温度对尼罗罗非鱼无乳链球菌毒力的影响（可编辑）

温度对尼罗罗非鱼无乳链球菌毒力的影响（可编辑） 温度对尼罗罗非鱼无乳链球菌毒力的影响 水4 产4 学4 报 第/0 卷 第11 期 ./01/0"%/111 231/ 年11 月 4 %/21"231/ !"#$%&’"*+,$,*"-+%& 文 章 编 号!133353617#231/$11510//53: 3" !131/0294*51!112/11231/1/8096 温 度 对 尼 罗 罗 非 鱼 无 乳 链 球 菌 毒 力 的 影 响 " " 刘 志 刚!4 可 小 丽!4 卢 迈 新 !4 朱 华 平!4 高 风 英 # 中 国 水 产 科 学 研 究 院 珠 江 水 产 研 究 所" 农 业 部 热 带 亚 热 带 水 产 资 源 利 用 与 养 殖 重 点 实 验 室" 广 东 广 州4731/83$ 摘 要! 为 了 解 温 度 对 鱼 源 无 乳 链 球 菌 毒 力 的 影 响 机 制! 本 实 验 研 究 了 温 度 对 无 乳 链 球 菌 毒 力 相 关 参 数$ 生 长& 粘 附& 入 侵& 毒 力 基 因 达 以 及 对 罗 非 鱼 致 死 率% 的 影 响" 结 果 发 现! 不 同 培 养 温 度 下$2793Q% 无 乳 链 球 菌 的 生 长 速 度 不 同!/0Q 为 其 最 适 生 长 温 度!27Q 时 生 长 速 度 最 慢’27/9 Q 内 无 乳 链 球 菌 粘 附 在 惰 性 基 质 上 的 菌 体 对 应 的 吸 光 值$"3 % 之 间 无 显 著 7:37 差 异$!C3137%!/0 Q 时 显 著 增 加!93 Q 时 又 急 剧 下 降’ 罗 非 鱼 在 人 工 感 染 无 乳 链 球 菌 后 各 时 间 点$6&12&29 和98 %! 鱼 体 脑 组 织 中 菌 量 随 注 射 菌 体 培 养 温 度 的 增 加 呈 先 上 升 后 下 降 的 趋 势! 且 与 不 同 培 养 温 度 下 的 无 乳 链 球 菌 对 罗 非 鱼 的 致 死 率 呈 正 相 关’ 无 乳 链 球 菌 毒 力 基 因 的 表 达 也 与 培 养 温 度 相 关!07B 和/6; 基 因 的 表 达 量 随 菌 体 培 养 温 度 的 升 高 先 增 加 后 降 低! 分 别 在 /9 和/0 Q 处 达 到 峰 值! 不 同 培 养 温 度 下 无 乳 链 球 菌&1$ 基 因 表 达 的 变 化 幅 度 较 小! 而&/$E 基 因 的 表 达 则 随 培 养 温 度 增 加 而 下 降’ 无 乳 链 球 菌 对 罗 非 鱼 的 致 死 率 随 其 培 养 温 度 的 升 高 呈 先 升 高 后 降 低 趋 势! 低 温$27 和28 Q% 培 养 条 件 下 的 菌 体 对 罗 非 鱼 致 死 率 较 低$ B23S%!/0 Q 时 致 死 率 最 高66160SD6160S" 以 上 结 果 表 明 温 度 参 与 无 乳 链 球 菌 生 长& 粘 附& 转 移& 入 侵 和 部 分 毒 力 基 因 表 达 的 调 控! 它 们 共 同 影 响 无 乳 链 球 菌 对 罗 非 鱼 的 毒 力" 关 键 词! 尼 罗 罗 非 鱼’ 无 乳 链 球 菌’ 温 度’ 毒 力 中 图 分 类 号!G:/818’*:6744444444 文 献 标 志 码& 44 罗 非 鱼 具 有 生 长 快& 食 性 杂& 适 应 性 强 等 特 说 明 温 度 是 无 乳 链 球 菌 致 病 力 的 重 要 影 响 因 子" 点" 是 联 合 国 粮 农 组 织 推 荐 的 世 界 性 优 良 养 殖 鱼 但 其 对 温 度 具 体 的 作 用 机 制 并 未 作 阐 述’ 7 种 之 一’ 但 近 年 来" 随 着 养 殖 规 模 的 扩 大 和 养 殖 P@I@:@LL9 等 通 过 比 较 研 究93 和/3 Q 培 养 温 环 境 的 恶 化" 导 致 罗 非 鱼 链 球 菌 病 频 繁 暴 发" 严 重 度 下 人 源 无 乳 链 球 菌 的 转 录 组 发 现"93 Q 培 养 的 阻 碍 了 罗 非 鱼 养 殖 业 的 健 康 发 展’ 无 乳 链 球 菌 菌 株 较/3 Q 的" 其 毒 力 相 关 基 因& 嘌 呤 代 谢 及 铁 #4+’$+5/5//%&""7"/+1"$ 是 罗 非 鱼 链 球 菌 病 的 摄 取 相 关 基 因 表 达 均 呈 显 著 上 调 趋 势" 新 陈 代 谢 6 主 要 病 原 之 一" 其 又 称 E 族 链 球 菌#DI/H E 相 关 基 因 则 呈 下 调 表 达’ I@9L8J’9/@ 等 研 究 *LI@HL/?