第14章 基因重组与基因工程

null第十四章 基因重组和基因工程第十四章 基因重组和基因工程Genetic Recombination and Genetic EngineeringThe Department of Biochemistry and Molecular Biology, CMU重组DNA技术的发展史重组DNA技术的发展史1973年，美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子； 1977年，美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物； 1980年，开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂； 1997年，英国罗林研究所成功的克隆了多莉。相关概念相关概念克隆(clone)：来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。 技术水平：分子克隆(molecular clone) 即DNA 克隆 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）DNA克隆DNA克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA)。基因工程(genetic engineering)基因工程(genetic engineering)基因工程：实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。 目的 ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的达产物（蛋白质） 生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等第一节 自然界的DNA重组第一节 自然界的DNA重组DNA Recombination in Naturenull自然界的基因转移和重组是基因变异和物种进化的基础。也在繁殖、病毒感染、基因表达以及癌基因激活等过程中起重要的作用。 人们正是对自然界基因转移和重组的认识，才发展起DNA重组技术。DNA重组DNA重组同源重组 (homologous recombination) 接合作用 (conjugation) 转化作用 (transformation) 转导作用 (transduction) 位点特异的重组(site-specific recombination) 转 座 (transposition) 一、同源重组一、同源重组发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。 以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型。Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤 Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤 ①两个同源染色体DNA排列整齐 ②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体 ③通过分支移动产生异源双链DNA ④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：null 内切酶 (recBCD)分支迁移 (recA)Holiday中间体null5´3´5´3´5´3´5´3´null5´3´5´5´5´3´3´3´片段重组体拼接重组体null片段重组体 （见模型图右边产物）： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。 拼接重组体（见模型图左边产物）：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。二、细菌的基因转移与重组二、细菌的基因转移与重组（一）接合作用 当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用(conjugation) 质粒 —— 细菌染色体外的小型环状双链DNA分子质粒 —— 细菌染色体外的小型环状双链DNA分子可接合质粒如 F 因子(F factor)（二）转化和转导作用（二）转化和转导作用通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用 (transformation) 当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction) nullnullλ噬菌体的生活史溶菌生长途径 (lysis pathway) 溶源菌生长途径 (lysogenic pathway)三、位点特异重组三、位点特异重组位点特异重组(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。null沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变null免疫球蛋白基因重排过程重组信号序列基因片段四、转座重组四、转座重组大多数基因在基因组内的位置是固定的，但有些基因可以从一个位置移动到另一位置。这些可移动的 DNA序列包括插入序列和转座子。 由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座(transposition)。null插入序列(insertion sequences, IS)组成： 二个分离的反向重复(inverted repeats, IR)序列 特有的正向重复序列 一个转座酶（transposase)编码基因 发生形式： 保守性转座(conservative transposition) 复制性转座(duplicative transposition)（一）插入序列转座null插入序列的复制性转座（二）转座子转座（二）转座子转座转座子(transposons) ——可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。 转座子组成：反向重复序列 转座酶编码基因 抗生素抗性等有用的基因 nullnull由转座子介导的转座第二节 重组DNA技术第二节 重组DNA技术DNA Recombination Technique体外重组DNA技术的主要难题体外重组DNA技术的主要难题1. 如何获得目的基因? 2. 如何把目的基因转入受体细胞? 一、工具酶一、工具酶限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ（Klenow 片段） 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。限制性核酸内切酶的发现限制性核酸内切酶的发现Werner Arber 发现细菌体内的一些酶可以限制噬菌体DNA的复制； 1970年，Hamilton Smith分离纯化了第一个限制性核酸内切酶 Hind Ⅰ； 1971年，Daniel Nathans首次应用限制性核酸内切酶实现了对 SV40 DNA的切割； 三人分享了1978的Nobel 奖。命名命名Haemophilus influenzae d株：流感嗜血杆菌d株的第三种酶。 