胶体金定量测定尿微量白蛋白的研究

免疫胶体金定量测定尿微量白蛋白的研究 储迅涛 (珠海丽珠试剂有限公司519020) 【摘要】本文以金溶胶颗粒作为免疫配基的载体，建立了胶体金免疫凝集抑制试验以定量测定尿 微量白蛋白。本试验体系中金溶胶颗粒的适当粒径为50-70nm，以硼酸一硼砂缓冲液作为反应缓冲液消 除了金溶胶在尿液介质中的絮状凝集，3%终浓度的聚乙二醇6000则保证了凝集反应的充分进行。本 方法标准曲线的线性范围为 40-200mg/L，适合于尿微量白蛋白的检测。用本法测定了103例临床尿液 标本，并与全自动蛋白质分析仪上散射速率比浊法的结果进行了比较，两种方法的相关性达到99.5% o 【关键词】 免疫胶体金 尿微量白蛋白 定量测定 临床上对尿微量白蛋白的测定表现出越来越大的兴趣，因为尿液微量白蛋白的升高提示了糖尿病 患者向终末期肾病发展[[1,21，其发生心血管疾病的危险性也显著增高〔3]。健康人的尿白蛋白一般小 于20mg/L，大于30mg/L时即提示情况异常[[4,5]。目前，以常规方法斌纸条法)测尿蛋白，其蛋白检出敏 感度约为200-300m叭。尿蛋白浓度大于200-300m叭时呈阳性，称为临床蛋白尿;而当尿白蛋白量介 于20-200mg/L时，常规方法测定尿蛋白为阴性，称为微量白蛋白尿(microalbuminuria)。微量白蛋白尿 是肾病初期即出现的一个早期指征，且能显示肾病的进展情况[[6]。在此阶段的肾病仍可逆转，一旦发 展到临床蛋白尿，则肾脏病变已不可逆。 测定尿微量白蛋白的方法很多，如放射免疫法、免疫浊度法、酶免疫法、免疫荧光法「6-10]等。 放射免疫法灵敏度高、特异性强，是测定尿微量白蛋白的经典方法，但由于有放射性污染且试剂保存 期短，很难在临床上广泛开展。免疫浊度法和ELISA是现在广泛应用的方法，国内由于免疫浊度法所需 的散射速率比浊仪(全自动蛋白质分析仪)价格昂贵，故以ELISA的应用最为广泛。本文以金溶胶颗粒作 为免疫配基的载体，建立了胶体金免疫凝集抑制试验以定量测定尿液中的微量白蛋白。特异性免疫反 应发生可导致金溶胶凝集，从而使金溶胶颗粒大小发生显著变化，不同大小的金颗粒对光的反射不同， 呈现不同颜色，可用比色测定来定量特异性免疫反应发生的程度。我们以此方法对照测定了103例临 床标本，与进口全自动蛋白质分析仪上散射速率比浊法的结果具有良好的相关性。 材料与方法 1金溶胶的制备 参照Frens介绍的方法制备不同粒径的金溶胶[[111。 2 金溶胶白蛋白缀合物的制备 将人血清白蛋白(上海生物制品研究所，纯度95%以上)溶于双蒸水，配制成10叭的溶液。在200ml 金溶胶中加人0.1moUL K2 C03溶液I ml, 1Og/L人白蛋白溶液0.5 ml，充分混匀后静置10分钟。再加 人I%聚乙二醇(PEG 20000) 8m1，充分混匀。12000rpm离心45分钟，倾去上清液，沉淀以0.02% PEG 20000(溶液以O.lmol/L K2 C03调pH至7.6)洗涤，12000rpm再次离心45分钟，倾去上清液，沉淀溶 于40m1 pH7.4, 0.01mol/LTris-HCI缓冲液(含0.04% PEG 20000, 0.1%叠氮钠)，此时A540nm =2-99- 3 兔抗人白蛋白抗血清的制备 以纯人白蛋白免疫家兔制得(双扩效价1:64)0 4 人白蛋白标准 Sigma公司，纯度约为99% 5 人白蛋白胶体金定量免疫试验 在试管中加人待测尿液样品或人白蛋白标准液50 111; 1:400稀释的兔抗人白蛋白抗血清500 u l(稀 释液为pH7.6 0.1mol/L硼酸一硼砂缓冲液)和含8% PEG 6000, 1 % NaCI的同一缓冲液450 u 1, 37℃保 温30分钟。随后加人上述金溶胶白蛋白缀合物200 111,摇匀后370C I小时，540nm比色。 