细胞凋亡

细胞凋亡 细胞凋亡 管吉松 南京大学生化系 97131007 摘要 :     死亡对于细胞来说分为两种形式,即损伤性死亡与程序化死亡(细胞凋亡apoptosis).对细胞凋亡的研究具有重要的价值,它涉及到癌症的治疗,组织的分化,甚至生命的延长.本文系统地介绍了近来对细胞凋亡的研究与这方面最新的进展. 细胞凋亡的特征     细胞凋亡与一般的死亡有很大的不同,现在两方面:     形态学特征: 细胞凋往事细胞在生物体发育中,在一定诱导条件下接受指令而发生的程序化事件. 是导致最终自我消亡的生命活动. 发生时首先是染色质的凝集, 嗜碱性染色增强, 然后细胞核崩解此时线粒体保持形态正常. 最后细胞体积缩小,一部分细胞质和核碎片进入由膜包被的程序死亡小体,他们从细胞表面出芽脱落,并被巨噬细胞.上皮细胞吞噬.     生化特征: 染色质降解, 核小体间连接DNA部位被降解,产生寡聚核小体DNA片段,即180-200DP 整数倍的不同长度的DNA片断. 细胞凋亡的化学信号     钙: 在细胞程序死亡时出现快速持续的Ca2+浓度上升. 如在胞质钙离子载体 tributyrin 和 抗-CD3抗体诱导的胸腺细胞凋亡中就发现有钙离子浓度升高的现象.研究发现Ca(2+)增加与ATP一起作用于染色质,使原来折叠的很紧的染色质变松散,露出亲水部分,以便Dnase 水解.Danson(1993)发现Ca 可以参与Ca-calmokulin dependent phospatase 作用,产生凋亡.Wornonicz 提出Ca 可以直接作用于核内转录因子,引起凋亡. 细胞凋亡的基因调控     基因是生物体活动的总指挥,调控细胞的生长与凋亡,细胞凋亡也离不开基因的作用.包括了　TRPM-2,CED,BCL,ICE,c-myc,p-53,等.他们相互牵制,相互影响,共同影响细胞凋亡.这里重点介绍BCL家族. 1　BCL2 1.1　BCL2的作用需要一完整的膜结构     BCL2的羧基端为疏水性，含有一个由19个氨基酸伸展成的跨膜结构.亚细胞组分分析、免疫荧光及共聚焦显微研究显示BCL2是一个26 ku的胞内膜蛋白，其分布依细胞类型而定，在造血细胞表达水平最高，常位于线粒体、光面内质网及核膜. BCL2的羧基末端作为信号锚（signal anchor）序列插入线粒体外膜，其胞浆多肽部分对蛋白酶敏感. 缺乏信号锚序列的BCL2抗凋亡功能不完全，但仍可与BAX结合成异二聚体. BCL2功能的发挥依赖于其在亚细胞膜的定位.BCL2氨基末端的大部分暴露于胞浆，借此可与胞浆蛋白或其他同时锚定在线粒体的BCL2样分子相互作用.BCL2可阻遏因缺乏线粒体DNA而不能携带电子传递的细胞凋亡，从而提示BCL2的功能并不需要一个完整的电子传递/氧化磷酸化链. 1.2　BCL2能抑制氧化剂诱导的凋亡     内质网、线粒体外膜及核膜是活性氧（reactive oxygen species,ROS）的产生部位.而BCL2也正存在于这些部位，这促使人们探讨BCL2与ROS在细胞凋亡中的作用关系，进而观察到BCL2能抗H2O2、t-丁基或甲萘醌（menadione）对细胞凋亡的诱导. 在低浓度时，这些氧化物主要是通过凋亡途径杀死细胞.此外，BCL2可拮抗某些降低胞内还原型谷胱甘肽含量的制剂诱发的凋亡.上述结果提示ROS可能涉及能被BCL2阻遏的细胞凋亡途径.近来研究反映抗氧化剂损伤为BCL2抗凋亡的原理之一，但在此途径中BCL2是直接或间接作用仍未知. BCL2影响细胞内钙内流     　　观察BCL2功能的另一方面是其存在于内质网，而后者与胞内钙自稳的调节有关.Ca2+影响凋亡，因为某些核小体DNA的降解为钙依赖性，且Ca2+通道激活剂可诱导淋巴细胞凋亡.尽管胞内Ca2+总量的改变并不与凋亡的诱导一致，但可出现胞内Ca2+的重新分布.观察钙泵抑制对凋亡的影响，人们发现凋亡与Ca2+流从内质网进入胞质有关，且BCL2能阻断这种钙流.胞内Ca2+贮存的流动性可能仅为复杂凋亡程序的环节之一，尚未明确BCL2是直接还是间接影响钙自稳.     　　大量资料显示BCL2可延长细胞存活期，抑制各种因素，包括物理、化学、生物因素等对细胞凋亡的诱导.BCL2的超常表达与肿瘤的发生发展有关.但是，BCL2并不能阻抑所有细胞的凋亡.鉴于BCL2能够阻抑由如此多不同信号及细胞内途径造成的凋亡，据此推测BCL2在凋亡途径中的作用必定在许多信号汇集后某个环节.因此，理论上细胞凋亡的下游途径可能不止一个.