/??J "DE*$" 具 有 较 高 的 致 病 率 和 致 死 表 明 人 源 无 乳 链 球 菌 对 人 脐 静 脉 内 皮 细 胞 率’ 流 行 病 学 研 究 表 明" 该 病 原 通 常 流 行 于 我 国 #+#.,-J $ 的 粘 附 和 入 侵 能 力 在93 Q 条 件 下 显 南 方7*13 月 份 的 高 温 期" 且 水 温/3 Q 以 上 时 易 著 强 于/0 Q’ 说 明 温 度 可 以 调 控 无 乳 链 球 菌 毒 15/ 暴 发" 当 水 温 在23 Q 以 下 时 则 较 少 发 病 " 推 力 基 因 及 其 他 代 谢 相 关 基 因 的 表 达" 改 变 其 粘 附 测 温 度 对 无 乳 链 球 菌 的 毒 力 有 重 要 影 响’ 及 入 侵 能 力" 进 而 改 变 细 菌 整 体 毒 力’ 病 原 菌 毒 9 $/AF7 等 通 过 研 究 不 同 水 温 条 件 下 尼 罗 罗 力 是 侵 袭 力# 包 括 粘 附& 定 植& 入 侵& 繁 殖& 扩 散 及 非 鱼 对 8 血 清 型 无 乳 链 球 菌 的 敏 感 性" 发 现 高 抵 抗 宿 主 防 御 的 能 力 等$ 和 产 毒 性# 包 括 内 毒 素 % 058 水 温 条 件 下 无 乳 链 球 菌 更 易 侵 染 罗 非 鱼" 进 一 步 和 外 毒 素$ 的 综 合 作 用 结 果 ’ 据 此 本 实 验 通 收 稿 日 期!231/636631444 修 回 日 期!231/6386/3 资 助 项 目! 现 代 农 业 产 业 技 术 体 系 建 设 专 项#-&$*69:$% 广 州 市 科 技 计 划#231/!9133308%231/33333369$ 通 信 作 者! 卢 迈 新",67890 !7Z60;16/1?/7 !""#!!$$$%&’*+,-%’.444 水4 产4 学4 报 /0 卷 10/9 过 研 究 不 同 温 度 下 菌 株 毒 力 基 因 表 达& 粘 附 力& 侵 倒 去 孔 中 培 养 基" 每 孔 用273&’ 的 生 理 盐 水 洗 涤 染 力& 致 病 性 等" 较 系 统 的 探 讨 了 温 度 对 罗 非 鱼 无 / 次 除 去 游 离 的 细 菌’ 63 Q 烘 箱 中 干 燥 后 每 孔 加 乳 链 球 菌 毒 力 的 影 响" 以 期 为 进 一 步 深 入 了 解 温 233&’1S 的 结 晶 紫 染 液 染 色7 79" 弃 去 染 液 后 度 对 鱼 源 无 乳 链 球 菌 毒 力 的 调 控 机 制 奠 定 基 础’ 用 生 理 盐 水 洗 涤/ 遍 去 除 多 余 的 染 色 剂’ 在 空 气 中 晾 干 后" 每 孔 加 入233&’//S#OPO$ 冰 醋 酸" 14 材 料 与 方 法 待 结 晶 紫 充 分 溶 解 后 置 于 酶 标 仪 中 在7:3 7 波 $%$& 实 验 菌 株 长 下 检 测 各 孔 的 吸 光 值’ 实 验 菌 株E*’2%N 为 本 实 验 室 分 离 并 保 存 的 $%Q& 温 度 对 无 乳 链 球 菌 入 侵 和 转 运 能 力 的 影 响 致 病 性 罗 非 鱼 无 乳 链 球 菌" 实 验 前 在 血 琼 脂 平 板 将9 Q 暂 存 的 无 乳 链 球 菌 菌 液 以1?73#OP 上 进 行 活 化" 在 脑 心 浸 出 液 培 养 基#E+ $ 中 扩 大 O$ 的 比 例 接 种 于 新 鲜 的E+ 培 养 基 中" 分 别 置 于 培 养’ 培 养 箱 中 在 不 同 温 度#27&28&/1&/9&/0 和93 Q$ $%A& 实 验 用 鱼 与 饲 养 条 件 下233 I479 振 荡 培 养 至 对 数 生 长 期#"3 6337 实 验 用 尼 罗 罗 非 鱼#-’5/0’5#1&*175+1/%& " 112$"/733 I479 离 心7 79" 收 集 菌 体 沉 淀" 分 DNJLI89$ 购 于 广 东 罗 非 鱼 良 种 场" 体 质 量 为 别 用3187S 的 生 理 盐 水 将 菌 液 浓 度 调 节 至917@ 8 68 :" 实 验 前 在 室 内 养 殖 条 件 下 驯 养2 周’ 选 13 -#47’#’3 " 为 预 实 验 结 果$’ 分 别 用 不 同 73 用 健 康# 实 验 前 抽 样 检 测" 实 验 鱼 不 携 带 无 乳 链 温 度 下 培 养 的 无 乳 链 球 菌 菌 悬 液 对 罗 非 鱼 进 行 腹 球 菌& 寄 生 虫 等 病 原$& 个 体 大 小 一 致 的 尼 罗 罗 非 腔 注 射 感 染" 每 尾133 ’" 对 照 组 注 射 等 量 的 生 & 鱼" 随 机 分 为0 组#6 个 处 理 组 和1 个 对 照 组$" 每 理 盐 水’ 分 别 在 接 种 后6&12&29 和98 时" 从 各 组/ 个 重 复" 每 个 重 复/3 尾 鱼’ 隔 天 换 水 约14/" 组 中 随 机 抽 取/ 尾" 无 菌 条 件 下 取 其 脑 组 织" 称 重 溶 氧 保 持 在013 7:4’ 左 右"H+013 813" 水 温 后 以3137 :47’ 的 比 例 加 入 生 理 盐 水" 用 匀 浆 器 #/3D2$Q" 每 天 投 喂 