光合细菌产类胡萝卜素的条件研究与制备

光合细菌产类胡萝卜素的条件研究与制备* 郭 � 丹, 孙藜玮 (烟台职业学院, 山东 � 烟台 � 264670) 摘 � 要:光合细菌( Photosynthet ic bacteria)是生产类胡萝卜素的主要微生物, 因其生产周期短, 不受 季节限制, 而且菌体含有丰富的蛋白质, 色素提取后的残留物可用作饵料、饲料等而备受科学工作者的重 视。为了便于光合细菌中类胡萝卜素的大规模开发和利用, 本文将对光合细菌的生长条件及所得类胡萝 卜素制品的性质进行研究。 关键词:光合细菌;类胡萝卜素;条件研究;制备 中图分类号: Q945. 11 � � � 文献标识码: A � � � 文章编号: 1671- 4288( 2011) 02- 0089- 04 0 � 引言 类胡萝卜素是一类具有特殊功能的天然色素的总称,广泛存在于自然界的动物、植物、真菌、藻类和细 菌中。类胡萝卜素的抗氧化作用, 远远高于维生素 E和维生素 C, 成为受国际药物、膳食补充剂、功能食品 界等广泛关注的新型抗氧化活性物质, 被誉为 21世纪抗氧化剂时代的�新贵�[ 1] 。 目前提取类胡萝卜素的途径很多, 其中最常用的有两种: 一是用培养盐藻来提取类胡萝卜素, 这种方 法需要在高盐份的海域环境, 所以只能在少数地区养殖,生产的局限性很大,不宜大范围推广; 二是用微生 物发酵法生产类胡萝卜素,目前能够发酵产生类胡萝卜素的微生物主要有真菌、细菌和酵母菌等[ 2- 3]。 光合细菌( Photosynthet ic bacteria)是生产类胡萝卜素的主要微生物,因其生产周期短, 不受季节限 制,而且菌体含有丰富的蛋白质,色素提取后的残留物可用作饵料、饲料等而备受科学工作者的重视。为 了便于光合细菌中类胡萝卜素的大规模开发和利用,本文将对光合细菌的生长条件及所得类胡萝卜素制 品的性质进行研究[ 4- 5] 。 1 � 培养基的配制[ 6] 1. 1 � RCVBN培养基(固体/液体) : � 无机盐溶液 � � � � � � � � � � � 10% � 微量元素溶液 � � � � � � � � � � 0. 1% � 生长因子溶液 � � � � � � � � � � 0. 1% � 20% DL- 苹果酸溶液 � � � � � � 2% � 20% ( NH 4 ) 2SO 4 溶液 � � � � � � 0. 5% � 磷酸缓冲液 � � � � � � � � � � � 1. 5% � pH � � � � � � � � � � � � � � 6. 8 � 121 � 灭菌 � � � � � � � � � � � 20分钟 ( 1)无机盐溶液( 1000ml) � MgSO 4 � 7H2O � � � � � � � � � 2. 0g � CaCl2 � 2H 2O � � � � � � � � � � �0. 75g � FeSO 4 � 7H 2O � � � � � � � � � 0. 12g �89� 第 11 卷第 2 期 � � � � � � � � � � � � � � � � 潍坊学院学报 � � � � � � � � � � � � � � � � � � Vol. 11 No. 2 2011 年 4 月 � � � � � � � � � � � � � � Journal o f Weifang University � � � � � � � � � � � � � � � � Apr. 2011 * 收稿日期: 2010- 11- 20 作者简介:郭丹( 1981- ) , 女,吉林双辽人, 烟台职业学院食品与生化工程系助教。 � EDT A � � � � � � � � � � � � � 0. 2g � pH � � � � � � � � � � � � � � 6. 8 ( 2)微量元素溶液( 250m l) � H 3BO3 � � � � � � � � � � � � 0. 7g � MnSO 4 � H2O � � � � � � � � � 0. 398g � NaM oO4 � � � � � � � � � � � � 0. 