尽管BCL2阻遏凋亡的确切机制未明，业已了解其阻抑增殖期细胞的凋亡，延长非增殖期细胞的存活时间. (2)　BAX     　　BAX是重要的异二聚体伴分子，促进细胞凋亡.BAX含一类似于存在BCL2的疏水性羧基末端，与BCL2共存于线粒体. BAX在组织中广泛表达，包括在细胞正常成熟过程中发生死亡的许多部位.BAX与BCL2的同源区主要丛集在两个保守区BH1和BH2，但BAX中BH2的一个外显子接合点（exon juncture）是保守的. BAX与BCL2构成异二聚，而BAX自身组成同二聚体.BCL2蛋白中BH1和BH2的定点突变（site-directed mutagenesis）提示该结构域对结合BAX的重要性.当BCL2与BAX的结合点断裂（disrupted），则BCL2对细胞的保护性消失，说明BCL2必须结合BAX才能发挥其作用. BCL2与BAX蛋白量的比率决定异二聚体（BCL2/BAX）与同二聚体（BAX/BAX）的比值，这对决定细胞凋亡的易感性起关键作用.一般而言，BCL2的过度表达与BAX形成异二聚体而阻抑凋亡.然而，BCL2与BAX的比值依细胞系的发育阶段而异.BCL2/BAX比值的高低是判断恶性肿瘤耐药、复发的有用指标. 3　BCL-X     　　BCL-X类似于BCL2，但有不同的细胞系特异性.BCL-X是以BCL2为探针，采用低严紧型杂交所克隆，与BCL2有44％的氨基酸同源.BCL-X基因有两种不同的剪接方式，BCL-XL编码233个氨基酸，并含高度保守的BH1和BH2结构域；而BCL-Xs缺乏含BH1和BH2结构域的63个氨基酸的伸展部分.BCL-XL含一个疏水性羧基末端的跨膜结构，且其作用及亚细胞分布类似于BCL2. 在哺乳动物细胞，BCL-XL能与BAX组成异二聚体，当前者的单一氨基酸被取代，则其结合BAX的性能消失，进而消除其对凋亡的阻抑效应.表达BCL-XL的转基因小鼠（缺乏BCL2）的T细胞存活期延长，提示BCL-XL可取代BCL2的遗传特性. BCL-Xs可分别与BCL2、BCL-XL组成异二聚体. 　　尽管BCL-XL与BCL2存在相似性，但两者的性能不完全相同. 有些细胞的凋亡可被BCL-XL抑制，但不受BCL2阻遏. 外周T淋巴细胞的激活导致BCL-XL的快速产生，但非BCL2.在成人大脑细胞中，BCL-XL的表达显著高于BCL2.其他试验也提示BCL2与BCL-XL的表达方式有别. 因此，在不同类型细胞中，BCL-XL和BCL2的特异性作用也许不同. 在儿童急性淋巴细胞白血病中，观察到BCL-XL与BCL2的表达与调节作用均有所差别. 4　MCL-1和A1     　　MCL-1和A1与BCL2同源，均为抗凋亡基因.MCL-1基因是髓性白血病细胞经佛波醇酯诱导后所克隆，其与BCL2的同源区主要位于羧基端，含BH1及BH2结构域.但MCL-1的氨基末端异于BCL2，因前者含2个PEST序列.Al 基因是造血细胞在粒-巨噬细胞集落刺激因子和脂多糖诱导下产生的早期反应基因.在酵母双杂交系统中，MCL-1和Al分别与BAX强烈结合，提示存在MCL-1/BAX和Al/BAX异二聚体的可能性.早期资料未发现动物细胞中MCL-1与BAX的免疫共沉淀，但新近报道在造血细胞中MCL-1与BAX相互作用而抑制细胞凋亡. 5　BAK     　　BAK基因是新发现的细胞凋亡促进因子.BAK（BCL2 homologous antagonist/killer）是通过与E1B-19K蛋白相互作用或经聚合酶链反应产物克隆（PCR克隆）所发现.作为BCL2家族成员之一，BAK含BH1和BH2结构域，其功能类似于BAX；拮抗BCL2、BCL-XL及E1B-19K的抗凋亡效应. 但有例外，在经EB病毒转染的原始淋巴样细胞系WL-L2中，当撤除血清并用甲萘醌处理后，BAK延长该细胞系的存活期. 这显示BAK蛋白的作用与其他凋亡蛋白的前后依赖性.与同BCL2组成二聚体相比，BAK与BCL-XL构成异二聚体的能力更强. 6　BCL2同源区存在于DNA病毒蛋白     　　在与DNA病毒蛋白的同源性方面，BCL2家族基因的保守作用是显著的.除腺病毒E1B-19K基因外，EB病毒的BHRF1基因在一些潜伏性感染和细胞裂解的早期表达，其BH1和BH2结构域与BCL2有同源性.非洲猪热病毒编码的一个同源基因LMW5-HL在单核吞噬细胞受感染的早期表达.这些病毒同源物的作用也许是维持宿主细胞处于感染状态的功能. 7　BAD     　　BAD是BCL2/BAX、BCL-XL/BAX异二聚体的负调节基因.BAD是BCL2/BCL-XL相关死亡促进因子，作为BCL2、BCL-XL异二聚体伴分子而促进细胞凋亡. 