纳豆激酶分离纯化方法的研究

中 国 酿 造 2010年 第 4期 总第 217期 纳豆激酶（Nattokinase，NK）是由纳豆芽孢杆菌经过 发酵分泌到胞外的一种碱性丝氨酸蛋白酶，具有较强的溶 栓活性，可开发成保健食品和溶栓药物。与传统溶栓药物 相比，纳豆激酶可以由枯草芽孢杆菌发酵，易于工业化生 产，并且溶栓活性高、无出血倾向、口服有效、使用方便、安 全，已成为新一代溶栓药物研究中的热点[1-2]。目前主要采 用盐析法和两到三步层析法相结合来分离提取纳豆激 酶，层析介质均为琼脂糖、葡聚糖、纤维素等大孔树脂，虽 然最终能得到电泳纯的纳豆激酶[3-5]，但由于所采用的树脂 价格昂贵，基本依赖于进口，使得分离纯化成本大大提高， 成为工业化生产纳豆激酶的一个瓶颈。相比较以上3种层 析介质，常规工业化生产用的高分子聚合物树脂价格便宜， 且大部分均已国产化，因此，本研究以高分子聚合物离子 交换树脂和纤维素树脂相结合的方法，分离提取得到电泳 纯的纳豆激酶，分离纯化成本大大降低，为纳豆激酶的工 业化生产奠定了基础。 1 材料与方法 1.1 实验材料与仪器 1.1.1 实验材料 330、1400、301、180、152、724、711、122树脂：安徽三星 树脂科技有限公司；颗粒活性炭：天津市永大化学试剂开 发中心；CM-52树脂：Whatman公司；凝血酶、牛纤维蛋白 原：Sigma公司；低分子量Marker：Takara公司。 1.1.2 实验仪器 HD-21-88紫外检测仪：上海淇特分析仪器有限公司； N2000双通道色谱工作站：浙江大学智达信息有限公 司；752型紫外分光光度计：上海光谱仪器有限公司；TH-300 梯度混和仪：上海沪西分析仪器厂有限公司；PW/10-002台 式保温培养箱：重庆实验设备厂。 1.2 实验方法 1.2.1（NH4）2SO4，盐析工艺 将发酵液8000r/min离心除菌，向其中加入不同饱和度 的（NH4）2SO4，4℃冷藏过夜，测定上清液和沉淀中的纳豆 激酶活性和蛋白质浓度。 1.2.2 脱色工艺 脱色介质的筛选：将发酵液经（NH4）2SO4盐析，用 0.2mol/L的PBS将沉淀溶解、透析，加入2g不同的脱色介质， 于摇床脱色2h，静置，测定上清液中的酶活和蛋白浓度，计 算其脱色率、酶活保留率及蛋白去除率。 （NH4）2SO4对脱色的影响：发酵液加入（NH4）2SO4盐 析，用0.2mol/L的PBS溶解沉淀，分别取透析前和未经透析 的溶液经330（OH）树脂层析柱，测定流过液的酶活和蛋白 浓度，比较脱色率和酶活保留率的变化。 流速的选择：将发酵液经盐析，用0.2mol/L的PBS将沉 淀溶解，以不同的流速经330（OH）树脂层析柱，测定方法 同上，比较脱色率和酶活保留率的变化。 纳豆激酶分离纯化方法的研究 史延茂1，马跃华1，2，杨 明1，2，董 超1* （1.河北省生物研究所,河北 石家庄 050081；2.河北工业大学化工学院,天津 300130） 摘 要：采用硫酸铵二级盐析、330（OH）型树脂脱色、CM-52阳离子树脂离子交换层析三步法从发酵液中提取纳豆激酶。结果发现： （1）硫酸铵盐析采用20%~60%饱和度范围，纯化倍数为3.23，收率为72.36%；（2）330（OH）型树脂脱色，在脱色的同时可以除去杂蛋 白，样品纯度达到电泳显示2条带；（3）CM-52阳离子交换树脂对纳豆激酶属于优吸型吸附，在pH6.0,0.01mol/L的PBS中交换效果最 好，可以得到电泳纯的纳豆激酶，总收率为48.51%。 