188g � ZnSO4 � 7H 2O � � � � � � � � � 0. 06g � Ca( NO 3 ) 2 � 3H 2O � � � � � � � � 0. 01g � pH � � � � � � � � � � � � � � � 6. 8 ( 3)磷酸缓冲液( 1000 m l) � KH 2PO4 � � � � � � � � � � � � 40g ; � K 2HPO4 � � � � � � � � � � � � 60g。 ( 4)生长因子溶液( 100m l) � 生物素 � � � � � � � � � � � � � 1. 5mg; � 盐酸硫胺素 � � � � � � � � � � � 100mg; � 尼克酸 � � � � � � � � � � � � � 100mg; � 对氨基苯甲酸 � � � � � � � � � � 100mg; � pH � � � � � � � � � � � � � � 6. 8。 ( 5) 20% DL- 苹果酸溶液( 100ml) � 20g DL- 苹果酸, 用约 1/ 3体积 12N NaOH 调至 pH 值 6. 8。 ( 6) 20% ( NH 4 ) 2 SO4 溶液( 100ml) � 20g 的( NH 4 ) 2SO4 溶液以 12N N aOH 调至 pH 值 6. 8。 1. 2 � 乙酸钠乙酸铵培养基 无机盐溶液 10% ,微量元素溶液 0. 1%, 生长因子溶液 0. 1%, 磷酸缓冲液 1. 5% (以上溶液的配制同 RCVBN 培养基) ,乙酸钠 1g ,乙酸铵 1g, 蒸馏水 1L, pH = 6. 8, 121 � 灭菌 20min。 1. 3 � 乙酸盐培养基 乙酸钠 2g, KH 2 PO 4 0. 5g , K 2H PO 4 0. 5g, MgSO4 � 7H 2O 0. 2g , CaCl2 0. 14g , NH 4Cl 0. 8g, NaCl 0� 1g ,酵母膏 0. 5g,水 1L, pH= 7. 0, 121 � 灭菌 20m in。 1. 4 � YP 培养基 蛋白胨 10g ,酵母膏 5g, NaCl 5g , pH= 6. 8, 121 � 灭菌 20m in。 2 � 菌种培养 2. 1 � 菌种活化 取冰箱冷藏菌种在 YP 培养基平板上划线, 25- 28 � , 800lx 白炽灯光照培养 48小时。 2. 2 � 分离纯化 在 YP 培养基平板上去红色单菌落重新划线,直至得到纯培养。 2. 3 � 液体种子培养 用 RCVBN 培养基洗下斜面上的菌苔, 液体培养 3天。 2. 4 � 液体扩大培养 按 10%接种量扩大培养,比较 RCVBN、RCVBN- 乙酸钠、乙酸盐培养基三种培养基的培养效果。 3 � 光合细菌培养条件的选择 ( 1)菌种于 30�E/ m2 � s光照条件下静置培养,接种量分别为 10%和 25% ,定时测定培养液在 660nm 和 485nm 处的 OD值,以 OD660来示培养液中细菌的生物量,以 OD485来表示其中类胡萝卜素的相对含 �90� 潍坊学院学报 � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � 2011 年 4 月 量,描绘细菌的生长曲线。 ( 2)菌种于 30�E/ m2 � s光照条件下分别进行静置培养和摇瓶培养,检测其生长状况。 ( 3)菌种分别在 6, 16, 30, 40, 60�E/ m2 � s光照条件下静置培养, 于 24h和 48h 时测定菌液的光吸收 值,分析光照对细菌生长的影响。 4 � 色素的提取 4. 1 � 收集菌体 6000rpm 离心收集培养好的红褐色菌液 15min, 弃去上清液, 用生理盐水洗涤 2 � 3次, 得到深红色菌 体。 4. 2 � 抽提色素 ( 1)丙酮:甲醇抽提法 [ 7] 将菌体用丙酮: 甲醇(体积比 7: 2)悬浮,并加入相当于 10%甲醇量的 KOH, 悬浮液总量约 20ml/ 1. 5g 菌体,加入索氏提取器进行减压加热( 60 � 水浴) , 回馏 2h以上。 