6散射速率比浊法 在进口全自动特定蛋白分析仪(Beckman Array System)上用与其配套的微量白蛋白试剂盒测定，按说 明操作。 结果 1金溶胶颗粒直径的选择 金溶胶颗粒的直径与制备时加人的柠檬酸三钠量密切相关，在其它条件不变时，于一定范围内改 变加人的柠檬酸三钠量可制得不同颜色，即不同粒径的金溶胶。当250ml 0.01 %氯金酸中1%柠檬酸三 钠的加人量大于3m1时，金溶胶粒径较小(小于50nm),颜色呈桔红至深红色，其制成的免疫试剂发生 抗原抗体反应时颜色不能褪至无色，因而不适用于免疫胶体金凝集反应。而当柠檬酸三钠的加人量减少 到1.5ml时，所制得的金溶胶呈紫灰色，其粒径大于70nm，易发生沉淀，不宜用于制备免疫试剂。只 有当加人量为2.0-2.5 ml时，金溶胶呈紫红色，粒径约为50-70nm[l l l，悬浮稳定月_制成的免疫试剂 在发生抗原抗体反应时颜色可褪至无色，最适用于金免疫定量反应。因此本文选择的柠檬酸只钠加人 量为2.Oml，如此制得的金溶胶，其最高吸收峰在540nm, A540nm =1.270 2 反应缓冲液的选择 分别用pH7.6, 0.1mol/L的硼酸一硼砂、Tris-HCI, PBS缓冲液将兔抗人白蛋白抗血清稀释至1:4000 用散射速率比浊法定值的正常尿，加人一定量人白蛋白标准以配制标准溶液，使白蛋白浓度分别达到 20, 40, 50, 100, 200, 300和1000m昨。按材料与方法中的步骤5分别进行胶体金定量免疫试验。 Tris-HCI和PBS缓冲液作稀释液的各管在反应后均出现明显的絮状沉淀，使结果难以正确观察。而以 硼酸一硼砂缓冲液作稀释液时，无絮状沉淀出现，且在40-200mg/L的人白蛋白浓度范围内出现由浅至 深的颜色变化，线性良好。故选择硼酸一硼砂缓冲液作为本试验的反应缓冲液。 3 PEG浓度的影响 在胶体金免疫定量试验体系中，其它条件不变，只改变PEG 6000的浓度，使终浓度分别为1%, 2%、3%、4%和5%。其浓度为3%时，反应最完全(正常尿液标本反应后褪至无色)。 4 抗人白蛋白抗血清稀释倍数的选择 以正常尿液标本作样品，使用一系列不同稀释度的抗人白蛋白抗血清(1:100, 1:200, 1:300, 1:400, 1:500, 1:1000)，分别进行人白蛋白胶体金免疫定量试验。结果当稀释度为1:400时，抗人白蛋白抗血 清与金溶胶白蛋白结合物反应完全，恰好使金溶胶从紫红色变为无色。故选择 1:400的稀释度作为抗人 白蛋白抗血清的工作浓度。 5 标准曲线 纯人白蛋白溶解于pH7.6, O.lmol/L硼酸一硼砂缓冲液中，配制成不同浓度的标准液((0, 20, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300mg/L)，分别进行人白蛋白胶体金定量免疫试验，绘制标准曲线(见附图)，线性范 围在40-200mg/L。白蛋白浓度超过200mg/L的尿液样品如需精确定量，可稀释后再次测定。白蛋白浓 度低于40m妙的尿属正常范围，一般无需再作测定，如要精确定量，可将反应体系中的样品量加大至 250 u I，此时标准曲线的线性范围在。-40mg/L之间。 在第一次比色后1, 2和4小时分别再次测定各白蛋白标准管的吸光度值，绘制的标准曲线基本不 发生变化，说明本定量方法保温1小时反应已完全，颜色稳定性良好。 当人微量白蛋白含量分别为52.4和182.6mg/L时，其批内变异系数((CV % , n=10)分别为8.9%和4.7 %，平均6.8%;批间变异系数((n=10)分别为15.0%和9.7%，平均12.35%. ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?? ? ?? ? ????????? ?? 