关 键 词：纳豆激酶；分离纯化；盐析；脱色；离子交换 中图分类号：TQ925 文献标识码：B 文章编号：0254-5071（2010）04-0119-05 Method of separation and purification of nattokinase SHI Yanmao1, MA Yuehua1,2, YANG Ming1,2, DONG Chao1* (1. Hebei Institute of Biology, Shijiazhuang 050081, China; 2. Hebei University of Technology, Tianjin 300130, China) Abstract: The extraction methods of nattokinase from fermentation fluid were studied with two degree salt- out of (NH4)2SO4, decolor of resin 330 （OH）and positiveion resin CM-52 Ion exchange. As a result: (1) the saturation of (NH4)2SO4 salting- out was 20 %~60 %, purification multiple is 3.23, recovery was 72.36 %; (2) after resin 330（OH）decolorization, the sample can achieve the purity of electrophoresis and demonstrate two belts; (3) positive ion resin CM-52 ion exchange adsorption was superior adsorption of nattokinase, the best exchange effect was with pH 6.0, 0.01 mol/L PBS, existing only one elution peak, it can dissolve the hitch and its purity of electrophoresis of nattokinase. The total recovery was 48.51 %. Key words: nattokinase; separation and purification; salting-out; decoloratio; ion exchange 收稿日期：2009-07-23 作者简介：史延茂（1962-），男，河北石家庄人，研究员，研究方向为生物发酵工艺、生物药物开发应用；董 超*，高级工程师，通讯作者。 经验交流 119· · 2010 No．4 Serial No．217 China Brewing 1.2.3 离子交换工艺 pH值的选择：将脱色后的发酵液经不同 pH值的 0.01mol/L的PBS透析，取3mL透析液，向其中加入1g CM-52 （Na型）树脂，振荡2h，测定方法同上，计算离子交换量。 离子强度的影响：将脱色后的发酵液经不同NaCl浓度 的0.01mol/L的PBS（pH6.0）透析，取3mL透析液，向其中加 入1g CM-52（Na型）树脂，振荡2h，测定方法同上，计算离 子交换量。 吸附等温线：将脱色后的发酵液透析后冷冻干燥，将 其溶于0.01mol/L的PBS（pH6.0）中（其中含有不同酶活力 的纳豆激酶），向其中加入1g CM-52（Na型）树脂，于摇床 振荡4h，测定方法同上，计算树脂交换量。 柱层析及洗脱：将脱色后的发酵液于0.01mol/L的PBS （pH6.0）中透析，以一定的流速经过CM-52层析柱，淋洗后 以0mol/L~1mol/L的NaCl进行线性梯度洗脱，收集洗脱峰， 测定酶活，计算收率。 1.2.4 SDS-PAGE电泳 按参考文献[6]的操作方法进行。 1.2.5 各物理量的计算 纳豆激酶酶活：按参考文献[7]中所提供的方法进行。 蛋白质浓度的计算：按参考文献[8]中所提供的方法进行。 酶活保留率＝（1-脱色后酶活 初始酶活 ）×100% 蛋白去除率＝（1-脱色后蛋白质浓度 蛋白质初始浓度 ）×100% 脱色率 =（1- A0At ）×100% 式中：A0和At分别为脱色前和脱色后的波长460nm处的吸光度值。 