加入少量无水硫酸钠振荡, - 20 � 静置后,取出上清液, 7000 � 8000rpm 离心去除菌体和蛋白质, 减压 蒸馏,得到色素粗制品粉末, - 20 � 过夜。 将粗制品溶于少量石油醚中, 加入等体积的甲醇, 室温下放置 1 � 2h, 去除下层甲醇后, 上层用 5% NaCl溶液洗涤 3次,于 40 � 下减压抽干石油醚,即得类胡萝卜素精制品。 ( 2)石油醚:甲醇抽提法 用石油醚:甲醇(体积比 2: 1)悬浮菌体, 加10%甲醇量的KOH, 20 ml悬浮液/ 1. 5 g 菌体, 加入索氏抽 提器加热回馏 2 � 3h,蒸出大量石油醚和少量甲醇,直到回馏明显减弱为止。 加入少量无水硫酸钠于抽提液中, - 20 � 放置后,观察到抽提液分两层,上层墨绿,下层浅绿为菌体、 蛋白质和甲醇抽提液。 加石油醚于抽提液中,振荡充分,静置使其分层;若分层不明显,可依次加入甲醇和水, 振荡后静置分 层。取出上层石油醚,将下层溶液再用石油醚抽提,重复 2 � 3次, 直至石油醚层颜色基本消失,将石油醚 溶液依次用甲醇和水洗涤 2 � 3次。最后,减压抽干石油醚,即得产品。 5 � 结果分析与讨论 5. 1 � 培养条件对菌种生长和色素形成的影响 ( 1)由图 1, 2, 3可以看出,菌种延缓期长短与接种量有很大的影响,二者成反比,而微好氧的摇瓶培养 可缩短延迟期, 使菌体很快繁殖,达到稳定期,因为在有氧条件下, 菌体可进行 T CA 循环,代谢较快, 一般 摇床培养 28小时即可,而静置培养须 40小时以上。由于类胡萝卜素的生成随光照强度增加而降低, 因此 光照不宜过强, 且菌体在光照 3000lx 下产量并不具有优势,只是在光照强度提高时,有助于菌体迅速达到 稳定期,因此光照以 1500lx 左右为佳。 图 1� 光合细菌的生长曲线及类胡萝卜素的产生 � � � � � 图 2 � 光照对细菌生长的影响 � � � � �91� 第 2 期 � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � 郭丹,孙藜玮: 光合细菌产类胡萝卜素的条件研究与制备 图 3� 静置培养与摇瓶培养的比较 ( 2)由三种培养基:乙酸盐培养基、RCVBN 培养基、乙酸钠乙酸铵培养基比较可见,在乙酸钠乙酸铵 和 RCVBN 培养基中菌体生长旺盛,乙酸盐培养基中菌体含量很少, 但很容易收集; RCVBN 培养基中由 于缺乏乙酸盐或丙酸盐等抑制杂菌生长的成分,培养基中有大量白色杂菌形成的菌团悬浮,表面有白色菌 膜,易于污染杂菌;并且 RCVBN培养液离心时的菌体沉淀效果远不如乙酸盐和乙酸铵培养基,前者离心 时转速以 8000 � 10000 r pm 效果为佳,而后二者在转速 4000 rpm 时菌体沉淀的效果就较为彻底; 再者, RCVBN 培养基中以苹果酸为碳源, 苹果酸价格昂贵,不宜于大规模使用。 光合细菌体积小,收集菌体过程中的动力消耗很大,而某些可以自然沉降的菌株又不能充分利用培养 基,繁殖缓慢,菌体含量少。因此,便于收集菌体的价格低廉的培养基对于简化生产工艺,降低生产成本, 大规模生产类胡萝卜素具有重要意义。 ( 3)使用乙酸钠乙酸铵培养基培养菌株时, 4000 rpm 离心 15分钟后, 用两种不同的色素抽提方法提 取类胡萝卜素。 5. 2 � 色素提取的结果分析 ( 1)菌体用丙酮:甲醇提取时, 二者均可破坏细胞膜,使细胞破裂,而丙酮对类胡萝卜素的抽提有利,甲 醇有利于叶绿素的提取; 抽提后加入无水硫酸钠可以出去抽提物中的蛋白质等极性物质; 10% 的甲醇量 的 KOH 是起皂化作用,除去油脂类;最后用甲醇洗去石油醚中的残余叶绿素,加入可促进石油醚和甲醇 分层。 ( 2)类胡萝卜素的经典抽提方法多采用丙酮: 甲醇抽提,与石油醚:甲醇抽提法相比, 有以下问题: A.由于石油醚和甲醇不相溶,抽提后可以直接将二者进行分离,不须像丙酮那样,抽提时需要蒸干抽 提液,大大简化了操作程序。 B.石油醚沸点低于丙酮,抽提方便,减压抽干时也迅速,抽提温度、时间与丙酮:甲醇抽提法相比, 对色 素的破坏也较轻。 C. 石油醚不溶于水,可以轻易除去色素的石油醚溶液中的水分,易于抽提和减压蒸馏, 而丙酮则溶于 水,抽提前需要先干燥菌体,否则将会因所含有的水分难以抽干。 