto4groupsThe 作者简介李幼芬女,195508—95生.湖南省^.祝旗.1982年西安医 学院毕业.讲师.垃表论文s篇电话:7876936转29263 收稿日期:19981012{修回日期:19981211 groupsrangedfromnormalcatswhosespinalcordswerenot compressed—toslightly.moderatelyandseverelyinjured MEPswererecordedbeforecompression.andat30min.6h. 1wk.2wkand4wkaherthecompressIonunitwastn stalled.Pathologicalchangeswithincreasedpressure~-ere observedEnbloodvessels,neuralcellsandfibers.andthe centralcana1.RESULTS:Areversalofpathologicalchanges vcasobservedinslightormoderateinjuryduringthe4wkof theexperinaent.Extensiveinjury—however—causedirre versiblechanges】nthenervecellswithlo$sofFl~otorfunc tion.ThelatencyofMEPsat30rainand6hintheslightly injuredgroup037and0.38timesgreaterthanthebase— lineandreturnedtonorrl~llevelsat4wk.Inthemoderately injuredgroup,thelatencyincreased0.77and0.81timesand inthesererelyinjured1.32and1.361timesoverthebase linePartialrecoverywasfoundinthesecondgroupandno recoveryintheseverelyinjuredCONCLUSION:Thereap pearsgoodcorrelationbetweentheobservedpathological changes,motorfunctionsandMEPs. 0引言 磁刺激运动诱发电位(MEPs)作为一种新的无痛 无创的测定运动传导通路的电生理技术,已广泛用于 脊髓和神经功能的评估口.".但其与脊髓病理组织学 的相关性尚无深入的研究.本文试图通过对动物施 以分级压迫致脊髓损伤,观察脊髓神经病理组织学变 化,同时进行MEPs的检测,对损伤脊髓做动态观察 并结合在不同损伤程度下神经病理组织学的改变情 况.分析脊髓分级压迫损伤的MEPs表达形式与病理 组织学之间的相互关系. 1材料和方法 1.1动物模型制作为避免磁刺激对金属材料具有 的强吸附力,本实验采用有机玻璃.由西北有色金属 研究院制做的压迫装置.西安医科大学动物饲养中 心提供成年健康家猫41只,体重3.5kg,45kg,雌 雄不限.术前肌注阿托品0.05mg/'kg抑制呼吸道分 泌,25mI/L硫喷妥钠50mg/'kg腹腔麻醉后,将猫 俯卧位固定于自制的手术架上.自T7,T9棘突切 L-『,咬除T7,T8棘突,行T8全椎板切除后暴露脊髓 T7节段.将压迫盘纵向放置于脊髓T7表面,固定架 固定在脊髓T6和T9棘突之上.旋转螺丝钉,使压迫 盘与脊髓表面接触. 随机将猫分成正常组(A组)和压迫组.压迫组 又分为轻度组(B组),中度组(C组)和重度组(D 组).A组5只猫.只暴露椎板.安置压迫装置.B组 压迫盘向腹侧压迫脊髓深度达1.6ITIITI,C组2.4 ITIITI.D组3.2ITIITI,B,C,D组猫数均为12只,压迫 时间为1h. 1.2病理组织学检查在脊髓损伤后不同阶段,经 诱发电位(MEPs)检查后.立即处死动物,取脊髓T7 节段做病理组织学检查并与正常组所取脊髓T7对 比. HE染色观察:取材标本固定于100ml/I福尔 马林(2,3)d.将脊髓切成横断面和纵切面.常规石 蜡包埋,制备成(3,4)vm厚.HE染色.光镜下观察 神经元的形态,细胞核,神经纤维,胶质细胞和血管的 病理改变.