交换量 =初始酶活-离子交换后酶活 初始酶活 ×100% 2 结果与讨论 2.1 盐析工艺 向发酵液中加入不同饱和度的（NH4）2SO4，4℃冷藏过 夜，测定上清液和沉淀的纳豆激酶活性、OD460nm以及蛋白 沉淀率，结果见图1、图2。 由图1可知，当（NH4）2SO4饱和度＜20%时，蛋白质沉 淀率逐渐增大，而纳豆激酶没有被沉淀下来，这说明有大 量的杂蛋白被沉淀下来；当（NH4）2SO4饱和度＞60%时，纳 豆激酶已基本被沉淀下来，因此选择20%~60%的饱和度 为（NH4）2SO4二级盐析的饱和度范围。由图2可知，随着 （NH4）2SO4饱和度的增大，发酵液上清液中色素含量逐渐 下降，沉淀中色素含量逐渐增大，这说明发酵液中的色素 在蛋白质盐析的过程中被沉淀了下来。色素分子一般是麦 拉德反应的产物，为带负电荷的小分子物质，在发酵液中 可以结合到带正电的蛋白质周围[9]，图1中蛋白质沉淀率和 图2中的色素沉淀曲线具有相同的趋势，可以推断盐析过程 中，蛋白质和被结合上的色素一同被沉淀下来。同时，这也 表明高离子强度并不能破坏色素与蛋白质之间的结合力， 因此单纯盐析过程并不能去除色素，这说明后续的脱色工 艺是必要的。同样原理，还发现膜过滤也不能除去色素。 2.2 脱色工艺 2.2.1 脱色介质的筛选 将发酵液经盐析处理，将沉淀用缓冲液溶解，取10mL 向其中加入2g不同的脱色介质，上摇床脱色2h，结果见表1。 表1中的330、301、711树脂均为阴离子交换树脂，152、 180、724均为阳离子交换树脂，1400、D3520为大孔吸附树 脂。由表1可以发现，阴离子交换树脂的脱色效果最好，大 孔吸附树脂次之，阳离子交换树脂最差，这说明发酵液中 的色素分子大部分带负电荷，并且小于阴离子树脂的孔径， 可以与阴离子交换树脂进行离子交换；而蛋白质分子（包 表1 脱色介质的筛选 Table 1. Filtration of decoloring medium 树脂 类型 脱色率/ % 酶活保 留率/% 蛋白去 除率/% 树脂 类型 脱色率/ % 酶活保 留率/% 蛋白去 除率/% 330（Cl） 22.70 90 24.3 301（Cl） 60.69 73.09 33 1400 36.18 31.04 56 330（OH） 54.96 88.76 48.5 180（Na） 1.72 78.3 12.5 152（Na） 1.67 72 40.5 301（OH） 54.93 86.74 38.5 D3520 53.8 23.21 85.2 724（Na） 9.54 69.3 36.9 711（OH） 53.05 88.84 30.2 Experience Exchanges120· · 中 国 酿 造 2010年 第 4期 总第 217期 括NK）相对于树脂孔径较大，当发酵液流经树脂时，树脂 与色素之间的作用力大于色素与蛋白分子之间的作用 力，色素被大量吸附到树脂上，蛋白分子会大量流过。同 时由表1可以看出，OH型阴离子交换树脂的脱色率要优于 Cl型阴离子交换树脂，综合考虑330（OH）型树脂的脱色 率、酶活保留率及蛋白去除率均较高，故选择330（OH）型 树脂为发酵液的脱色介质。 经过330（OH）型树脂脱色，由于有OH－被交换下来， 使得最终脱色液的pH值为9.0左右，这仍然在纳豆激酶的稳 定pH值范围内，不会造成酶的失活；相反，由于大部分其 他杂蛋白质为酸性蛋白，在碱性条件下会发生构象的改 变而造成变性或沉淀，这也就是330（OH）型树脂的对蛋 白去除率较高的主要原因。 2.2.2（NH4）2SO4对脱色的影响 取纳豆激酶发酵液经（NH4）2SO4二级盐析，分别用透 析后和未经透析的样品进行上柱层析脱色，结果见图3。 未透析的发酵液中有一定数量的离子，其对脱色率和 酶活保留率均产生一定的影响。由图3可见，在开始一段时 间内，由于离子的存在，在一定程度上抑制了色素和树脂 的结合，故未透析发酵液的脱色率低于透析后的发酵液，随 着时间的延长，这种抑制作用逐渐减弱，最后，未透析和透 析后的发酵液的脱色率相差不大。