0 20 4050 100 150 200 白蛋白浓度(Mg /L ) 250 300 附图 人白蛋白胶体金定f免疫试验标准曲线 6 临床尿液样品的检测 用本方法检测了103例临床尿液标本，并与散射速率比浊法测得的结果进行了比较。两者的相关 性为r=0.995(n=103, p<0.01).Y=-11.5+1.08X (Y为散射速率比浊法结果，X为胶体金定量免疫试验结果)。 参照文献报道和Beckman散射比浊法的正常值(续19mg/L)，暂定本定量法正常参考值范围为 <,40m叭，两方法结果比较见附表。 附表 胶体金定纽免疫试验和散射速率比浊法测定尿白蛋白结果的比较 金免疫凝集抑制法 阳性 46 阴性 小计 散射速率比浊法 阳性 阴性 小计 以浊度法结果为准，胶体金定量免疫试验的相对敏感度为92.0%，相对特异性 为100.0%，两 老VT合主为 96.1%。 讨论 用金溶胶标记抗原或抗体，当发生免疫反应时金颗粒凝集而产生颜色变化，凝集的程度取决于多 种因素，如金溶胶颗粒的直径、相应待测抗原(或抗体)的浓度和时间等。对凝集程度的判断，既可通过 光电比色计定量测定，也可通过肉眼观察。国内外尚未见以金溶胶作为免疫反应载体定量测定尿微量 白蛋白的报道。 用于胶体金定量免疫试验的金溶胶颗粒，直径应在50-70nm之间。粒径大于70nm时，制成的缀 合物放置一周左右即发生明显自凝，不利于试剂的保存。而当粒径小于50nm时，较之大粒径的金溶胶 颗粒，抗原抗体反应后吸光度值的改变较小，线性很差，不利于结果的观察，粒径在20nm以下时免疫 反应根本不引起明显的颜色变化「12]。 金溶胶在尿液介质中易发生絮状凝集，影响对反应结果的正确观察，而硼酸一硼砂缓冲液可消除这 种自凝现象。在37℃水浴1小时，免疫反应已充分完成，此时溶液清澈透明，反应结果在4小时内无 明显改变，这对该试验的操作带来很大的方便。同时，反应温度对测定结果的影响也不大，如将反应 时间改为2小时，在40C、室温和37℃下所得结果差别很小。这种对温度的依赖性小是胶体金定量免 疫试验较之ELISA的优势所在(温度对ELISA中酶基质反应的影响很大)。 反应缓冲液中PEG 6000的浓度是影响胶体金定量免疫试验的另一重要参数。如果不加入PEG 6000，则几乎难以观察到反应所引起的颜色变化;但PEG 6000的浓度过高(>5%)会使阳性样品的吸光 度值下降，从而导致假阴性结果。 以抗原致敏金溶胶的定量凝集抑制试验较之以抗体致敏的直接凝集试验，其敏感度较低，但优点 是人白蛋白抗原来源方便、金溶胶白蛋白缀合物稳定性好((4℃保存3个月以上无任何变化)，而且在尿 微量白蛋白测定中，现有的敏感度已足够了，如何将测定的线性范围调节至适当区间才是问题的关键所 在。虽然尿液中白蛋白在病理情况下的分泌可高达10000m妙，但临床所关心的主要是20-200m妙的 浓度范围。本方法标准曲线的线性范围在40-200m妙，正适宜于对尿微量白蛋白的检测。此外，通过加 大反应体系中的样品量可调整标准曲线的线性范围，以准确定量浓度低于40m眺的尿微量白蛋白样品。 当白蛋白浓度低于40mg/L时，反应后的颜色即褪至接近无色，极易观察和判断，故本试验既可以光电 比色进行定量测定，也可通过肉眼观察作定性检查，很适合于没有特殊仪器的基层医院使用。用本法 对 103例临床尿液标本进行测定，与全自动蛋白质分析仪上速率散射比浊法的结果比较，具有很好的 相关性(r--0.995)。有4例标本散射比浊法阳性而我们得到的是阴性结果，这可能是因为40m妙的正常 参考09值定得比散射比浊法略高所致。 胶体金免疫定量试验测定尿微量白蛋白具有快速、简便、价廉、不需特殊仪器等优点，相信在iro 床上会有良好的应用前景。 【参考文献】 1. 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