每个标本于低倍镜下(×100倍)计数脊髓 T7节段横截面前角神经元个数. 天青?焦油紫染色:常规石蜡包埋制备(3,4) ,um切片,脱蜡至水,天青焦油紫染色.950ml/I 酒精分色.无水乙醇脱水.二甲苯透明后封片.光镜 下主要观察尼氏小体的变化. 1.3MEPs的测定使用丹麦Dantec公司生产的 Mag2型磁刺激器和$70磁圈(MC)(外径8.3CITI)测 定MEPs,最大输出磁场强度$70为3.3Tesla(T. 1T—lWb/m.).头顶刺激部位在猫cz点前,外侧各 2crfl处.对应的皮层运动区.记录针电极放置在T9 , TlO棘间韧带.参考电极置于同水平椎旁肌,接地 电极置于猫颈部.信息经Dantec.Keypoint四导诱发 电位一肌电图仪放大及印出,放大器的带通为20Hz , 1000Hz.刺激强度为最大输出强度的90.连续 记录5个MEPs,取平均值. 所有41只猫在损伤前均测定MEPs.获取正常 值.于压迫前,后30min,术后6h.1wk,2wk和4 wk分别测定MEPs.观察不同潜伏期变化.术后6 h.1wk,2wk.和4wk.不同损伤组各取3只猫做病 理学检查. 1.4统计学处理所有数据用=表示,采用SAS 统计软件做检验. 2结果 2.1组织学检查结果无损伤组(Fig1):示脊髓T7 节段正常灰质和白质.前角神经元胞体内见大而圆 的细胞核.核仁大而清晰.尼氏小体丰富.聚集在核周 围. 第四军医大学(JFourthMi【MedUniv)1999:20(4 轻度损伤组:损伤后6h.灰白质毛细血管扩张充 血.灰质内散在小灶性出血.脊髓前角个别神经元体 积稍小,尼氏小体略减少.白质见小灶性神经纤维肿 胀,断裂;损伤后1wk,灰白质内血管较损伤6h血管 充血,灶状出血加重,部分神经元体积肿大.中央尼氏 小体溶解,仅在细胞周边部见少数尼氏小体,胞浆浅 淡均匀.脊髓侧索肿胀.神经纤维断裂稍加重;损伤 后2wk,4wk,灰白质病变开始恢复,至4wk仅见 轻度肿胀,胶质细胞增生. 中度损伤组:损伤后6h,灰质中央管附近较大范 围充血,出血灶并波及白质.神经元呈微空泡变性. 核固缩,结构不清.白质神经纤维明显肿胀及部分断 裂{损伤后1wk,灰白质出血部分吸收,可见片状坏 死区.神经元进一步减少,细胞体积缩小变形,尼氏小 体明显减少(Fig2).白质肿胀较前明显.有胶质细胞 增生;损伤后2wk时灰白质破坏较前减轻.至4wk 见灰质中央部分坏死,边缘充血,出血.神经元部分 恢复正常,部分仍呈变性改变.部分白质仍见神经纤 维肿胀及断裂.胶质细胞和巨噬细胞明显增多. 重度损伤组:损伤后6h,灰质以中央管为中一tl,广 泛出血并波及部分白质.神经元数量明显减少.残留 神经元皱缩,呈三角形,见微空泡变性.核固缩,尼氏 小体明显减少甚至消失(Fig3).脊髓的前,后索及侧 索严重肿胀并有神经纤维的断裂,崩解.损伤后1 wk.灰质大片破坏,出血部分吸收,坏死灶边缘见星 形胶质细胞,并可见较多巨噬细胞.损伤后2wk灰 质出血大部分吸收.见较广泛的坏死灶,白质肿胀较 前期减轻,可见少量血管增生及胶质细胞增多.至4 wk灰质区大范围坏死灶形成,神经元亦溶解消失. 白质仍见神经纤维大范围肿胀,断裂,崩解.胶质细 胞明显增多. 2.2各组神经元变化见Tab1. 2.3脊髓分级压迫MEPs变化见Tab2. 36只猫术前和暴露脊髓末梢未压迫前MEPs的 潜伏期无明显改变.伤后6h.各组的潜伏期延长达 最高峰.此后.B组潜伏期逐渐恢复.至4wk基本正 常(Fig4);C组也开始恢复.但比较缓慢(Fig5);而 D组至4wk基本无变化(Fig6). 2.4运动功能评价采用Tarlov6级:轻度 组:术后3d.双后肢肌力3级.1wk后肌力4级一4 wk后肌力5级.中度组:术后1wk,2wk,双后肢肌 力2级.4wk后至3级.重度组:术后1wk,2wk, 双后肢肌力l级,4wk后至2级.此结果与Wrathall 报道利用重物坠落致伤模型(WD)造成脊髓分级损伤 的轻,中,重度相似. 图1无拟伤组.神经元胞体内见大而圆的细胞核.棱t一清晰.尼氏小体丰富聚集在 核周 Fig1GroupA.Noabnormalpathology(H&EA一×logB-×400) 图2巾『皇损伤组.神经元体积缩小.