但在凋亡途径中，其作用异于其他具有BH1和BH2结构域的BCL2家族成员.BAD缺乏典型的羧基端跨膜结构，提示其并非一完整膜蛋白.与同BCL2作用相比，BAD与BCL-XL的结合更强. BAD以浓度依赖性方式替换BCL-XL/BAX、BCL2/BAX异二聚体中的BAX，使BAX游离而促进细胞凋亡.当一细胞系的所有细胞内异二聚体（BCL-XL/BAX和BCL2/BAX）的含量≥50％时，则细胞耐凋亡；而当细胞内BAX同二聚体＞80％时且在适当信号诱导下则细胞出现凋亡. 这表明BAD通过调节BAX同二聚体与异二聚体量的比值而介导凋亡.客观上，尚未明确调控细胞死亡的胞内环境激活因素是BAX同聚体还是异二聚体（BCL-XL/BAX和BCL2/BAX）.也许上述两种二聚体均被激活，其比值才是启动凋亡的关键环节.这些提示细胞凋亡的影响因子BCL2和BCL-XL本身受蛋白质-蛋白质相互作用所调节. 8　BAG-1 　　另一个正调节（positively modulate）BCL2抗凋亡的蛋白是BAG-1. 体外实验显示BAG-1与BCL2存在相互作用.但是，BAG-1并非BCL2家族成员的同源物，其所含的一个泛醌样结构提示其作用机制也许是与影响蛋白质的稳定性有关.有趣的是，BAG-1和BCL2的共表达保护Jurkat T细胞免受抗Fas抗体和细胞毒T细胞的杀伤，说明如果有适当的调节蛋白存在时，BCL2可阻遏非BCL2依赖性的凋亡信号. 9　CED-9 CED-9是与BCL2同源的抗凋亡基因.CED-9是对秀丽线虫（C.elegance）的体细胞作遗传学研究鉴定的凋亡调节基因.CED-9与BCL2在结构和功能上有显著的同源性，两者的氨基酸序列有24％相同和49％相似，均含疏水性结构、羧基末端信号锚（signal anchor）序列及高度保守的BH1和BH2结构域，但CED-9的BH2中存在保守的外显子接合点（conserved exon junction）.功能上，BCL2转基因能阻抑秀丽线虫的一些细胞死亡，并通过部分替换CED-9而抗CED突变体的生态性死亡. 有趣的是，Gly145 Glu突变体，于BCL2是功能丧失；而性突变于CED-9则是功能获得（gain-of-function）性突变.此结果肯定了BH1结构域的重要性，同时提示进化上存在差异. CED-9和BCL2两者序列和功能的保守性说明细胞死亡的遗传途径普遍存在于多细胞有机体. 细胞凋亡的蛋白质调控因子 许多分子能够诱导细胞凋亡，肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）是其中的一种.TNF是一类主要由激活的巨噬细胞产生的细胞因子，能够通过激活Caspase蛋白酶、转录因子NF-κB、有丝分裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）等途径，实现其细胞毒性、抗病毒、免疫调节及转录调节等多种生物学活性.本文着重介绍TNF诱导细胞凋亡的信号转导途径. 1　TNF配体家族 　　到目前为止，发现的TNF家族成员有：TNF-α、LT-α、LT-β、FasL、CD40L、CD30L、CD27L、4-1BBL、OX40L、以及TRAIL、TRANCE等.这些蛋白质为Ⅱ型膜蛋白，C端（胞外区）之间具有很高的同源性，胞内区各不相同.其中TRAIL、TRANCE为最近克隆. 　　TRAIL又称Apo-2L，与Fas/Apo1很相似，含有281个氨基酸，C端也可以形成三聚体.TRAIL的胞外区能够介导淋巴细胞和多种肿瘤细胞系凋亡 　　TRANCE（TNF-related activation-induced cytokine）是1997年由Wong等克隆，由316个氨基酸组成，分子质量35 ku.其细胞外区和TRAIL、FasL及TNF相似.TRANCE受T细胞及Ca2+调节的转录因子的调控，在淋巴器官的T细胞中表达水平最高.人的TRANCE基因定位于13q14上.TRANCE的胞外区能够诱导T细胞中c-Jun N端激酶（c-Jun N-terminal kinase, JNK）途径的激活，而不能激活B细胞中的JNK，表明TRANCE在T细胞依赖的免疫反应中起作用. 2　TNF受体超家族 　　TNF配体家族的成员是通过与细胞膜上的相应受体结合，激活受体，而启动细胞内诱导细胞凋亡机制的.目前发现的TNF受体家族成员有：TNFR1、TNFR2、Fas、CD40、NGF-R、CD30、TNF-RP、PV-T2、PV-A53R、4-1BB、OX40、CD27、DR3、CAR1、DR4、DR5、TRID等.