丁酸梭状芽孢杆菌的研究进展

安徽农学通报，AnhuiA画．Sci．Bull2007，13(4)：37—39 丁酸梭状芽孢杆菌的研究进展 冉雪松1 王振华2 潘康成2 (1内蒙古赤峰市松山区太平地镇动物防疫站，内蒙古赤峰024024； 2四川农业大学动物科技学院动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川雅安625014) 摘要：本文介绍了丁酸茵的生物学特性、生物功能以及培养条件和发酵生产工艺。 关键词：丁酸梭状芽孢杆菌；研究进展 中图分类号Q93 文献标识码A 文章编号1007—7731(2007)04—37—03 丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridiumbutyricum)即丁酸菌， 又名酪酸菌，宫入歧菌⋯。主要存在于奶酪、天然酸奶、人 与动物的肠道与粪便中、某些树叶、土壤等自然环境中，一 般在10％一20％的健康人群中能分离到B1。由于丁酸菌 具有特殊的微生态学特性，日趋受到医学、兽医学、饲料工 业的广泛关注，本文就丁酸梭状芽孢杆菌的生物学、微生 态学、功能与应用等进行综述，以供参考。 1丁酸菌的形态特征和生化特性 1．1形态特征丁酸菌是一种直或弯曲的革兰氏阳性厌 氧内生芽孢杆菌，后期培养物可变为革兰氏阴性杆菌，菌 体灰白色，呈煎蛋样，中间隆起旧1，卵圆，单个或成对，短 链，偶见长丝状菌体，周生鞭毛，具有运动性。菌体中常有 圆形或卵圆形的巨大芽孢，无孢子外壁和附属丝，形成芽 孢后一端膨大呈鼓锤状，或中部膨大呈梭状或纺锤状。41。 1．2生化特性丁酸菌不水解酪蛋白和明胶，但能使牛 奶变酸、凝固、产气；不分解蛋白质，不产生胺、氨、吲哚、硫 化氢等物质；丁酸菌体内存在着脱氢酶、氢化酶、糖苷酶、 内酰胺酶等酶系，能分解高聚糖(如淀粉、纤维素)；寡聚 糖(如低聚半乳糖、木聚糖)；麦芽糖、甘油、葡萄糖、果糖、 乳糖、木糖、核糖、阿拉伯糖、甘露糖等；丁酸菌不能利用为 毛醇和山梨醇；发酵产物主要有丁酸、乙酸、甲酸、丁醇、乙 醇、氢气、二氧化碳、l，3一丙二醇；DNA的G+C含量为27 —28克分子％∞’61；另人粪便中分离的丁酸菌株一拜氏梭 菌杂交菌株还含有转粘质酶(transliminase)，其能降解肠 道内的果胶酸为中间产物寡聚半乳糖(OA)和4，5一不饱 和半乳糖醛酸(DA)，OA最终分解成挥发性的短链脂肪 酸——乙酸、少量丁酸和甲酸，DA则完全分解为乙酸和甲 r，1 酸‘51。 2丁酸菌的微生态学特性 2．1微生态学效应(1)丁酸菌被服食后在胃液(pH=1 —2)中复活并迅速发育，而后在大肠、盲肠黏膜面增生， 但不会从肠壁吸收入血进入其它器官，最后随肠内物质一 起排出‘“3。 (2)丁酸菌对人畜无毒无害，可抑制肠道内的有害 菌，促进有益菌群(双歧杆菌、乳酸菌、粪杆菌)的发育和 作者简介：冉雪松，内蒙古人，兽医师。 收稿日期：2007一01—10 37 增殖，在肠黏膜表面形成伪膜，抑制肠道内有害菌和腐败 菌葡萄球菌、念珠菌、克雷伯氏菌、变形杆菌、弯曲杆菌、绿 脓杆菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、伤寒沙门氏菌的定植和侵 人，纠正肠道菌群失调。1“。 (3)丁酸菌具有淀粉糖化作用，在肠道内能产生多种 维生素和酶类，例如维生素B族(V。、V舵、叶酸、烟酸)、维 生素K及淀粉酶，这些物质能提高饲料利用率和提供营养 物质，促进动物生长¨⋯，用于人体有益于正常的生理代 谢，尤其对儿童有良好的保健作用。 (4)丁酸菌的主要代谢产物是丁酸，其是肠上皮组织 细胞再生和修复的主要营养物质。 (5)丁酸菌作为微生态制剂功能显著，并能与多种抗 生素配伍使用，对多种抗生素有较强的耐受性，与抗生素 并用时不会影响其生物作用，并能大幅度降低伪膜性肠炎 的发病率¨⋯。 (6)丁酸菌具有很强的耐受性，在体内不受胃酸、消 化酶、胆汁酸等影响，并抑制其它有害物质(胺、氨、吲哚、 硫化氢)的产生。另丁酸菌本身也不分解蛋白质产生胺、 氨、吲哚、硫化氢等有害物质。 2．2药物敏感性丁酸菌具有很强的耐药性，可与某些 抗生素同时使用，不干扰其它细菌感染的治疗㈣o。其对 头孢立新、氨苄青霉素、羟氨苄青霉素、强力霉素、链霉素、 多黏菌素E、沙交霉素、红霉素、洁霉素、环丙沙星中介、阿 米卡星、庆大霉素、磺胺甲硝唑、尤其是氨基糖苷类抗生素 和哔派酸均不敏感，只对新生霉素、先锋霉素、万古霉素、 四环素、氨苄西林、氯霉素、林可霉素、甲硝唑、替硝唑等少 数几种抗生素敏感M’”J。因此，丁酸菌作为微生态制剂在 临床上可与某些抗生素联合应用，避免长期大量应用抗生 素给动物及人类的身体健康带来的危害。 2．3抵抗力丁酸菌是一种专性厌氧芽孢杆菌，微生态 制剂中活菌以芽孢形式存在，与其它非芽孢类益生菌相 比，具有很高的抵抗力，具体表现在以下几个方面： (1)耐热性：丁酸菌经80℃30min；90。C10min；1000C 5min处理后存活率达95％以上旧。。 (2)抗酸性：丁酸菌能在胃液(pH=1—2)中生存，不 万方数据 38 被胃液、胆汁酸、消化液等杀灭。在pH=1．0—5．0时仍能 存活，pH=4．0—9．8适合其发育生长，在pH=3．0的培养 条件下存活率达90％以上，说明丁酸菌具有抗酸性，能顺 利通过胃部到达肠道有效部位发挥作用。 (3)耐干燥：丁酸菌固体活菌制剂在室温、干燥情况 下保存3年以上，未见活菌显著减少。 3丁酸菌的生物功能及应用 丁酸菌制剂是目前国内微生态领域开发的又一新产 品，由于丁酸菌本身的微生态学特性决定其是集乳酸菌和 芽胞杆菌优点于一身的活菌制剂，在临床和实际应用方面 有其独到之处。随着丁酸菌新生物制品四类新药的研制 成功，丁酸菌的一些生物特性和药理作用，受到国内研究 者的普遍关注。 3．1 丁酸菌对肠道菌群的作用 丁酸菌制剂同双歧杆 菌、嗜酸乳杆菌、粪链球菌等其它微生态制剂一样，可用以 治疗肠道感染和肠功能异常，是调节人和动物肠道微生态 平衡的有益菌，其最显著的生物学特性是能与肠道内有益 菌共生并促进有益菌的增殖和发育，特别是它能产生促双 歧杆菌发育的因子¨⋯。株晓慧等Ⅲ1将丁酸菌分别与双歧 杆菌、乳酸菌、粪杆菌进行体外混合培养，结果发现双歧杆 菌、乳酸菌、粪杆菌活菌含量分别比对照组增加24．00％、 42．57％、6．76％。赵熙等¨引通过动物实验和人体受试试 验，对丁酸菌活菌制剂——泰平片对肠道菌群的影响进行 了研究，结果发现受试对象肠道内双歧杆菌数量增加，与 对照相比差异极显著，乳酸菌数量增加，差异显著。另丁 酸菌酪可增加肠内酪酸、醋酸等短链脂肪酸生成量，可促 进排便，抑制肠道内葡萄球菌、念珠菌、克雷伯氏菌、变形 杆菌、弯曲杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、痢疾志贺菌、伤寒沙 门氏菌、霍乱沙门菌、霍乱弧菌等有害和腐败菌的生长繁 殖¨⋯，陆俭等Ⅲ一试验发现丁酸菌对霍乱弧菌具有拮抗作 用。丁酸菌通过促进有益菌和抑制有害菌双重作用纠正 肠道菌群失调，改善肠道内微生态环境，减少肠道疾病的 产生，临床试验本菌剂对腹泻、肠应激综合征、腹部症 状的有效率可达80％以上，对便秘、便稀、胃肠炎的疗效 也有60％一75％，是一良好的整肠微生态药物。 