饲 料 两 次" 每 次 约 为 鱼 体 质 #P--$&361/3227$ 充 分 研 磨’ 1 333 I479 低 量 的/S’ 速 离 心1 79 沉 淀 组 织 碎 片 后" 取 上 清 液 进 行 稀 $%B& 温 度 对 无 乳 链 球 菌 生 长 的 影 响 释# 稀 释 倍 数 根 据 预 实 验 结 果 为133 倍 最 佳$" 取 将 无 乳 链 球 菌 划 线 接 种 于 血 琼 脂 平 板 上" 在 133&’ 涂 布E+ 琼 脂 平 板" 每 个 样 品 涂 布/ 个 平 28 Q 恒 温 培 养 箱 中 培 养98 ’ 用 灭 菌 牙 签 挑 取 板’ 28 Q 恒 温 培 养 箱 中 培 养29 " 观 察 菌 落 形 成 单 菌 落 于 新 鲜E+ 液 体 培 养 基 中" 于28 Q"233 情 况" 统 计 菌 落 数 目" 并 随 机 挑 取13 个 菌 落 进 行 I479 下 振 荡 过 夜 扩 大 培 养 后 置 于9 Q 暂 存" 备 生 理 生 化 和16*I$%& 基 因 分 子 鉴 定’ 用’ 按1?73#OPO$ 的 比 例 将 上 述 菌 液 接 种 于 新 $%U& 温 度 对 无 乳 链 球 菌 毒 力 基 因 表 达 的 影 响 鲜 的E+ 培 养 基 中" 分 别 置 于27&28&/1&/9&/0 和 按 照 温 度 对 无 乳 链 球 菌 入 侵 和 转 运 能 力 的 影 93 Q 恒 温 摇 床 中"233 I479 振 荡 培 养" 每 个 温 度 响 中 的 步 骤 准 备 不 同 培 养 温 度 下 处 于 生 长 对 数 期 下 设 置/ 个 重 复’ 每 隔1 检 测 一 次 菌 液 的 吸 光 的 无 乳 链 球 菌 菌 液" 每 个 温 度 设 置/ 个 重 复" 分 别 值#"3 $" 直 至 菌 液 的 吸 光 值 稳 定" 绘 制 生 长 从 各 组 中 取1177’ 菌 液 置 于 离 心 管 中"12333I4 6337 曲 线’ 79 离 心7 79" 收 集 菌 体 沉 淀" 置 于 液 氮 中 冻 存" $%F& 温 度 对 无 乳 链 球 菌 粘 附 能 力 的 影 响 备 用’ :513 NP 通 过 改 良 的 微 量 滴 定 法 来 检 测 不 同 温 用5I@’9F $%&P99B9L #29LI/:@$ 试 度 下 无 乳 链 球 菌 对 惰 性 基 质 的 粘 附 能 力’ 将28 剂 盒 抽 提 细 菌 $%&" 提 取 步 骤 参 照 试 剂 盒 说 明 Q 下 扩 大 培 养 的 无 乳 链 球 菌 菌 液 于/ 733 I479 ’ 用1S 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 所 提 取$%& 的 下 离 心7 79" 弃 上 清 液" 用 新 鲜 的E+ 液 体 培 养 质 量" 并 用 核 酸 定 量 仪#,HH@A/IK $ 测 定$%& 浓 6 基 将 菌 液 浓 度 调 节 至1@13 -#47’’ 分 别 向6 度’ 用 $%8J@6I@@3%8J@#5I/7@:8$ 去 除 $%& 块:6 孔 无 菌 酶 标 板 中 加 入233&’ 的 细 菌 悬 液" 中 的 痕 量 的3%&" 步 骤 参 照 试 剂 盒 说 明 书’ 通 过 以 无 菌E+ 培 养 基 为 空 白 对 照" 每 组 设 置 各6 个 对 细 菌$%& 进 行16*I$%& 基 因 片 段 的5-$ 扩 平 行 孔" 盖 上 盖 子 后 放 入 湿 盒 中" 分 别 置 于 不 同 温 增 来 检 测3%& 去 除 效 果" 引 物 和 程 序 与 荧 光 定 度#27&28&/1&/9&/0 和93 Q$ 下 静 置 培 养29 ’ 量5-$ 中 一 致" 若 扩 增 结 果 为 阴 性" 则 说 明3%& !""#!!$$$%&’*+,-%’.11 期 刘 志 刚" 等!" 温 度 对 尼 罗 罗 非 鱼 无 乳 链 球 菌 毒 力 的 影 响 140/4 7 去 除 完 全’ 荧 光 定 量5-$引 物# 表1$’ 荧 光 定 量 5-$ 反 应 - 取 1 &: $%&" 用 5I97@*?I9HL+1JL*LI8A 体 系 #23 &’$ 包 括!*UE$ *@0@?LP8JL@IP9Z ?3%&*CL@J9JB9L #N8B8$8$ 试 剂 盒 中 随 机 引 物 #&E $13 ’" 上 游 引 物 和 下 游 引 物 各317 ’#13 & & 对 无 乳 链 球 菌$%& 进 行 逆 转 录" 步 骤 参 照 试 剂 盒 7/04’$"?3%& 模 板317 ’#3137 :4’$" 无 & & & & 说 明 书"?3%& 于 523 Q 保 存 备 用’ 根 据 菌 双 蒸 水 817 &’’ 在 0 /33 $@806N97@5-$ D@E8F 中 已 登 录 的 罗 非 鱼 无 乳 链 球 菌 毒 力 因 子 *CJL@7#&E $ 上 进 行 荧 光 定 量5-$ 反 应" 反 应 程 #-&P5 因 子4 促 溶 血 因 子#-&P5K8?L/I6JH@?9K9? 