除了个别成员外，TNF受体超家族的成员都属Ⅰ型膜蛋白，由4个部分组成：信号肽、富含半胱氨酸的胞外区、跨膜区及胞内区.这些受体中TNFR1、Fas、NGFR、DR3、CAR1、DR4包含有死亡结构域（death domain, DD）. 　　DR3 ( death receptor 3 )是一个含有死亡结构域的细胞因子受体，主要分布在富含淋巴细胞的组织和器官中，如外周血、胸腺、脾、结肠、小肠，表现出诱导细胞凋亡及激活转录因子NF-κB两种生物学活性.它和TRADD、TRAF2、FADD、RIP和FLICE等都能够结合，并通过它们转导信号.DR3很可能在调节淋巴细胞的稳定方面发挥作用. 　　DR4是TRAIL的受体.它由468个氨基酸残基组成，N端具有信号肽，胞外区含有两个半胱氨酸丰富的伪重复区，胞内区含有死亡结构域.DR4不能和TRADD、FADD、RIP相互作用，表明TRAIL-DR4是通过其他的途径转导凋亡信号的. 　　DR5也是TRAIL的受体, 含有411个氨基酸残基，N端是信号肽，胞外区也含有两个半胱氨酸丰富的重复区，C端是死亡结构域.DR5和DR4具有很高的同源性.它在MCF7细胞及HeLa细胞中过表达能够诱导这些细胞凋亡.DR5诱导的凋亡作用可被Caspase蛋白酶的抑制剂CrmA和z-VAD-fmk所抑制.DR5不能和FADD及TRADD相互作用，因此，它也是通过其他的途径传递信号的. 　　TRID(TRAIL receptor without an intracellular domain)，亦称DcR1(decoy receptor 1)，也是TRAIL的受体，分布在人的很多正常组织，如心脏、肺、肝、肾、骨髓、脾、胎盘中，而在多数癌细胞中则不存在.它具有保护正常组织免受TRAIL介导的细胞凋亡作用.TRID由259个氨基酸残基组成，其显著的结构特点是没有胞内区，而只有信号肽、含有两个半胱氨酸丰富的重复区的胞外区及跨膜区，所以它和配体结合后，不转导信号.胞外区和DR4、DR5分别有69%和52%的氨基酸相同. 　　CAR1是鸟类造血细胞组织增生症病毒（ALV）受体，其胞外区也含有两个半胱氨酸丰富的伪重复区，胞内区是死亡结构域.该受体激活后能够诱导鸟类细胞凋亡. 3　TNF受体结合蛋白 3.1　TRADD（TNFR1 associated death domain protein） Hsu等利用酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system），用TNFR1的死亡结构域作为引诱蛋白克隆了TRADD.TRADD分子质量34 ku，含有312个氨基酸，C端具有死亡结构域，通过它可以和TNFR1特异性地结合.TRADD在多种细胞中过表达可以导致细胞凋亡以及激活转录因子NF-κB.TRADD的诱导细胞凋亡作用可被ICE蛋白酶的特异性抑制剂CrmA所抑制，而其激活转录因子的作用则不受CrmA影响. 3.2　FADD(Fas associated death domain protein) FADD又称MORT-1，是由两个研究小组利用酵母双杂交系统同时克隆的.它含有208个氨基酸，分子质量23 ku，C端含有一个死亡结构域，通过它可以和Fas/Apo1结合.N端含有一个新的结构域，称为MORT结构域或死亡效应结构域（death effector domain，DED），通过它可以和ICE/CED3蛋白酶家族的新成员--MACH/FLICE (Caspase 8)相结合，从而诱导细胞凋亡.研究表明，MORT结构域具有转导细胞凋亡信号的作用，它在细胞中单独表达即可诱导细胞凋亡.FADD在细胞中过表达也能够引起细胞凋亡.所有这些研究表明FADD具有向下转导Fas及TNF1两个受体的细胞凋亡信号的作用.最近研究还发现，FADD除了具有转导凋亡信号的作用外，在胚胎发育过程中也可能发挥作用. 3.3　RIP(receptor-interacting protein RIP是分子质量74 ku的蛋白质.它和Fas及TNFR1两个受体都能够结合.其C端是死亡结构域，N端和蛋白激酶具有同源性.RIP在细胞中的过表达也可以引起细胞凋亡. 3.4　Daxx 　　Daxx 由Yang等克隆的分子质量为81 ku、含有739个氨基酸残基的蛋白质，在体内外均能和Fas特异性结合.Daxx在细胞中的过表达产生两种生物学效应：激活JNK途径以及诱导细胞凋亡.Daxx本身没有死亡结构域，但它的C端存在能够和Fas的死亡结构域相结合的区域.