3．2促进生长功能丁酸菌体内存在着蛋白酶I和蛋白 酶Ⅱ及脂肪酶，其能促进动物对脂肪和蛋白质的消化吸 收，丁酸菌还具有氨基酸载体的作用，能转运所有的氨基 酸，但不分解，所有这些都有利于促进动物生长。用蛋白 酶、脂肪酶、糖化酶、乳酸菌、丁酸菌为有效成分制成特效 鱼用饲料添加剂，以0．5％和2％的比例添加到饲料中，饲 喂8周后，饲料效率比无添加剂组高80％和70％，增重率 高120％和115％，并且摄食早，体表黏液分泌多，体色新 鲜，肉质有适量脂肪，味感改善，疾病率和死亡率下降，粪 臭减少且呈类状固体易清除”。。李恕等嵋¨将酪酸菌制剂 用于水产类，结果鱼及特种水产类日增重率提高大约 15％一40％，杂食性鱼类可提高22％以上。用3株乳酸 菌、2株芽孢菌、2株酵母菌、1株光合菌、1株酪酸菌，以麸 皮为主要原料，多菌混合厌氧固态发酵生产出新型微生物 饲料添加剂。后经过养殖试验表明：2％添加量组比对照 组提高日增重8％，提高饲料利用率10％，降低粪便NH， 的含量61％m1。 3．3 生物催化剂 丁酸菌制剂是一种生物催化剂，能有 效的降解饲料中的抗营养因子，消除其抗营养作用，有效 地催化饲料中养分的分解，从而提高饲料利用率，提高饲 料的营养价值。丁酸菌同其它需氧芽孢杆菌一样在消化 道内复活发育的过程中产生活性很强的胞外酶一蛋白 酶、脂肪酶、淀粉酶、糖苷酶等多种酶类，同时还产生降解 植物饲料中非淀粉多糖的酶一果胶酶、纤维素酶、葡聚糖 酶，这些活性酶直接作用于动物消化道的“酶池”，降解 饲料中相应的营养成分，提高饲料中营养成分的消化率， 从而提高蛋白质和能量的利用率，降低料肉比；间接作用 是这些活性酶刺激机体本身酶的活性，从而提高动物的 生产性能，因而丁酸菌微生态制剂又被称之为抗营养因 子克星。 3．4免疫调节功能丁酸菌能激活免疫系统，促进免疫 功能，维持机体的健康状况。给鸡饲喂含丁酸菌菌体的饲 料后，测其血清中NDHI抗体效价的变化，结果显示：摄食 一周后ND—HI的效价迅速上升。傅思武¨钊用酪酸菌一 婴儿双歧杆菌二联活菌制剂对小鼠进行试验，结果30d后 测定发现小鼠抗体生成细胞数增加，说明该制剂具有一定 的免疫调节功能。用2．7×10cfu弧菌感染109重虹鳟鱼， 同时饲喂酪酸菌和白蛋白的试验发现：酪酸菌处理的鱼 肾、肝脏、血液中弧菌数目均少于对照。2．7×10efu(菌落 形成单位)的弧菌感染，109重虹鳟鱼饲喂酪酸菌和白蛋 白的死亡率分别为10％和78％；而2．7×10efu的弧菌 组，死亡率则分别为73％和93％。酪酸菌处理的。肾噬菌 细胞的活力也较高，表明了饲喂酪酸菌提高了虹鳟鱼对弧 菌感染的免疫力‘2⋯。 3．5提供营养元素丁酸菌在发酵过程中能产生葡萄 糖、麦芽糖等6种糖，及维生素E。这些物质直接为动物 提供营养元素，维生素E能强化血管，增强抗病性，激活细 胞，对机体非常重要。以丁酸菌为主要成分制成V。吸收 促进剂对乳用仔牛进行试验，结果发现血清中V。含量呈 上升趋势，与对照组差异显著。用幼鸡试验也得出相似的 结果‘“。 4丁酸茵的培养条件及发酵生产工艺 4．1培养基根据丁酸菌的生长条件要求，王刚’7。，匡 群M1就营养成分中的碳源、氮源、无机盐和微量元素进行 了多重比较分析试验，确定最佳配比比例：营养成分以胰 蛋白胨最佳，其次分别为酪蛋白胨、牛肉蛋白胨、大豆蛋白 胨、蛋白胨；碳源以葡萄糖用量在1．0％一1．5％水平上菌 体生长较好，菌数较高；碳源和氮源的组成及配比对菌数 有明显的影响，在胰蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、牛肉浸膏的 E交叉实验中胰蛋白胨(1．