盐析之后的透析操作 完全可以省略，这样并不影响以后的脱色，从而减少了分 离纯化步骤，提高了收率。 2.2.3 脱色过程流速的选择 将样品在不同的流速下用330（OH）层析柱进行脱色， 结果见图4。 由图4可见，流速的改变对脱色率的影响比较大，而对 酶活保留率的影响很小。增大流速，脱色率降低。色素分子 在树脂上的吸附小部分为外扩散，大部分由内扩散控制，流 速太快，内扩散作用相对减小；同时由于蛋白质分子的体 积大于树脂孔径，部分色素分子与蛋白结合流出。所以应 选择小流速进行上样脱色，同时考虑到流速太小，会使得 脱色周期增大，使得酶活造成损失，因此选择1BV/h的流速 进行脱色，在工业生产中，可根据样品脱色率的调整 脱色时间。 2.3离子交换工艺 2.3.1 pH值的选择 在不同的pH值下用CM-52树脂对脱色后的纳豆激酶 液进行离子交换，结果见图5A。 由于纳豆激酶的等电点为8.6±0.3，酶活的稳定pH值 为6.0~9.0，故选择pH6.0~8.0进行离子交换实验。由图5A可 知，在此pH值范围内，随着pH值的增大，纳豆激酶在CM-52 树脂上的交换量逐渐减少，通过对图5A中的曲线进行 线性回归分析，可知该减少趋势为线性变化，其线性回归 方程为：y= -548.75x+6539，R2=0.9709。这是由于降低pH 值，将使纳豆激酶所带正电荷增加，从而增大了纳豆激酶 在CM-52树脂上的交换量。从图5A可知，在pH值为6.0时， 纳豆激酶的交换量最大，故选择该pH值为纳豆激酶离子 交换的pH值。 2.3.2 离子强度对交换量的影响 在pH6.0、不同NaCl浓度条件下，将纳豆激酶脱色 液在CM-52树脂上进行离子交换（见图5B）。 离子强度是影响蛋白质离子交换的主要影响因素之 一，增大溶液中的NaCl浓度，将使体系的离子强度增大， 由图5B可以发现，NaCl浓度对纳豆激酶在CM-52上的离 子交换行为影响比较大，当NaCl浓度＞0.05mol/L时，纳豆 激酶在CM-52树脂上的交换量显著下降，并且随着NaCl浓 经验交流 121· · 2010 No．4 Serial No．217 China Brewing 度浓度的增大，其交换量继续呈下降趋势，当NaCl浓度＞ 0.25mol/L时，其下降趋势开始趋于平缓，故选择低离子强 度（0.01mol/L、pH6.0的PBS）的条件对脱色液进行透析处 理，以利于下一步上样。洗脱可以考虑从0.05mol/L开始， 以利于缩短层析时间。 2.3.3 CM-52树脂对纳豆激酶的吸附等温线 在pH6.0、0.01mol/L的PBS中，取不同酶活的纳豆激酶 液，用CM-52树脂进行离子交换使之达到平衡，结果见图6。 由图6可知，CM-52树脂对纳豆激酶属于优吸型吸附， 随着纳豆激酶溶液酶活的增大，交换量逐渐增大，并且通 过对图6曲线进行回归分析，其吸附符合Langmuir方程，回 归结果见图7，回归方程为： 1 w ＝0.0302× 1 U +7×10 5，R2=0.973， 式中：w为交换量，U/g；U为纳豆激酶酶活，U/mL。 该吸附模型说明纳豆激酶在CM-52上的吸附属于单 分子吸附。 2.3.4 上样、淋洗与洗脱 将脱色后的纳豆激酶溶液经上样缓冲液透析后稀释 1倍，以0.5mL/min的流速进行上样，然后以上样缓冲液洗 至基线，最后以0mol/L~1mol/L的NaCl溶液进行线性梯度 洗脱，其穿透曲线、淋洗曲线、洗脱峰见图8。 由图8可以发现，经脱色后将纳豆激酶经CM-52树脂 进行离子交换，只有一个洗脱峰，并且该峰具有溶栓活性。 Experience Exchanges122· · 中 国 酿 造 2010年 第 4期 总第 217期 ������������������������������������������������������������� 笠广告笠 图9的电泳图谱中分子量较小的杂蛋白在pH值为6.0 时带负电荷，在CM-52阳离子交换树脂上不发生离子交换， 因此图8的洗脱峰里只有一个峰。将洗脱峰进行SDS- PAGE电泳，结果见图9。 