其N端具有诱导细胞凋亡及激活JNK途径的作用.研究发现，Daxx和FADD是通过和Fas的不同区域结合，激活不同的信号转导途径而起作用的. 4　ICE/CED3蛋白酶家族 　　在Fas和TNFR1诱导的细胞凋亡的信号传递过程中有ICE/CED3蛋白酶的参与.ICE是线虫发育过程中细胞凋亡基因ced-3产物在哺乳动物中的同源体.至今共发现了10个CED-3和ICE的同源体，1996年后这些家族成员统称为Caspase. 　　Caspase家族的一个新成员，分别名为MACH (MORT-associated CED-3 homolog)和FLICE (FADD-like ICE).MACH/FLICE分子质量为55 ku，N端有两个MORT结构域，C端含有一个与ICE同源的结构域.MACH/FLICE能够通过N端的MORT结构域和FADD结合.其C端的ICE结构域在细胞中过表达可以引起细胞凋亡.可见，MACH是联系FADD和ICE/CED-3蛋白酶的媒介物. 　　很久以来一直未在哺乳动物中找到ced-4的同源体.Zou等克隆了ced-4在哺乳动物中的同源体Apaf-1 (apoptotic protease activating factor-1).该蛋白质分子质量为130 ku，N端的85个氨基酸残基和ced-3具有很高的同源性，称为CARD (Caspase recruitment domain)结构域. 接下来是和ced-4有很高同源性、含320个氨基酸残基的区域. C端有12个WD重复.Apaf-1具有激活Caspase3 (CPP32)的作用，而这一过程又需要其他两个蛋白质因子的参与：细胞色素c(Apaf-2)、Apaf-3. 　　Apaf-3是Li等纯化的第三个凋亡蛋白酶激活因子，蛋白质序列和免疫印迹分析表明，Apaf-3是Caspase家族的成员--Caspase 9 (Mach 6/LAP6).在细胞色素c和dATP存在下，Apaf-1和Apaf-3通过各自N端的ced-3同源区相互结合，激活Apaf-3，后者再去激活Caspase 3，导致细胞凋亡. Duan和Dixit发现了一种22 ku、含200个氨基酸残基的蛋白质RAIDD (RIP-associated ICH-1/CED-3 homologous protein with a death domain), 其C端是死亡结构域，能够通过它结合RIP, N端是Caspase 2 (ICH-1)和CED-3的同源区. 总之, 细胞凋亡是一个非常复杂的过程,它受到许多因素的调控与影响, 这些因素在胞内相互影响共同作用,它们的平衡最终决定了细胞的生长或死亡. 参考资料: 1.Apoptosis in parasites and parasite-induced apoptosis in the host immune system: A new approach to parasitic diseases. Barcinski-M-A ; DosReis-G-A, Brazilian-Journal-of-Medical-and-Biological-Research. April, 1999; 32 (4) 395-401 2. The role of inflammation in the pathogenesis of gastric cancer. Ernst-P ; Alimentary-Pharmacology-and-Therapeutics. March, 1999; 13 (SUPPL. 1) 13-18. 3. Genetic control of programmed cell death in the nematode Caenorhabditis elegans. Horvitz-H-Robert Cancer-Research. 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Biol., 18(5), 2912-2922 (English) 1998 American Society for Microbiology. 研究细胞凋亡意义何在 发布时间02年11月15日 09时42分 　 　　2002年诺贝尔生理学或医学奖分别授予了英国科学家悉尼·布雷内、美国科学家罗伯特·霍维茨和英国科学家约翰·苏尔斯顿，以表彰他们发现了在器官发育和“程序性细胞死亡”过程中的基因规则。“程序性细胞死亡”是怎么一回事？