序 如 下!:7 Q 预 变 性2 79%:7 Q 变 性17 J "63 Q :@@ "-KM$%-78 肽 酶 蛋 白 #*LI@HL/?/??80-78 退 火/3 J "02 Q 延 伸/3 J "93 个 循 环% 在02 Q 采 H@HL9A8J@KI/7DE*"*?HE$% 溶 血 素#@7/0CJ94 集 荧 光 信 号’ 内 参 基 因16*I$%& 与 毒 力 基 因 分 8@7/0CJ9"+0C$% 表 面 免 疫 原 性 蛋 白 #*IK8?@ 不 同 孔 同 时 进 行5-$ 反 应" 设 置 阴 性 对 照# 不 加 77/:@9?5I/L@9"*9H$$ 及 16* 核 糖 体 $%& ?3%& 模 板$" 每 个 样 品 设 置/ 个 重 复", 值 取 其 L #16*I9M/J/780$%&"16*I$%&$ 基 因 序 列" 设 计 平 均 值’ 表$& 检 测 罗 非 鱼 无 乳 链 球 菌 毒 力 因 子 的 荧 光 定 量CIP 引 物 5/6%$&C.:1.0+012CIP/00/@0981R,.1009298B.""/"1+0"J.+12?18/?;9.0 引 物 名 称 引 物 序 列#7R6/R $ 碱 基 数4MH 参 考 序 列 产 物4MH HI97@I HI97@IJ@T@?@ 0@:L I@K@I@?@J@T@?@ HI/A?L 16*I$%&6 ND&D&NDD&--ND-DNNDN&N 21 !G3/:/6811 17/ 16*I$%&6$ -&NND--D&&D&NN---N&- 23 ?KM6 N&D-NN&DNN&N---&&&N--- 22 !G28:76811 103 ?KM6$ N&&&D&-NN-&NND-DND-- 23 J?HE6 NND-N&&-DD&&--N&-&--N&N- 29 #76:3811 12: J?HE6$ &D&&NDNND--D&NDNND-D 23 J9H6 N-DD&&DDN&ND&-&--&D&& 21 +G8089/611 110 J9H6$ NND&-N&&-&D-NND---NND 21 0C6 &&ND-N&N-N-NNNNDD-DDN&N- 29 !X86/60/11 178 0C6$ -D&N---&&&N&&-N-N&ND&&&D- 27 $%3& 温 度 对 无 乳 链 球 菌 致 病 力 的 影 响 24 结 果 将 不 同 温 度 下 培 养 的 处 于 生 长 对 数 期 的 无 乳 链 球 菌 菌 悬 液" 用3187S 生 理 盐 水 调 节 浓 度 至 A%$& 不 同 温 度 下 无 乳 链 球 菌 的 生 长 曲 线 8 917@13 -#47’" 分 别 对 罗 非 鱼 进 行 腹 腔 注 射 /0 和93 Q 温 度 下 生 长 速 度 最 快"2 左 右 就 感 染" 每 尾133&’" 对 照 组 注 射 等 量 的 生 理 盐 水" 达 到 对 数 生 长 期"93 Q 时 虽 比/0 Q 时 要 较 早 达 观 察 各 组 的 死 亡 情 况" 统 计0 A 内 各 组 的 总 死 亡 到 稳 定 生 长 期" 但 其 吸 光 值#"3 $ 低 于/0 Q 6337 吸 光 值’ 27 Q 时 其 生 长 速 度 最 慢"617 左 右 才 率’ 为 确 定 鱼 体 死 亡 是 否 由 无 乳 链 球 菌 感 染 引 起" 取 濒 死 鱼 体 进 行 无 菌 解 剖 观 察 和 细 菌 分 离’ 到 达 对 数 生 长 期’ 28 /9 Q 内 的 生 长 曲 线 比 较 接 近’ 不 同 温 度 下" 处 于 相 同 生 长 阶 段 的 吸 光 值 $%4& 数 据 处 理 与 分 析 5 , 11 22 L 采 用2 法 计 算 不 同 温 度 下 无 乳 链 球 相 近" 吸 光 值"3 112 时" 都 处 于 对 数 生 长 期 6337 菌 各 毒 力 基 因 的 相 对 表 达 量" 其 中2,,# 毒 力 # 图1$’ L L 基 因$ 5,# 内 参 基 因$% , ,# 处 理 组$ 5 A%A& 不 同 温 度 下 无 乳 链 球 菌 对 惰 性 基 质 的 粘 附 22 2 L L L ,# 对 照 组$" 将27 Q 组 定 义 为 对 照 组" 其 它 温 2 能 力 L 度 组 则 为 处 理 组’ 应 用*5**1013 统 计 软 件 中 单 通 过 微 量 滴 定 法 检 测 不 同 培 养 温 度 下 无 乳 因 素 方 差 分 析 中3?8 检 验 方 法 对 不 同 组 别 对 链 球 菌 对 惰 性 基 质 的 粘 附 能 力" 发 现 在 27 应 的 粘 附 能 力& 入 侵 能 力& 毒 力 基 因 相 对 表 达 量 和 /9 Q 内 无 乳 链 球 菌 粘 附 在 惰 性 基 质 上 的 菌 体 对 死 亡 率 的 相 关 数 据 进 行 显 著 性 检 验"!B3137 为 应 的 吸 光 值 #"3 $ 之 间 无 显 著 差 异 #!C 7:37 差 异 显 著" 数 值 以P@8D*3 的 形 式 表 示’ 3137$"/0 Q 时 显 著 增 加" 显 著 高 于 其 它 温 度 组 !""