含MDV部分gb基因、鸡Y一干扰素基因和EGFP基因表达盒

中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会集 含MDV部分gb基因、鸡Y一干扰素基因和EGFP基因达盒 HVT转移质粒载体pTu-gB-chIFN的构建 孙公军’，李银’，刘宇卓’，张则斌’，马玉玲’，张敬峰’，李劲松’，陈溥言’ (1南京农业大学动物医学院传染病组，210095; 2江苏省农科院兽医所禽病室，210014 ) 近年来，基因工程活载体苗的研究十分活跃，国内外的学者相继报道了能够成功表达外源基因的多 种重组活载体疫苗，如禽痘病毒、疤疹病毒、腺病毒、沙门氏菌等等。但对于这些重组活载体疫苗来 说，除了考虑它们的安全性以外，抗原量表达不高也是其难以推广应用的限制性因素。因此，如何提高 活载体的免疫效果成为了国内外的研究热点。后来，随着研究的深入，人们渐渐地意识到细胞因子可以 作为一种高效、安全的免疫佐剂。尤其是y一千扰素，由于它具有较强的增强机体免疫调节的功能，受 到了人们更多的重视。国内外的研究也从不同的方面证实了它作为基因工程活载体疫苗免疫佐剂的可能 性 。 但是从现有的免疫学理论来看，干扰素作为抗病毒的治疗剂，对病毒具有抑制作用，而将干扰素基 因插入到病毒活载体以后，重组载体表达的干扰素在抑制外来病毒增殖的同时，也有可能干扰载体病毒 的复制。这就难以解释它可作基因工程活载体疫苗免疫佐剂的事实。为此我们将鸡y一干扰素基因 (chIFN-y)与MDV部分gB基因同时插入到了载体中，构建了可用于真核表达的转移质粒载体，旨 在为以后的真核表达打下基础，从而深入地研究鸡y一干扰素基因作为基因工程活载体疫苗免疫佐剂的 可能性及其作用机理，并制备含免疫佐剂的重组活载体疫苗。 1、材料与方法 1.1 质粒与菌种:价-chIFN-y、pEGFP-C，以及宿主菌DH,。为江苏省农科院兽医所禽病室保存， pTK2B, pURMDV-EgB为南京农业大学传染病实验室保存。 1.2 试剂:PCR试剂盒、Mini BEST Plasmid Purification Kit, Agrose Gel DNA Purification Kit、内切酶、DNA marker均购自Takara公司，胰蛋白脉、酵母抽提物为 Oxiod产品;氨节青霉 素、卡那霉素购自罗氏公司;其它试剂均为国内纯。 1. 3 引物:根据Genbank发表的序列，利用Primer5.0和DNA star软件，设计了两对引物。 chIFN-y p,: 5' GATAAGCTTCAGCCATCACCAGGAAGAT 3' chIFN-y p2: 5' GACCTGCAGAAGATGCCATTAGCAATT 3' gB p,: 5' CCTAGATCTTATTTTAGGCGGAATTG 3' gB p2: 5' TTAAAGCTTCTACCTGACCCATACC 3' 1.4 PCR扩增:chIFN-y和gB的扩增分别以pT-chIFN-y和pURMDV-EgB为模板进行PCR反 应。chIFN-y扩增的反应条件为94'C 5min, 94V 30s, 61`C 30s, 72`C 60s共35个循环;72'C 延伸 10mino gB扩增的反应条件为94'C 5min, 94`C 30s, 580C 60s, 720C 2.5min共35个循 环;72℃延伸10min。电泳检测扩增效果。 1.5 PCR产物的克隆:将chIFN-y和IB的PCR产物用Agose Gel DNA Purification Kit回收，酶 切后先后插入到pEGFP-C 1中，构建真核表达的基因表达盒。其中chIFN-y的PCR产物用PstI和 Hind III酶切，gB的PCR产物用Bgl II和Hind III酶切。感受态细胞的制备、外源基因的连接以及连 中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立 20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集 接产物的转化按《分子克隆》中的方法进行。卡那霉素抗性及酶切鉴定阳性重组质粒。得到的重组质粒 依次命名为PC,-IFN. PC,-IFN-gB. 1.6 pTu-gB-chIFN的构建:pTK2B用Nhe I线性化、CIAP去磷酸化、Klenow补平;PC,-IFN-gB 用Apal I和Nae I酶切、Klenow补平。