第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。Hin dⅢ细菌的限制修饰系统细菌的限制修饰系统null限制性核酸内切酶分类限制性核酸内切酶分类根据酶的结构，所需辅助因子及裂解DNA的方式不同，可将限制性核酸内切酶分为三类： Ⅰ类酶、Ⅱ类酶、Ⅲ类酶。三种限制性核酸内切酶的性质三种限制性核酸内切酶的性质Ⅰ类酶由三种不同的亚基组成，识别部位复杂，特异性差，通常在识别部位周围400～7000bp范围内切割DNA。 Ⅱ类酶由一种亚基构成，DNA切割就发生在特异识别部位范围内。Ⅱ类酶切割DNA的特异性强，被分子生物学家广泛研究，通常所指的限制性内切酶，即指此类酶而言。 Ⅲ类酶由二种亚基组成，DNA切割发生在识别部位周围25～27bp范围内。Ⅱ类限制性核酸内切酶的特点Ⅱ类限制性核酸内切酶的特点识别序列特点：回文结构(palindrome) 识别序列的长度：4～8bp 切割：识别序列内部进行切割，可产生两种不同的切口——平端切口、粘端切口 nullBam HⅠ+HindⅡ+平末端粘末端null5´-端突出的粘性末端3´-端突出的粘性末端null同功异源酶：来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。 +Bam HⅠ+BstⅠnull同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。Bam HⅠBglⅡ++二、载体（Vector）二、载体（Vector）为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA 1. 质粒 (plasmid)1. 质粒 (plasmid)独立于细菌染色体之外的小型环状双链 DNA。 特点： 能在宿主细胞内独立自主复制； 带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。 2. 噬菌体(phage)2. 噬菌体(phage)λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆） M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因） M13mp系列 pUC系列 3. 粘性质粒(cosmid)3. 粘性质粒(cosmid)人工构建的噬菌体DNA与细菌质粒的杂合体； 带有噬菌体的cos位点，能将DNA包装进入噬菌体的衣壳蛋白中； 含有选择性标记基因和一个质粒复制起点； 粘粒缺乏全部基因，不会产生噬菌斑，而是在选择性培养基上形成菌落； 粘粒可以容纳高达40kb的DNA片断；null4.其他4.其他酵母人工染色体(yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）重组DNA技术的步骤重组DNA技术的步骤（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取这些感兴趣的基因或DNA序列就是目的基因，又称目的DNA（target DNA）。 目的基因来源： 化学合成法 基因组DNA文库(genomic DNA library) cDNA文库(cDNA library) 聚合酶链反应（PCR）法1、化学合成法获取目的基因1、化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。 一般用于小分子活性多肽基因的合成。2、从基因组DNA文库获取目的基因2、从基因组DNA文库获取目的基因基因组DNA文库：存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。null3、从cDNA文库获取目的基因 3、从cDNA文库获取目的基因 cDNA (complementary DNA)：经反转录合成的、与mRNA互补的单链DNA，以单链cDNA为模板、经聚合反应可合成双链cDNA。 cDNA文库：用细胞总mRNA制备全套双链cDNA后，建立的基因文库。简称c-文库。 null4、PCR4、PCR聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction）简称PCR，是根据DNA复制的原理，在体外利用酶促反应大量获得特异序列的基因组DNA或cDNA的专门技术。PCR体系基本组成成分PCR体系基本组成成分模板DNA(目的DNA) 特异性引物(一对) 耐热DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶） dNTPs 含有Mg2+的缓冲液 nullPCR的基本反应步骤变性 95˚C延伸 72˚C退火 Tm-5˚CPCR的基本反应步骤PCR的基本反应步骤1.变性：将反应系统加热至95℃ ，使模板DNA 完全变性成为单链； 2.退火：将温度下降至50℃左右，使引物与模板DNA退火结合； 3.延伸：将温度升至72℃ ，DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合成反应。 上述三个步骤为一个循环，经25～30次循环后，可将模板DNA扩增达百万倍。nullPCR的主要用途PCR的主要用途目的基因的克隆 基因的体外突变 DNA和RNA的微量分析 DNA序列测定 基因突变分析 几种重要的PCR衍生技术几种重要的PCR衍生技术反转录PCR技术（RT-PCR) 原位PCR技术 实时PCR技术（二）克隆载体的选择和构建（二）克隆载体的选择和构建克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。 载体的选择标准载体的选择标准能自主复制，外源DNA的插入不影响载体的复制功能； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA； 应有高的拷贝数。（三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接连接是利用DNA连接酶把目的基因与载体共价连接成一个完整的重组体分子。 DNA连接酶有两种： 一种是T4 DNA连接酶，是从噬菌体T4感染的大肠杆菌中分离纯化获得的； 另一种是大肠杆菌DNA连接酶，是直接从大肠杆菌中分离纯化的连接酶。 1、粘性末端连接1、粘性末端连接方式： (1)同一限制酶切位点连接。 (2)不同限制酶切位点连接。 配伍末端连接 非配伍末端连接nullBam HⅠ切割反应T4 DNA连接酶 15ºC同一限制酶切位点连接null不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接Eco RⅠ切割位点Bg lⅡ切割位点配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。2、平端直接连接2、平端直接连接适用于： 限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端null3、同聚物加尾连接3、同聚物加尾连接在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。