#!!$$$%&’*+,-%’.444 水4 产4 学4 报 /0 卷 10/6 对 应 的 吸 光 值#!B3137$"93 Q 时 其 吸 光 值 又 仍 显 著 高 于 其 它 温 度 组’ 感 染29 后"27&28&/1 急 剧 下 降# 图2$’ 和93 Q 组 的 脑 组 织 中 菌 落 数 都 开 始 下 降" 而 /0 Q 组 维 持 在12 水 平"/9 Q 组 略 有 上 升’ 感 染98 后" 各 实 验 组 鱼 体 脑 组 织 中 菌 量 都 明 显 下 降" 但 仍 表 现 为 随 无 乳 链 球 菌 培 养 温 度 的 升 高 呈 现 先 上 升 后 下 降 的 趋 势" 在 /0 Q 时 到 达 峰 值" 93 Q 组 开 始 下 降# 表2$’ 图$& 无 乳 链 球 菌 在 不 同 培 养 温 度 下 的 生 长 曲 线 ’%$&5-1.9H;-?+.J1098B.""/"1+0"/; 881.12;?+;+.1;1:,1./;+.10 A%B& 不 同 温 度 培 养 的 无 乳 链 球 菌 对 脑 组 织 的 侵 染 能 力 实 验 组 罗 非 鱼 人 工 感 染 无 乳 链 球 菌 后 各 时 间 图A& 不 同 培 养 温 度 下 无 乳 链 球 菌 粘 附 惰 性 基 质 的 能 力 点#6&12&29 和98 $" 脑 组 织 中 都 能 分 离 到 相 同 数 值 为7@8D*3#*6$% 各 组 上 方 字 母 不 同 表 示 组 间 差 异 形 态 的 细 菌" 随 机 挑 取13 个 菌 落 进 行 生 理 生 化 和 显 著"!B3137% 字 母 相 同 表 示 组 间 无 显 著 差 异"!C3137 16*I$%& 基 因 分 子 鉴 定" 确 定 为 无 乳 链 球 菌" 对 ’%A&5-1/-10J1?/,/?;@;9;-121.; 照 组 未 分 离 到 细 菌’ 在 感 染 后6" 实 验 组 鱼 体 脑 0+60;./;198B.""/"1+0"/;881.12; 组 织 中 无 乳 链 球 菌 量 随 注 射 细 菌 的 培 养 温 度 增 加 2?+6/;92;1:,1./;+.1 呈 现 先 上 升 后 下 降 的 趋 势" 在/0 Q 时 到 达 峰 值" 38L8V@I@J/V 8J7@8JD*3#* 6$% DI/HJV9L L@ 93Q 时 脑 组 织 中 菌 落 数 开 始 下 降’ 感 染12 后" A9KK@I@L0@LL@IJJ/V@AJ9:9K9?8LA9KK@I@?@ "!B3137% DI/HJ V9LL@J87@0@LL@IJ/V@A/J9:9K9?8LA9KK@I@?@ "!C3137 各 实 验 组 鱼 体 脑 组 织 中 菌 量 进 一 步 增 加"/0 Q 组 表A& 不 同 温 度 培 养 的 无 乳 链 球 菌 人 工 感 染 尼 罗 罗 非 鱼 后 不 同 时 间 脑 组 织 中 无 乳 链 球 菌 菌 落 数 5/6%A&5-1?992@89.:2+2;02;-16./298"1;/,//;881.12;-9+.0/8;1.612 281?;1H;-B.""/"1+0"2?+6/;1/;881.12;;1:,1./;+.10 脑 组 织 中 无 乳 链 球 菌 菌 落 数 量’:#-#4:$ L@?/0/CK/I79:9LJ/K4.""7"/+1"9L@MI89 感 染 时 间4 IJH/JL69K@?L9/ 27 Q 28 Q /1 Q /9 Q /0 Q 93 Q 8 8M 8M M8M 6 71/2D3128 717/D311/ 7103D3138 7100D3129 61/8D3118 7168D3128 8 8M 8M 8MM? 12 71:6D3110 6121D3117 61/0D3129 61/2D31/: 6108D3112 6172D3119 8 8 M? M 29 7176D3110 71/8D3116 6110D311: 6166D311: 6108D3112 613/D311: 8 MA A 8 98 9166D3113 91::D311/ 7197D3112 7166D3111 7103D3130 9100D3130 注! 