电泳回收后16℃连接12h.氨节青霉素抗性及酶切鉴定阳性 重组质粒。得到的重组质粒命名为pTu-gB-chIFN. 2、结果 2.1 PCR扩增 chIFN-y和gB的 PCR扩增产物分别用 1%的琼脂糖凝胶电泳观察。可看到分别在 500bp. 2100bp左右有特异性的条带，大小与预期结果相符。 2.2 PCR产物的克隆 2.2.1 PC,-IFN的鉴定卡那霉素抗性初步筛选的阳性菌，提取质粒后用PstI和Hind III酶切，1%的琼 脂搪凝胶电泳观察。可看到分别在 500bp. 4700bp左右有两条带。500bp的条带为克隆进去的 chIFN-y，4700bp的条带为载体pEGFP-C, ,表明筛选到的确为阳性质粒。 2.2.2 PC,-IFN-gB的鉴定 卡那霉素抗性初步筛选的阳性菌，提取质粒后分别用PstI和Hind III醛切、Bgl II和Hind III酶 切、Bgl 11和Pstl酶切，1%的琼脂搪凝胶电泳观察。PstI和Hind III醛切，可见的两条带分子A分别 为500bp和6800bp; Bgl II和Hind III酪切，可见的两条带分子量分别为2100bp和5200bp; PstI 和Hind III酶切，可见的两条带分子量分别为2600bp和4700bp。表明ChIFN-y和gB同时插入到T 载体pEGFP-C,中。 2.3 pTu-gB-ChIFN的构建 氨节青霉素抗性初步筛选的阳性菌，提取质粒后用Nhe I酶切。再用Nhe I酶切鉴定，电泳观察看 到分子量大约为2600bp和8200bp的两条带。这与理论推测的2618bp和8240bp保持一致，证明了 上述基因表达盒的确插入到了pTK2B中。 3、讨论 3.1 PCR扩增目的片段的选取 由于本实验的最终目的是让ChIFN-y基因、gB基因以及增强型绿色荧光蛋白基因 (EGFP)在真核 中融合表达，因此为了以后工作的顺利进行，我们做了两项工作:一是在引物的酶切位点之后，相应地 加入一个或两个碱基，以保证表达时每个基因都在同一阅读框中进行;另一个则是在相邻的两个基因之 间，隔开一定的距离，从而避免表达出的蛋白质相互缠绕在一起。EGFP和gB之间，我们通过选择酶 切位点，让两者间留下了五个氨基酸的距离，而gB和ChIFN-y之间，通过在引物设计上，让ChIFN-y 的扩增从一16位开始，也保证了这一点。此外，gB基因的扩增是从第31位开始到2131位结束的，这 样选择是因为对于MDVgb来说，第63个碱荃到第2049个碱基，编码gb的膜外结构域，而且此处的 氨基酸序列显示许多搪结合部分，可形成多种杭原决定簇，是中和性免疫功能的实质部分。选择第31位 到2131位不仅包括了这部分序列，而且也考虑到了PCR扩增时的错配、上下游引物的降解温度以及扩 增效率问，便于扩增出理想的片段。 3.2 PCR扩增以及产物的克隆 ChIFN-y的扩增和克隆都比较顺利，几乎一次性成功。但 gB基因扩增时，遇到了一些困难。或者 扩增的条带不清晰，或者有非特异性的条带，或者役有条带。经过笔者几次条件的摸索，终于按 1.4所 中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集 述扩增出了条带。将之连接到PC,-IFN之前，也经过了一个连接到T载体的过程，目的是通过细菌的繁 殖增加外源基因的浓度，从而便于粘端的连接。 3.3 pTu-gB-chIFN的构建 构建含基因表达盒的转移质粒载体，可谓是本实验的难点所在了。平端连接是一个低效反应，它要 求这样几个条件:(1)低浓度的ATP; (2)极高浓度的连接酶;(3)高浓度的平端。围绕着这些要 求，我们进行了四次尝试，在最后一次终于筛选到了阳性重组菌。总结经验，我们以为上述第三个条 件，往往是最难满足，也常常是导致平段连接失败的限制性因素。为此，我们仍然通过使用Takara公司 的Agrose Gel DNA Purification Kit回收凝胶，以提高凝胶的回收率。而且载体的线性化、去磷酸 化、补平，以及PC,-IFN-gB的酶切和补平，每一步都用Agrose Gel DNA Purification Kit回收，最 后回收的质粒取 2ul跑电泳，看有无条带，如果有则进行连接。用这样的方法可以初步保证有高浓度的 平段可供连接。 参考文献 (略)