尼氏小件减少 Fig2GroupC.1'heshapesofnerv~cellseirregularTheNiss[substancedecreasedsignificantl y.(TianQingl—cresy blueA,×10aB.×400) 图3重度损伤蛆.残留神经元皱缩变形.核固缩尼氏小体明显碱少 Fig3Group)Nervecellsediminishedinsize.pyknosisandvacuo]ationwasobservedandthe Niss1.-;tthsIaIlC~,?epe riphraI(Hg.E^.×1goB.x401)) 3讨论 3.1脊髓受损后病理改变与运动功能的相关性病 理变化依受损程度和时间延长的表现特点:轻至中度 的压迫导致脊髓灰质内前角运动神经元病理组织学 的改变为轻至中度变性.仅很少数神经元固缩,坏死. 因而随着时间的延长,变性的神经元逐渐复原,这与 猫的功能状态相对应;而重度压迫导致前角运动神经 元严重变性及不可逆的坏死性改变,神经元数日明显 减少或消失,而且随着时间的延长,坏死区液化.其边 缘仅见增生的胶质细胞和少量血管;动物的后肢全 瘫,无任何运动功能.与形态学改变相符 表1各组神经元计数 _rab1Thenumberofthenerveceils(2-?) 表2各组不同损伤时期MEPs潜伏期变化 l曲2Changesofthelatentperiod.fMEPs?) 3.2脊髓受损后病理改变与MEPs比较轻度损 伤时,病变为多数神经元的变性,神经元计数无明显 减少.至4wk时形态学表现亦逐渐恢复;而MEPs 在压迫去除后30rain及6h潜伏期比术前分别延长 0.37倍和0.38倍.至4wk亦基本复原,二者与猫肢 体功能恢复一致.中度损伤提示:病变神经元部分严 重变性,白质明显变性,部分神经元固缩坏死,神经元 数目减少;而MEPs潜伏期在压迫去除后30min及 6h比术前分别延长0.77倍和0.81倍.至4wk时病 理改变与MEPs均有所恢复但都未完全复原,猫的 肌力也只恢复至3级.重度损伤:病理改变为灰质从 中央管开始广泛出血坏死并波及白质.白质的前,后 索及侧索神经纤维断裂.至4wk灰质仍有大量坏死 液化区.白质破坏严重,神经元少见,并有核固缩,微 空泡变性:病变多数为不可逆改变,神经元明显变性, 坏死和液化,白质破坏严重,至4wk时不能恢复, MEPs显示在压迫去除后30rain和6h比术前潜伏 期分别延长1.32倍和1.36倍.术后至4wk上述指 标无明显恢复;猫双下肢肌力为二级,与MEPs和病 理组织学相一致. 因此,脊髓分级压迫损伤的病理组织学改变与运 动功能及MEPs具有明显的相关性.比较全面地反 映了分级脊髓压迫所致的脊髓损伤. 第四军医太学(JFourthMLIMedUnLv)1999;20(4) & 6h_Fb竹 ikai 2Mter 4wkat叮 M 一 L?——一 = 图4轻度损伤组MEPs潜伏期的变化 Fig4ThelatentperiodofMEPsinslightlyinjuredgroup Be 6h^fter 1wkaf【 2wk?fb盯 图5中度损伤组MEPs潜伏期的变化 Fig5ThelatentperiodofMEPsinmoderatelyinjured group Be/m'e 'b 出5—A—————, 2—I..:^一:.::.. t L../一 图6重度损伤组MEPs潜伏期的变化 Fig6TbelatentperiodofMEPsinseverelyinjuredgronp 第四军医大学(JFourthMilMedUniv)1999;20(4) 参考文献 lDvorakJ.Herdtt~nn3一ThefierR…Magneticstimuhtionof [[IOtOToortexandmolorToolsforpainlessevaluation0fcentraland proxima}peripheraln~olorpathwaysNormalvalucsandclinics} app]ieationindisordersDfthelumharspineSpine-1991{16(3): 3l3 病中的谚断fjr值研究中华骨科杂志.1998.18L1i10—13 3TarlovIM.HerzE.SpinalcordcompressionsIudies.tr~Jz,Veartd r…h_,195.1;70/1):43—51 1WrathallJR.PettegrewRW.HarreyF.SpinalcordeONtus~onLn theral:productionofgraded.reproducibleinjurygroupsExp f'?