表 中 数 值 均 以7@8D*3 的 形 式 表 示" 数 值 右 上 角 的 字 母 用 于 表 示 不 同 温 度 组 无 乳 链 球 菌 感 染 罗 非 鱼 后" 在 同 一 时 间 点 对 应 的 脑 组 织 中 无 乳 链 球 菌 菌 落 数 量 之 间 的 差 异" 字 母 相 同 则 数 值 之 间 无 显 著 差 异#!C3137$" 字 母 不 同 则 表 明 数 值 之 间 显 著 差 异#!B3137$ %/L@J !.80@J9L@L8M0@82@M@@ J/V@A 9 L@K/I7/KP@8 D*31’@LL@IJ9 L@L/H I9:L?/I@I/KL@280@JI@HI@J@LL@JL8L9JL9?80 A9KK@I@?@/KL@?/0/CK/I79:9LJKI/7A9KK@I@L:I/HJ8LL@J87@L97@8KL@I9K@? 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&/6;&&1$ 和&/$E 基 因 的 表 达 水 平% 数 值 为7@8D*3#*/$" 柱 子 上 方 字 母 不 同 表 示 各 组 之 间 差 异 显 著"!B3137% 字 母 相 同 则 表 示 各 组 之 间 无 显 著 差 异"!C3137 ’%B&5-11R,.100921J1098B.""/"1+0" &0J.+12?112102?+6/;1/;881.12;;1:,1./;+.1 #8 $ 5#A$ I@HI@J@L@AK/IL@@ZHI@JJ9/0@2@0J/K07B "/6;"&1$8A&/$E:@@I@JH@?L92@0C%38L88I@J/V8J7@8JD*3#*/$":I/HJ V9LL@A9KK@I@L0@LL@IJJ/V@AJ9:9K9?8LA9KK@I@?@ "!B3137%:I/HJV9LL@J87@0@LL@IJ/V@A/J9:9K9?8LA9KK@I@?@ "!C3137 A%Q& 罗 非 鱼 感 染 不 同 温 度 培 养 的 无 乳 链 球 菌 后 的 死 亡 率 将 不 同 温 度 培 养 的 无 乳 链 球 菌" 同 等 剂 量 注 射 感 染 罗 非 鱼’ 较 低 温 度#27 和28 Q$ 下 培 养 的 无 乳 链 球 菌 引 起 罗 非 鱼 的 死 亡 率 较 低" 低 于 23S’ 当 培 养 温 度 上 升 到/1 Q 时" 无 乳 链 球 菌 感 染 罗 非 鱼 后 的 死 亡 率 急 剧 增 加" 达 到63S 左 右’ /0 Q 时 的 死 亡 率 最 高66160SD6160S" 到93 Q 时 略 有 降 低7/1//S D6160S’ 但 在/1 93 Q 内" 不 同 温 度 组 罗 非 鱼 死 亡 率 并 无 显 著 差 异# 图 图F& 罗 非 鱼 感 染 不 同 温 度 培 养 的 无 乳 链 球 菌 后 的 死 亡 率 9$’ 取 刚 死 亡 鱼 体 进 行 无 菌 解 剖" 可 见 腹 水& 肝 数 值7@8D*3#*/$" 柱 子 上 方 字 母 不 同 表 示 各 组 之 间 差 脏 肿 大 充 血& 胆 囊 充 盈& 脑 膜 充 血 等 无 乳 链 球 菌 感 异 显 著"!B3137% 字 母 相 同 则 表 示 各 组 之 间 无 显 著 差 异 "!C 染 典 型 症 状" 从 脑& 肝& 脾 脏 中 可 分 离 到 无 乳 链 3137 球 菌’ ’%F&5-18/;/;@./;198;/,/281?;1H;- B.""/"1+0"2?+6/;1/;881.12;;1:,1./;+.1 /4 讨 论 38L88I@J/V8J7@8JD*3#*/$":I/HJV9LL@A9KK@I@L 0@LL@IJJ/V@A J9:9K9?8LA9KK@I@?@ "!B3137%:I/HJV9L L@ 微 生 物 的 毒 力 是 其 在 宿 主 体 内 繁 殖" 并 由 此 J87@0@LL@IJ/V@A/J9:9K9?8LA9KK@I@?@ "!C3137 而 引 起 疾 病 的 能 力% 病 原 菌 毒 力 是 侵 袭 力# 包 括 !""#!!$$$%&’*+,-%’.444 水4 产4 学4 报 /0 卷 10/8 16 粘 附& 定 植& 入 侵& 繁 殖& 扩 散 及 抵 抗 宿 主 防 御 的 能 境 信 号 应 答 和 群 体 感 应 系 统 来 完 成 的 % 在 这 个 力 等$ 和 产 毒 性# 包 括 内 毒 素 和 外 毒 素$ 的 综 调 节 过 程 中 需 要 多 种 功 能 酶 的 参 与" 而 酶 的 活 性 058 合 ’ 病 原 微 生 物 毒 力 受 到 外 界 环 境 的 影 响" 包 对 温 度 非 常 敏 感" 无 乳 链 球 菌 可 能 在27/9 Q 内 括 温 度& 渗 透 压&H+& 离 子 浓 度& 铁 的 含 量& 生 长 阶 相 应 酶 的 活 性 逐 渐 增 加"/0 Q 时 酶 活 性 最 高" 当 12 段 和 种 群 密 度 等 ’ 罗 非 鱼 无 乳 链 球 菌 是 一 种 条 温 度 继 续 升 高 到93 Q 时" 酶 的 活 性 受 到 抑 制" 生 件 致 病 菌" 当 水 温 高 于/3 Q 时" 该 病 容 易 暴 发 流 物 膜 的 形 成 也 受 到 