D.在使用石油醚抽提法时应注意: 由于石油醚不能使细胞变性、破碎,因此最好加大甲醇的用量。 ( 3)最终得到的色素石油醚溶液中,如果漂浮有白色絮状蛋白质等杂物,可用水洗涤除去, 而溶液中的 少量水珠需仔细除净,以免影响减压抽干。 ( 4)石油醚: 甲醇抽提法所得类胡萝卜素产量可达 170mg/ L 培养液, 而丙酮: 甲醇抽提法只有 71� 2mg/ L 培养液。 6 � 结论 ( 1)对光合细菌的培养条件进行研究后, 发现适当增加菌种的接种量和光照强度、以及好氧培养, 均会 提高光合细菌的生长速度。 (下转第 158页) �92� 潍坊学院学报 � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � 2011 年 4 月 外,教师应尽量多提供几个选题,可以让学生借此机会发现自己兴趣所在,自主选择方向。目前我校工程 结构课程设计选题为�单向板肋梁楼盖设计�和�单层厂房设计�二选一,题目比较常规, 今后可以结合专业 特点研究更加适合的题目。 在课程设计环节,不建议教师过多参与其中, 教师提供必要的引导之外,重点锻炼学生自己发现问题、 解决问题的能力。要求学生自己收集资料、参阅, 独立动手,再结合团队协作, 最终完成设计任务。课 程设计结束之后,学生应该对整个学期该课程的学习有更深入的、系统的、完整的认识。 3 � 结束语 工程管理专业有自身的特殊性,工程结构课程综合性、实践性强,在教学过程中,要结合专业特点对课 程作进一步的探索和研究,以求达到以学生为本,将课堂的主动权还给学生, 真正使教师成为传道授业的 引导者,提高教学效率。让学生在课堂上所学的内容能够成为他们走上社会以后成功的资本。 � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � 参考文献: [ 1]黎生南. 工程管理专业� 工程结构�课程的教学探索[ J] . 甘肃科技, 2009, 25( 2) : 163- 165, 80. [ 2]袁启旺. 工程管理专业建筑结构课程教学改革实践[ J] .陕西教育: 高教版, 2009, ( 9) : 73. [ 3]徐伟,王瑄,胡志华, 等.提高�工程结构�课程教学效果的几点措施[ J] .科技信息, 2008, ( 30) : 548, 579. [ 4]袁锦根. 工程结构[ � ] . 2 版.上海: 同济大学出版社, 2009. (责任编辑:肖恩忠) (上接第 92页) ( 2)采用石油醚- 甲醇抽提法对菌体中的类胡萝卜素进行提取, 最终获得的类胡萝卜素产量为 170mg/ L 培养液,菌体湿重为 7. 5g / L 培养液;而丙酮: 甲醇抽提法只有 71. 2mg/ L 培养液。 � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � 参考文献: [ 1]尤新.类胡萝卜素功能和国际发展动向[ J] . 中国食品质量报, 2009, 18( 10) : 62- 24. [ 2]沈国鹏, 徐贵敏,刘芳. 脂溶性类胡萝卜素的提取及其稳定性研究[ J] .河南农业科学, 2003, ( 8) : 21- 23. [ 3]曾宇,秦松,梁明山. 光合细菌综合应用新进展[ J] . 水产科学, 2000, 19( 5) : 34- 36. [ 4]杨丽飞, 邓宇.光合细菌在色素提取中的应用[ J] .中国食品添加剂, 2003, ( 6) : 93- 95. [ 5]刘扬,钱新民,高培基. 应用均匀设计方法改进光合细菌类胡萝卜素生产[ J] .山东大学学报, 2004, 24( 1) : 65- 68. [ 6]陈德明. 光合细菌产类胡萝卜素条件优化及其稳定性研究[ D ] . 南京:南京农业大学, 2007. [ 7]李勤生, 王若雪.光合细菌 H - 3 菌株色素分析[ J] .水产生物学报, 2003, 4( 4) : 44- 46. (责任编辑:刘乃生) �158� 潍坊学院学报 � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � 2011 年 4 月