0％)、葡萄糖(1．0％)、酵母膏 (0．5％)、牛肉浸膏(0．3％)按此配比时菌体浓度和芽孢 万方数据 转化率最高；由试验得出无机盐与微量元素的配比对菌体 浓度的影响不大，而对芽孢形成及转化率有密切的关系， 试验得出当无机盐与微量元素按NaCl0．21％、 (NH4)2S040．1％、K2HP040．4％、MgS04·7H200．05％、 MnS04·H200．02％、NaHCO，0．1％、CaC030．1％的最佳 配比时芽孢转化率最大。 4．2培养条件对氧的敏感性：丁酸菌为严格的厌氧菌， 在较低的氧化还原电位下生长良好，运用封石蜡凡士林和 焦性没食子酸法厌氧培养长势很好归o。 酸碱度：pH=7为最佳培养酸碱值，并且用磷酸缓冲 液调节最佳∽o。 温度：丁酸菌最适宜的培养温度为32—40Qc，但在36cc， 37℃，38℃时培养菌数较高，36℃时芽孢转化率最高。 培养时间：培养时间是影响菌落浓度及芽孢成熟率的 重要因素，培养时间过短菌数尚可，但芽孢转化率及成熟 率低；时间过长芽孢转化率和成熟率并无明显提高，反而 出现菌体老化，菌数下降，实验结果表明36h为最佳培养 时间。 接种量：10％为丁酸菌的最佳接种量，接种量大小对 菌体浓度及芽孢转化率有一定的影响，接种量过大则会带 入较多的种子培养期的代谢物，并使菌体前期生长过快， 而使最终菌数下降；接种量过少会使菌体增殖缓慢，延长 培养时间¨o。 加热：对丁酸梭状芽孢杆菌的优选及复壮采用热处理 的方法不仅能激活芽孢，使其尽快萌发，而且还有利于防 止菌体污染¨⋯。 4．3丁酸菌微生态制剂的发酵生产工艺 丁酸菌微生态 制剂生产工艺是在国内最近几年才进行研究，目前发酵培 养液活菌可以达到1．9×109cfu／mL，芽孢转化率达到 95％。生产成本较为低廉，生产工艺基本如下： 培养基原料-溶解一灭菌 保护剂 l tDH入 菌种一活化一接种一发酵控制一发酵液一干燥-．DH填充米斗．．制粒一质检一成品 若用作动物饲料添加剂，则在干燥后，质检包装即可 使用。 5前景展望 微生物添加剂是目前世界各国都在竞相开发的新产 品，饲用微生物添加剂又名益生素、促生素、促菌素、活菌 素，是一类活体微生物制剂。其作为一种新兴的饲料添加 剂，具有无毒、无副作用，通过调整肠道内微生物菌群之间 的优势关系，代谢产生的多种酶、维生素、抗菌素、氨基酸 等物质，从而达到促进动物生长，提高饲料转化率，增强动 物机体免疫功能等作用。目前研究最多的是乳酸菌、双歧 杆菌、芽孢杆菌、酵母菌等，但关于丁酸菌作为饲料添加剂 对动物生产性能及免疫功能影响的国内报道较少，实践证 明丁酸菌微生态制剂具有显著的促生长作用，提高饲料资 源利用水平，显著增强动物机体抵抗疾病的能力，进一步 的研究将促进整个畜牧业向绿色无污染方向发展，具有显 著的经济效益和开发前景。 39 参考文献 [1]FUJITAI，MAEDAA，TAKASHIK．StudiesOntheanti．diarrhealac- tivityOfCtostridiumbutyricumMiyairiII588[J]．JpnPharmacolT— her，1986，14：6073—6080 [2]BENNOY，SAWAK，MITSUOKAT．Theintestinalmicmfloraofin— fants：compositionoffecalflorainbreastfedandbottlefedinfants[J]． Microbiollmmunol，1984，28：975—986 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