基因在其中发挥了什么作用？对它们的研究又有什么重大意义呢？ 　　“程序性细胞死亡”是细胞一种生理性、主动性的“自觉自杀行为”，这些细胞死得有规律，似乎是按编好了的“程序”进行的，犹如秋天片片树叶的凋落，所以这种细胞死亡又称为“细胞凋亡”。 　　包括人类在内的生物是由细胞组成的，细胞的诞生固然非常重要，但细胞的死亡也非常重要。我们每个人都是由受精卵发育而成的。受精卵分裂逐步形成大量的功能不同的细胞，发育成大脑、躯干、四肢等。在发育过程中，细胞不但要恰当地诞生，而且也要恰当地死亡。人在胚胎阶段是有尾巴的，正因为组成尾巴的细胞恰当地死亡，才使我们在出生后没有尾巴。如果这些细胞没有恰当地死亡，就会出现长尾巴的新生儿。从胚胎、新生儿、婴儿、儿童到青少年，在这一系列人体发育成熟之前的阶段，总体来说细胞诞生的多，死亡的少，所以身体才能发育。发育成熟后，人体内细胞的诞生和死亡处于一个动态平衡阶段，一个成年人体内每天都有上万亿细胞诞生，同时又有上万亿细胞“程序性死亡”。 　　在健康的机体中，细胞的生生死死总是处于一个良性的动态平衡中，如果这种平衡被破坏，人就会患病。如果该死亡的细胞没有死亡，就可能导致细胞恶性增长，形成癌症。如果不该死亡的细胞过多地死亡，比如受艾滋病病毒的攻击，不该死亡的淋巴细胞大批死亡，就会破坏人体的免疫能力，导致艾滋病发作。 　　早在20世纪60年代初期，科学家就开始探索“程序性细胞死亡”的奥秘。要揭开这一奥秘，需要选择一个合适的研究对象，像细菌这样的单细胞生物太简单，而像哺乳动物这样由大量细胞组成的生物又太复杂，科学家最终选择了线虫。线虫长仅1毫米，细胞数量不多，功能也不复杂，而且它身体透明，便于用显微镜观测。 　　布雷内早在20世纪60年代初期就正确地选择线虫作为研究对象。这一选择使得基因分析能够和细胞的分裂、分化，以及器官的发育联系起来，并且能够通过显微镜追踪这一系列过程。霍维茨发现了线虫中控制细胞死亡的关键基因并描绘出了这些基因的特征。他揭示了这些基因怎样在细胞死亡过程中相互作用，并且证实了相应的基因也存在于人体中。苏尔斯顿则描述了线虫组织在发展过程中细胞分裂和分化的具体情况。他还确认了在细胞死亡过程中发挥控制作用的基因的最初变化情况。 　　这3位获奖者的成果为其他科学家研究“程序性细胞死亡”提供了重要基础，后来科学家又在这一领域取得了一系列新成绩。科学家们发现，控制“程序性细胞死亡”的基因有两类，一类是抑制细胞死亡的，另一类是启动或促进细胞死亡的。两类基因相互作用控制细胞正常死亡。如果能发现所有的调控基因，分析其功能，研究出能发挥或抑制这些基因功能的药物，那么就可加速癌细胞自杀，达到治疗癌症的目的，提高免疫细胞的生命力，达到抵御艾滋病的目的。 　　目前一些国家的科学家已经开始利用“程序性细胞死亡”机理，研究可以治疗多种疾病的新方法，一些医药生物科技公司已经开始进行这方面的临床实验。不久的将来，由今年这3位诺贝尔生理学或医学奖获得者开创的“程序性细胞死亡”机理研究将可能在人类战胜疾病中发挥出重大的作用。 细胞凋亡的概念及其在心血管系统中的意义 　 细胞凋亡（apoptosis）在1972年由美国病理学家Kerr首次以形态学概念提出，指出它是生理条件下的细胞死亡模式，与细胞坏死（necrosis）的表现有着根本区别。经20余年的发展，尤其是在90年代，分子生物学技术不断丰富，对细胞凋亡的研究已成为当前细胞分子生物学领域的热点。 在临床上，细胞凋亡的相关研究主要集中于肿瘤、免疫相关性疾病和老年医学，现已证实多数抗肿瘤药物均可较特异地诱导肿瘤细胞的凋亡，许多免疫相关性疾病的病理过程中存在细胞的不正常凋亡，老年患者的某些退行性改变亦与细胞凋亡有关。近年发现，在人类的心血管系统中亦存在细胞凋亡的现象，且与许多心血管疾患的发生、发展密切相关。 　 　 1 活细胞死亡的两种形式 细胞的死亡（death）是指细胞生命活动的终止。在多细胞生物中，细胞的死亡有两种不同的形式。一种为坏死或意外性死亡（accidental death），是由于一些外界因素（如缺血缺氧、发热、炎性反应、各种理化损伤以及生物性侵袭等）所导致的细胞快速被动性死亡，与细胞内部的DNA序列及基因调控无关；另一种即为细胞凋亡，是细胞在一定的生理或病理条件下，按照细胞内部程序终止自身的生命活动，最后的结局多为自身裂解为若干细胞小体（亦称凋亡小体，apoptosis bodies），而被其它细胞所吞噬。细胞凋亡是一形态学概念，其功能学概念为细胞程序化死亡（programmed cell death，PCD）。 