抑 制’ 另 外" 病 原 菌 形 成 生 物 膜 有 利 于 其 内 部 的 细 菌 逃 避 抗 生 素 或 机 体 免 疫 系 行" 水 温 低 于23 Q 时 则 较 少 发 病’ 为 了 解 温 度 对 统 的 作 用" 造 成 机 体 持 续 性 感 染 或 免 疫 性 疾 无 乳 链 球 菌 毒 力 的 调 控 机 制" 本 实 验 研 究 了 不 同 培 10 病 " 所 以 病 原 菌 形 成 生 物 膜 的 能 力 与 其 毒 力 关 养 温 度 下 无 乳 链 球 菌 毒 力 相 关 参 数# 生 长& 粘 附& 入 侵& 产 毒 和 致 死 率$ 的 变 化’ 系 紧 密" 本 实 验 结 果 也 表 明 无 乳 链 球 菌 在/0 Q 时 实 验 结 果 表 明" 在 无 乳 链 球 菌 培 养 温 度 为 形 成 生 物 膜 能 力 最 强" 其 对 罗 非 鱼 致 死 率 也 最 高’ 2793 Q 时" 随 着 培 养 温 度 的 升 高" 无 乳 链 球 菌 病 原 菌 粘 附 于 宿 主 后" 在 机 体 内 进 行 增 殖& 转 的 生 长 速 度 随 之 加 快" 进 入 生 长 稳 定 期 的 时 间 明 移 并 侵 染 靶 器 官" 造 成 机 体 损 伤’ 罗 非 鱼 感 染 无 显 缩 短"93 Q 时 生 长 速 度 最 快" 但 其 达 到 稳 定 生 乳 链 球 菌 后" 典 型 症 状 之 一 是 鱼 在 水 面 呈 螺 旋 状 长 期 时 的 吸 光 值#"3 $ 要 低 于/0 Q 时 的 吸 光 游 动" 组 织 病 理 学 研 究 表 明 链 球 菌 可 侵 袭 鱼 类 脑 6337 值" 这 说 明/0 Q 是 无 乳 链 球 菌 的 最 适 生 长 温 度" 部 神 经 系 统" 这 可 能 是 造 成 病 鱼 失 去 平 衡 的 主 要 1851: 其 生 长 速 度 快" 且 具 最 大 的 生 物 量’ 微 生 物 的 最 原 因 ’ 本 实 验 通 过 平 板 菌 落 计 数 法 研 究 了 适 生 长 温 度 是 由 温 度 对 生 物 体 内 众 多 酶 反 应 的 综 不 同 温 度 培 养 的 无 乳 链 球 菌 腹 腔 注 射 罗 非 鱼 后 脑 合 作 用 决 定 的" 从 酶 促 反 应 动 力 学 来 看" 温 度 升 组 织 中 无 乳 链 球 菌 数 量" 结 果 表 明 罗 非 鱼 在 人 工 高" 反 应 速 率 加 快" 营 养 物 质 消 耗 和 生 长 代 谢 加 感 染 无 乳 链 球 菌 后 各 时 间 点" 鱼 体 脑 组 织 中 菌 量 快" 产 物 分 泌 提 前" 但 酶 本 身 也 很 容 易 因 热 而 丧 失 随 注 射 菌 体 培 养 温 度 的 增 加 呈 先 上 升 后 下 降 的 趋 活 性" 温 度 超 过 一 定 限 度" 部 分 酶 失 活" 菌 体 生 长 势" 且 与 不 同 温 度 培 养 的 无 乳 链 球 菌 感 染 后 罗 非 1/ 进 入 停 滞 状 态 ’ 鱼 的 死 亡 率 呈 正 相 关" 这 说 明 无 乳 链 球 菌 在 罗 非 病 原 菌 对 组 织 细 胞 或 粘 膜 的 表 面 粘 附 是 造 成 鱼 体 内 转 移 和 对 脑 组 织 的 入 侵 能 力 与 细 菌 培 养 温 19 机 体 感 染 的 首 要 步 骤 ’ 病 原 菌 可 以 通 过 可 逆 度 相 关" 且 其 转 移 和 入 侵 力 与 无 乳 链 球 菌 毒 力 成 6 的 非 特 异 性 聚 集 及 吸 附 和# 或$ 不 可 逆 的 受 体 5 正 相 关’ I@9L8J’9/@ 等 通 过 研 究 分 别 在/0 和 8 配 体 特 异 性 结 合 方 式 诱 导 在 宿 主 表 面 的 粘 附 ’ 93 Q 温 度 下 培 养 的 人 源 无 乳 链 球 菌 对 人 脐 静 脉 : 内 皮 细 胞#+#.,-J $ 的 粘 附 和 入 侵 能 力" 结 果 表 /IA8?@ 等 利 用 微 量 滴 定 法 评 价 不 同 温 度 和 渗 明 无 乳 链 球 菌 培 养 温 度 能 够 影 响 其 对 内 皮 细 胞 的 透 压 下 弧 菌 的 粘 附 能 力’ 该 方 法 是 通 过 细 菌 在 惰 : 粘 附 和 细 胞 内 存 活 能 力%/IA8?