+?????+????????'???+????+??????+??????++?+????+? T- Neurol185881108122 』2杨哲.陈君长.赵龙柱.破乖i澈运动诱发电位在脊髓型颈椎,编辑孙长 :日E—qR1.0'(:一 ? 研究简报?文章编号:1000—2790(1999)04—03I3I3 人骨形态蛋白一3基因真核表达载体 (PcDNA3一hBMP3)构建尺;7,j- U 韩一生'.惠宏襄,崔大祥.胡蕴王(第四军医大学: 西京医院全军骨科研究所.基础部生物化学教研室..基因研 究所.陕西西安710033) 关重型奎l7 中图号R31801文馘标识码:D 0引言人骨形态蛋白3(hBMP3)可诱导多种来源的未分 化问充质细胞向软骨细胞和戒骨细胞转化.进而形成新骨. 而且对软骨细胞也有促进分裂和增殖的作用.促进后者I型 胶原和氨基多糖(PG)的分泌转基因技术和真核表达载体的 产生为软骨细胞库建立和开展软骨组甥工程提供了新的途 径.本研究通过基因克隆和重组DNA技术将hBMP一3的cD- NA构建在真核表达载体PcDNA3上.形成重组真核表达载 体PcDNA3-hBMP3.这也是下一步基因转染的前期工作. 1材料和方法 1,1试剂PcDNA3,和pUC—hBMP3质粒由美国加州遗传 研究所馈蜡.其中PeDNA3质粒EcoR1Xbal1位点间可插 ^hBMP3的全长cDNA,后者为1.40kbEcoRI.x】 和T;DNA连接酶(华美公司);溴化乙锭【EB)和RnaseA(10 mg/mI);低溶点琼脂糖和普通琼脂糖(Gibco公司)并需配 制IB液体培养基,选择性固体培养基,FE缓冲液和TAE电 泳缓冲液 12仪器CO孵箱,低温冷冻高速离心机.水浴恒温摇床, 真空干燥仪.紫外梭测仪,手提长渡紫外灯.水平电泳仪,恒温 烤箱,电子分析天平. i.3重组真桩表达栽体PcDNA3hBMP3的构建,纯度浸0定 和鉴定大肠杆菌I)H5a感受态细胞的制备~hBMP3质牲 DNA细菌转化~hBMP3质粒DNA小量提取和酶切鉴定一 hBMP3质粒DNA酶切片断回收一质粒DNA含量及纯度的 测定一将BBMP3定向克隆至真棱表达载体PcDNA3中一 PcDNA3hBMP3重组质粒大量制备~PcI)NA3hBMP3重组 质粒DNA纯化一PcDNA3hBMP3重组质粒古量和纯度测 作者筒彳r:韩一生.男37岁.副主任医师,副教授.博士生 收辅日期:1998】118{恬回日期:19981215 定PcI)NA3hBMP3的酶切鉴定:用EroR】和x1双酶 切.切下片段在15g/I琼脂糖电泳进行鉴定. 2结果BMP3c1)NA酶切鉴定:用EcoR1和XbaI双酶 切PcDNA3一hBMP3.切下的片段和I)NA/Hing?Markers 于15g/I琼脂糖电诛,见有5.4kb和1.4kh两个片断诛带. 前者为PcDNA3,后者为hBMP3.符合物理图谱,说明基因重 组成功.具体见图1 图1PcDNA3hBMP3酶切鉴定 1.PDNA3hBMP3/EcoR1一Xba 3讨论软骨细胞有丝分裂活动扳低,其组织修复能力差 体外软骨细胞培养其有限增殖性,对接种密度的依赖以及难 保持软骨细胞表型是软骨组织工程和软骨细胞库建立必须 解决的难题利用基因重组和转基因技术.将hBMP3全长 cDNA定向克隆至高效的真棱表达载体PcDNA3中,转染软 骨细胞.使后者内源眭BMP3高表达.形成自身促进生长机 制.从而有利于?型胶原及P(的台成和软骨细胞表型的保 持.将为软骨细胞库建立和开展软骨组织工程创造良好条件. 基因转移的关键是构建真核表达载体并使其在真棱细胞 中获得表达.车研究中,pUChBMP3和PcDNA3均古有相同 的酶切位点EeoRT和XbaT.两者匹配一因此可将hBMP,~ 全长eDNA定向克隆至PcDNA3.形成重组真棱表达载体命 名为PcDNA3一hBMP3.PcDNA3hBMP3构建的成功也将为 进一步从分子水平分析hBMP3的生物学功能队厦研究其作 为棱酸疫苗治疗某些骨关节疾病提供直接的宴验依据 编辑何扬举