细胞坏死与细胞凋亡的主要区别 　 项目 细胞坏死 Necrosis 细胞凋亡 Apoptosis 诱因 外界急性病理变化 细胞内部生理或病理性但有规律的改变，或外部因素通过细胞内改变起作用 细胞形态 细胞水肿，外形不规则变化 细胞变小，外形变圆，微绒毛消失，随即与周围细胞脱离 细胞膜 膜通透性增加，最后崩解、破裂 膜通透性无改变，不破裂，最后膜内陷，将细胞内容物包裹为若干有膜的细胞小体 细胞器 内质网、线粒体及溶酶体膜破裂，其内容物在细胞膜破裂后随胞浆外溢 线粒体和溶酶体无大变化，内质网扩张呈泡状与细胞膜相融合，最后与细胞膜共同形成包裹细胞器和胞浆的细胞小体（凋亡小体）释放至细胞外 细胞核 核染色质不规则位移，最后核膜破裂，细胞核崩解，DNA在生物膜破溃后才发生不规则降解 核染色质密度增高，呈半月形凝聚于核膜周边，核仁裂解，但胞核不破裂，DNA早期即降解断裂为180～200bp倍数的片段 DNA电泳 因DNA不规则降解，故电泳呈现连续性条带（Smear） 因DNA早期即降解断裂为180～200bp倍数的片段，故电泳呈现梯形条带（Ladder） 对周围组织的影响 因细胞内容物外溢，对炎性细胞产生趋化，常引起周围组织的炎性反应 无溶酶体和胞膜破裂，细胞内容物不外溢，无炎性反应及周围组织的破坏 结局 细胞膜破裂，细胞崩解 形成的凋亡小体及母体细胞被邻周细胞或吞噬细胞所识别、吞噬，或自然脱落离开生物体 　 　 2 可诱发或促进细胞凋亡的因素 1、基因类：如P53基因、c-myc基因等； 2、细胞因子类：如某些内源性激素、TNF及许多活性氧中间体（OH-、H2O2、HOCl2等）可诱导多种细胞发生凋亡，而许多生长因子又可抑制凋亡； 3、抗原类：如某些细胞表面的Fas抗原，在特定条件下可诱导凋亡； 4、细胞类：如自然杀伤细胞（NK）、细胞毒性T细胞（CTL）可通过诱导靶细胞的凋亡来完成其杀伤作用； 5、药物类：如某些外源性糖皮质激素、细胞毒药物及抗肿瘤药物等； 6、外源性刺激：如小剂量辐射、冷刺激、缺血性和再灌注性损伤等。 　 　 3 细胞凋亡的生物化学特征 细胞凋亡的生物化学典型特征是核酸内切酶（endonuclease）的活化。凋亡发生时，细胞内Ca2+、Mg2+等离子明显升高，激活核酸内切酶，在核小体的连接处将DNA链切断，产生寡聚核小体，因每一核小体的DNA长度是180～200bp，故经核酸内切酶作用后产生的寡聚核小体的长度均为180～200bp的倍数，以琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis，AGE）测定DNA时会出现具有特征性的“梯形改变”（DNA Ladder）。另外，细胞凋亡时尚有其它一些新的蛋白的合成及激活，如谷氨酰转移酶、DNA酶Ⅱ、蛋白激酶C等。 　 4 细胞凋亡的基因调控 目前在哺乳动物中，已发现许多基因与细胞凋亡相关，明确证实参与凋亡调控的基因有ICE、P53、Fas、c-myc和bcl-2等，另发现10余种基因在细胞凋亡过程中有表达。 1、ICE基因 其产物是白细胞介素-1-β转换酶，可使白细胞介素-1-β活化，在细胞凋亡的信号传递过程中起重要作用，其半胱氨酸蛋白酶家族在整个细胞凋亡过程中起中心杀手作用。 2、P53基因 可分为野生型（wP53）和突变型（mP53）两种。 （1）wP53：是一种重要的抑癌基因，在正常的细胞周期中无明显作用，当细胞内DNA出现异常时，P53的复制、转录和蛋白表达均显著增加，可反式激活WAF1基因（其产物可抑制细胞从G1期进入S期），使细胞的有丝分裂周期停留于G1期，从而防止异常的DNA复制，有利于DNA的修复；当停留于G1期的细胞DNA因异常或破坏严重而修复困难时，wP53则可通过激活bad基因而启动细胞凋亡，从而防止了异常基因的表达以及细胞本身在形态、数量和功能方面的异常； （2）mP53：系由wP53发生突变而成，其不具备后者对异常基因的抑制作用，反而可对抗wP53的作用，促进细胞增殖（proliferation），抑制凋亡。 3、Fas基因（亦称APO-1） 其产物是其在细胞膜表面表达的受体，属于TNF受体和NGF受体家族，可与其相应的抗体结合诱导典型的细胞凋亡，亦可与细胞毒性T细胞（CTL）上的FasL（天然配基）结合诱导凋亡，后一作用被认为是CTL杀伤的分子机制之一。 4、c-myc基因 是调控细胞周期的主要基因，具有诱导凋亡和促进细胞增殖的双重作用；在血清中，有生长因子存在时可促进细胞增殖，若去除生长因子或加入抑制细胞周期的因子时则可诱导细胞凋亡的发生。 