@ 等 用 高 温 和 性 基 质 上 形 成 生 物 膜 的 能 力 来 反 映 其 非 特 异 性 吸 高 渗 条 件 下 培 养 的 弧 菌 腹 腔 注 射 接 种 小 鼠 后" 利 附 能 力’ 当 处 于 应 激 状 态 时# 极 端 的 营 养 缺 乏 或 过 剩& 低H+ 值& 高 渗 透 压& 氧 化& 抗 菌 剂 和 抗 生 素 用 平 板 计 数 法 对 小 鼠 脾 脏 中 弧 菌 进 行 计 数" 结 果 等$" 细 菌 为 了 抵 抗 不 利 环 境" 通 过 自 身 合 成 的 水 发 现 温 度 和 渗 透 压 都 会 影 响 弧 菌 对 小 鼠 脾 脏 细 胞 合 多 聚 物 粘 附 在 固 体 表 面" 继 续 生 长 形 成 生 物 膜" 的 入 侵 能 力" 入 侵 能 力 与 其 对 宿 主 的 致 死 率 成 正 这 是 细 菌 所 具 有 的 一 种 非 常 重 要 的 环 境 适 应 机 相 关" 本 实 验 研 究 结 果 与 这 些 研 究 结 果 类 似’ 17 制 ’ 本 实 验 结 果 表 明 在27/9 Q 内 无 乳 链 球 研 究 表 明" 大 多 病 原 菌 毒 力 基 因 的 表 达 受 到 温 12 菌 粘 附 在 惰 性 基 质 上 的 菌 体 对 应 的 吸 光 值 度 的 调 节’ B/F@0 等 发 现 温 度 对 志 贺 氏 杆 菌 毒 #"3 $ 之 间 无 显 著 差 异#!C3137$"/0 Q 时 显 力 基 因 表 达 的 激 活 非 常 重 要" 志 贺 氏 杆 菌 毒 力 基 因 7:37 著 增 加"93 Q 时 又 急 剧 下 降’ 这 可 能 是 由 于 无 乳 在/0 Q 下 被 激 活 表 达" 而 在 /3 Q 下 被 抑 制’ 23 链 球 菌 在 培 养 过 程 中 大 量 增 殖" 培 养 基 中 营 养 缺 B8I9HL8J 等 研 究 了 不 同 温 度 对 气 单 胞 菌 的 毒 力 乏" 为 了 适 应 环 境 的 变 化" 细 菌 在 惰 性 基 质 上 形 成 因 子 的 影 响" 结 果 表 明 虽 然 所 有 分 离 株 都 能 在9&27 生 物 膜’ 细 菌 从 游 离 状 态 到 聚 集 形 成 成 熟 的 生 物 和/0Q 下 产 生 溶 血 素& 蛋 白 酶& 酯 酶 和 核 酸 酶" 但 膜 过 程 中" 也 牵 涉 到 复 杂 的 调 控 机 制" 主 要 是 由 环 在/0 和 27 Q 培 养 条 件 下 要 比 9 Q 时 快’ !""#!!$$$%&’*+,-%’.11 期 刘 志 刚" 等!" 温 度 对 尼 罗 罗 非 鱼 无 乳 链 球 菌 毒 力 的 影 响 140/4 : 7 2: P@I@:@LL9 等 通 过 比 较/3 和93Q 培 养 条 件 下 无 白" 在 所 有 已 知 血 清 型 的 DE*中 都 有 表 达 ’ 乳 链 球 菌 的 全 基 因 转 录 组 发 现" 处 于 生 长 稳 定 期 的 *?HE 可 以 阻 止 补 体-78 与 中 性 粒 细 胞 结 合" 抑 制 /3 炎 症 反 应 时 调 理 吞 噬 细 胞 的 化 学 攻 击 作 用 ’ 无 乳 链 球 菌 中 大 量 的 新 陈 代 谢 相 关 基 因 在/3 Q 时 *?HE 还 可 与 纤 连 蛋 白 结 合" 加 速 DE* 对 上 皮 细 上 调 表 达" 而 编 码 毒 力 的 相 关 基 因 在93 Q 时 上 调 /1 胞 的 侵 袭" 是 重 要 的 毒 力 因 子 和 保 护 性 抗 原 ’ 表 达’ 无 乳 链 球 菌 的 毒 力 相 关 基 因 较 多" 目 前 研 究 但 是 本 实 验 结 果 表 明 在 无 乳 链 球 菌 对 罗 非 鱼 致 死 表 明 大 量 表 面 蛋 白 参 与 粘 附& 入 侵& 逃 避 宿 主 免 疫 率 最 强 时#/0 Q$"&/$E 基 因 的 表 达 量 反 而 最 低" 和 致 病 性" 包 括&0H 家 族& 蛋 白 质&*?HE&’7M 蛋21 致 死 率 较 低 时#27 Q$ 表 达 量 反 而 较 高’ 有 研 究 白&-&P5 因 子&MJ&&*9H 蛋 白 和+0C 等 ’ 本 实 表 明 在 一 些 无 乳 链 球 菌 强 毒 株 中*?HE 没 有 活 性 验 对 不 同 培 养 温 度 下#2793 Q$ 处 于 生 长 对 数 期 或 具 有 较 弱 活 性" 并 推 断 *?HE 在 粘 附 和 促 进 细 的 无 乳 链 球 菌 的9 个 毒 力 相 关 基 因07B &/6;&&1$ 以 /2 菌 入 侵 上 的 功 能 要 比 其 酶 活 性 更 为 重 要 " 这 可 及&/$N 的 表 达 水 平 进 行 了 研 究’ 能 是 无 乳 链 球 菌 毒 力 较 强 时"*?HE 表 达 量 反 而 较 溶 血 素#@7/0CJ9$ 由07B 基 因 编 码" 是 无 乳 // 低 的 原 因 之 一’ N87I8 等 在 研 究 DE* 中 链 球 菌 重 要 的 毒 力 因 子 之 一’ 溶 血 素 以 低 聚 物 形 7*U 基 因 功 能 时 发 现*?HE 的 表 达 可 能 是 通 过 细 式 结 合 在 细 胞 膜 上" 形 成 孔 道 造 成 其 结 构 和 功 能 胞 质 中 谷 氨 酰 胺 水 平 进 行 调 节" 且 这 种 调 节 是 转 的 紊 乱" 使 大 量 细 胞 内 成 分 泄 漏" 导 致 细 胞 死 22 录 后 水 平 的’ 这 种 转 录 后