2.4 纳豆激酶分离提取工艺流程评价 各分离提取步骤的收率及纯化倍数见表2。 3 结论 （1）由纳豆激酶发酵液经过20%~60%（NH4）2SO4盐析、 330（OH）型树脂脱色、CM-52（Na）型树脂离子交换层析，最 终得到电泳纯的纳豆激酶，总的纯化倍数为31.2，总收率为 48.51%。 （2）由于色素分子以相反电荷结合到蛋白分子周围， 盐析时色素会随蛋白分子沉淀，所以不能单纯依靠盐析进 行脱色。同样原理发现膜过滤也不能完全除去色素。 （3）在用330（OH）型树脂脱色的过程中，pH值会增 大，但该pH值仍为纳豆激酶的稳定pH值，可用透析的方法 调整溶液的pH值，以进行下一步的离子交换过程。 （4）CM-52阳离子交换树脂对纳豆激酶的吸附属于优 吸型吸附，吸附等温线符合Langmuir方程，层析缓冲液条 件为0.01mol/L，pH6.0的PBS。 （5）在实际工业化生产中，一般不采用盐析工艺，浓缩 和初步提取均采取膜过滤工艺，针对纳豆激酶发酵液提取 精制应该选择膜过滤除菌、浓缩、脱色和层析步骤，相关研 究工作正在进行中。 参考文献： [1] SUMI H, HAMADA H, TSUSHIMA H, et al. A novel fibrinolytic en- zyme (nattokinase) in the vegetable cheese Natto; a typical and popular soybean food in the Japanese diet[J]. Cell Mol Life Sci , 1987, 43(10): 1110-1111. [2]张 锋，金 杰，解成俊.纳豆激酶最新研究进展[J].中国调味品，2008 （1）：29-30. [3]阳承利，邢建民，刘俊果，等.纳豆激酶分离纯化技术的研究进展[J]. 现代化工，2004，24（2）：23-25. [4]吕 莹，张 露，冯 雷,等.纳豆激酶的纯化及性质研究[J].食品与发 酵工业，2004，30（3）：122-124. [5]朱健辉，杜连祥，路福平，等.纳豆纤溶酶———纳豆激酶的分离提纯及 稳定性研究[J].食品研究与开发，2005，26（5）：45-48. [6]郭尧君.蛋白质电泳实验技术[M].北京：科学出版社，2006. [7]杨 明，董 超，史延茂，等.纤维蛋白平板法测定纳豆激酶方法的改 进[J].中国酿造，2008（7）：77-80. [8] BRADFORD M M. A rapid and sensitve method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Anal Biochem, 1976, 72: 248-254. [9] ROSENFELD S A, NADEAU D, TIRADO J , et al. Production and pu- rification of recombinant hirudin expressed in the methylotrophic yeast pichia pastoris[J]. Protein Expres Purif, 1996(8): 476-482. 表2 纳豆激酶分离提取工艺流程评价（1L发酵液） Table 2. Evaluation to the separation and purification techniques of nattokinase 项目 总酶活/U 比活力/ （U·mg-1） 每步收 率/% 总收率/% 纯化倍数 发酵液 6911106.46 136.76 100 100 1 20%盐析 6277115.179 138.80 90.83 90.83 1.01 60%盐析 5097645.237 441.57 81.21 73.76 3.23 脱色 5003641.08 1500 98.15 72.40 11 离子交换 2950351.35 4289.76 58.96 48.51 31.2 经验交流 123· ·