null载体DNA目的基因限制酶或机械剪切限制酶 5´ 3´ 3´ 5´ 5´ 3´ T(T)nT T(T)nT 3´ 5´ 5´ 3´ 3´ 5´ 5´ 3´ A(A)nA A(A)nA 3´ 5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶 + dATP末端转移酶 + dTTP4、人工接头(linker)连接4、人工接头(linker)连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。null人工接头及其应用（四）重组DNA导入宿主细胞（四）重组DNA导入宿主细胞受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent)导入方式导入方式转化(transformation)：将质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。 感染 (infection) ：是利用噬菌体或病毒将外源DNA导入宿主细胞的方法。 转染(transfection) ：是将外源DNA导入真核细胞的方法。（五）重组体的筛选（五）重组体的筛选1. 直接选择法 (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹 2. 免疫学方法：利用特异抗体与目的基因表达 产物相互作用进行筛选。 如免疫化学方法及酶免检测分析等（1）抗药性标记选择(插入失活法)（1）抗药性标记选择(插入失活法)如果重组质粒携带有某种抗药性标志基因，如ampr，tetr或kanr，只含这种抗药性基因的转化菌可在含有该抗生素的培养板上生长并形成菌落，即可筛选出阳性转化菌。 相反如将外源基因插入抗药性标志基因中，使标志基因失活，转化菌将失去抗药表型，只能在无该抗生素的培养基中生存。 null（2）标志补救（marker rescue）（2）标志补救（marker rescue）转化或转染的外源基因表达产物可弥补基因缺陷型宿主菌的性状，可以利用营养突变菌株进行筛选，即标志补救。 null组氨酸缺陷 型大肠杆菌无组氨酸 的培养基酵母咪唑甘油磷 酸脱水酶基因促进组氨酸合成λDNA重组体标志补救 若目的基因能够在宿主菌表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补，就可利用营养突变菌株进行筛选。null α 互补的检测 （3）分子杂交法（3）分子杂交法利用32P标记的探针与转移至硝酸纤维素膜上的转化子DNA或克隆的DNA片段进行分子杂交，直接选择并鉴定目的基因。 null原位杂交null鸡的β肌球蛋白的克隆和检出（六）克隆基因的表达（六）克隆基因的表达表达体系的建立 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化 表达载体pFASTBACI 的物理图谱表达载体pFASTBACI 的物理图谱1、原核表达体系 （E.coli表达体系最为常用）1、原核表达体系 （E.coli表达体系最为常用）标准： 选择标志 强启动子 翻译调控序列 多接头克隆位点 E.coli表达体系的不足E.coli表达体系的不足不宜表达真核基因组DNA 不能加工表达的真核蛋白质 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion body) 很难表达大量可溶性蛋白 2、真核表达体系（酵母、昆虫、哺乳类动物细胞）2、真核表达体系（酵母、昆虫、哺乳类动物细胞）优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累 缺点：操作技术难、费时、不经济 转染 —— 将表达载体导入真核细胞的过程 方法：磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔 脂质体转染 显微注射 重组DNA技术操作过程可形象归纳为重组DNA技术操作过程可形象归纳为null第三节 重组技术与医学的关系第三节 重组技术与医学的关系Recombination Technique with Medicine主要应用领域主要应用领域（一）疾病基因的发现与克隆 （二）生物制药 （三）基因诊断&基因治疗 （四）遗传疾病的预防null 重组DNA医药产品null基因诊断(genetic diagnosis)是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。 基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。基因诊断的基本过程基因诊断的基本过程区分或鉴定DNA的异常分离、扩增待测的DNA片断基因诊断方法的标准基因诊断方法的标准能正确扩增靶基因； 能准确区分单个碱基的差别； 本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定; 便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。 基因治疗的方式基因治疗的方式体细胞基因治疗 (somatic cell gene therapy) 性细胞基因治疗 (germ line gene therapy)第四节 分子杂交与印迹技术第四节 分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization & Blotting Technology分子杂交与印迹技术的原理分子杂交与印迹技术的原理核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) ：在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。 null复性RNADNA探针 (probe)探针 (probe)一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。印迹技术的类别及应用印迹技术的类别及应用（一）DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。 （二）RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。 （三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。null三种印迹技术的比较null放射自显影照片核 酸 序 列 分 析核 酸 序 列 分 析Nucleic Acid Sequence Analysis核酸序列分析的基本方法核酸序列分析的基本方法化学裂解法 (Maxam-Gillbert法) DNA链的末端合成终止法 (sanger法) 化学裂解法化学裂解法基于某些化学试剂可以使DNA链在1个或2个碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的DNA片段，将这些片段经电泳分离。 分析前，用同位素标记DNA的5´末端，经放射自显影即可在X胶片上读出DNA链的序列。 DNA链末端合成终止法DNA链末端合成终止法nullDNA自动测序DNA自动测序采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。 nullDNA自动测序结果举例本章重点本章重点1. 概念：克隆、转化、转染、感染、基因工程、转座、限制性核酸内切酶、载体、基因组文库、质粒、cDNA、PCR 2. 简述基因工程的基本过程。 3. 简述目的基因的主要来源或途径。 4. 载体的选择标准。 5. PCR的反应步骤。