5、bcl-2基因 最早是从小鼠B细胞淋巴瘤中发现的原癌基因，在寿命较长的组织细胞（如心肌细胞、神经细胞等）中的表达量较高，其不能促进细胞的增殖，而是通过抑制细胞凋亡来延长细胞的存活时间，被认为是凋亡抑制基因；但近年来发现与其同源的bcl-2基因家族中，某些二聚体形式的基因产物（如Bad/Bax，Bax/Bax等）却可促进细胞凋亡的发生，其机理有待于进一步阐明。 　 　 5 细胞凋亡在心血管系统中的意义 在心血管临床中报道细胞凋亡较早者是其与心律失常的关系。James曾从形态学上总结了自己近30年来对心脏传导系紊乱研究的病例，指出心脏电活动的紊乱有许多源于先天性，而且在多发性浦肯野细胞瘤、房室结先天性良性多囊瘤、某些类型的先天性心脏传导阻滞、房室结和希氏束在出生后的形态发生、Wolff-Parkinson-White综合征、家族性房颤以及QT间期延长综合征均与细胞凋亡有关；随后，他又提出阵发性心律失常、传导系紊乱（某些病例可致猝死）及心律失常源性右心室发育不良与细胞凋亡有关，并通过对三例心脏传导阻滞猝死的患者进行尸检，发现其窦房结、房室结缺如，且心脏传导系统的心肌细胞数量极度减少，更证实此类心律失常的发生与心肌细胞凋亡有关。 细胞凋亡在心血管临床中的另一方面表现是其与心脏超负荷及心力衰竭的关系。心脏超负荷的早期，心肌细胞出现代偿性肥大，若心脏负荷持续过大，则心肌细胞数量减少；心力衰竭主要表现为心脏收缩功能下降，射血分数减少，其决定因素是心肌细胞数量的降低及心肌组织的纤维化。Katz 通过实验提出慢性心肌肥大的有害反应包括心肌细胞对生长因子反应的失调，即在衰老或持续负荷过重的心肌细胞，原可介导细胞肥大反应的某些生长因子亦可促进细胞凋亡；而具有生长抑制和扩血管作用的血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）和硝酸盐类药物，可通过抑制这些生长因子的产生而改善心衰的预后。Bing的实验证实在持续超负荷的心脏中，生理状态下抑制细胞凋亡的某些营养因子的数量减少，亦可诱发心肌细胞的凋亡。Teiger等通过DNA凝胶电泳和原位3'末端标记证实，小鼠心脏在压力负荷过大时引起心肌细胞肥大，并伴随心肌细胞数量的减少，尤其在压力超负荷的早期（7天内），细胞数量的减少主要是由于细胞凋亡，在第4天凋亡细胞的数量达到峰值。 动脉粥样硬化是西方国家的常见病，其主要病理学特征是动脉内膜的损伤和血管平滑肌细胞的增生，在它的发病机理中是否有细胞凋亡的参与，引起许多学者的关注。Cho等通过对新生羊多部位大动脉的观察，指出新生哺乳动物的血管构型在出生后可因血流、压力等因素的影响而发生重塑（remodeling），在重塑过程中，血管平滑肌细胞发生增生和低水平的凋亡；随动物年龄的增加，血管重塑减少，平滑肌细胞的增生和凋亡率亦随之下降。Bennett等发现鼠血管平滑肌细胞的凋亡，若是由c-myc诱导则P53基因起促进凋亡作用，而由bcl-2抑制则P53不表现促进凋亡作用，去除生长因子后的血管内皮细胞所发生的凋亡亦与P53无关。Kockx等从47例再次行冠脉搭桥术的患者处取出80只已狭窄或闭塞的大隐静脉移植片段，发现65只移植片段其狭窄和闭塞是由于平滑肌层的增厚，肌层的增厚是由于平滑肌细胞凋亡后的纤维化所致。Bennett等进一步观察了人的粥样硬化的冠状动脉、正常冠状动脉和主动脉，发现粥样硬化的和正常的冠状动脉平滑肌细胞均存在凋亡，但正常动脉的平滑肌细胞只是在去除血清中生长因子后才发生凋亡，而粥样斑块中的平滑肌细胞在有血清的情况下即可发生凋亡，去除血清则凋亡率明显增加，故推测血管壁上的粥样斑块的脱落崩解是平滑肌细胞异常凋亡所致。Isner等观察了56例因冠状动脉粥样硬化行PTCA术和PTCA术后再狭窄患者的旋切斑块，发现有35例标本中存在血管平滑肌细胞的凋亡，尤其再狭窄的病例较原发病例的凋亡率显著增高，提示PTCA术后再狭窄的发生很可能与平滑肌细胞增殖和凋亡失调及纤维化过度有关。Han等检测了35例冠脉粥样硬化的患者，发现有25例标本中存在细胞凋亡，更证实了动脉粥样硬化的发生与细胞凋亡有关。 缺血性心脏病的日益增多已引起注意，一些学者探讨了缺血状态下心肌细胞是否发生凋亡。Tanaka等将离体新生大鼠的心肌细胞置于无氧的培养环境中，发现其在12小时后出现细胞凋亡，而对照组的非心肌细胞（成纤维细胞）在72小时后仍无凋亡，反而出现增殖。Itoh等观察了19例死于急性心肌梗塞患者的心肌细胞，发现这些患者的心肌细胞除坏死外还存在凋亡。Kajstura等通过阻断大鼠的冠状动脉，观察到在心肌缺血的早期，心肌细胞发生凋亡者显著多于发生坏死者。 减少组