脂肪细胞的分化及调控

脂肪细胞的分化及调控 脂肪细胞的分化及调控 摘要：越来越多的研究结果表明脂肪组织不仅仅是被动的能量储存器官,而且是能够分泌多种激素类物质的内分泌器官;脂肪细胞分化及其调控失常与人类多种疾病如肥胖症、糖尿病、脂肪肝、高脂血症及乳腺癌等密切相关。对脂肪细胞分化机制及其调控的研究,不但对于探讨上述重大生命和疾病过程具有重要理论意义,而且对于上述疾病的预防与治疗,特别是对于在细胞和分子水平上筛选针对上述疾病的药物,也具有实际意义。本文从脂肪细胞的起源、前脂肪细胞向脂肪细胞的分化过程、脂肪细胞分化的调控,以及对脂肪细胞分化研究应注意的问等进行了综述,以期对脂肪细胞分化及其调控进行全面总结。 关键词：脂肪细胞;分化;调控 Abstract Fat tissue and adipocytes have been exclusively investigated in the past two decades, especial y in the last ten years, due to the following two reasons. Firstly, more and more studies showed that fat tissue is not only an organ for energy storage, but also an endocrine one that can secret many kinds of hormones or hormone like peptides. Secondly, the established preadipocyte cell lines have been providing powerful tools for the in vitro research of adipocyte differentiation, because these immortal cell lines authentically represent, to a great extend, the in vivo situations of these cells and can be induced to differentiate into mature adipose cells with proper hormones. It has been demonstrated that there exists close relations between adipocyte differentiation and many physiological or pathological processes including saccharide and fat metabolism, energy balance, obesity, diabetes, hyperlipidemia and breast cancer. It is very important to make known the differentiation mechanisms of preadipocyte into adipocyte for understanding the above mentioned diseases and for screening anti obesity and anti diabetes drugs. Key words Adipocyte; Differentiation; Regulation 脂肪组织和脂肪细胞是近二十年特别是近十年人们广泛探索的领域之一。这主要有两个原因:首先,越来越多的研究结果表明脂肪组织不仅仅是动的能量储存器官,而是能分泌多种激素类物质内分泌器官;其次,上世纪七八十年代以来相继建立起来的在合适激素诱导下可以分化成脂肪细的永生化成纤维细胞系,为体外研究脂肪细胞分化提供了有效工具,因为这些永生化的前脂肪细胞在很大程度上真实代表了这类细胞在体内的情。目前已经证明脂肪细胞分化与糖及脂肪代谢、机体能量平衡、与肥胖症、与II型糖尿病、与脂肪和高脂血症及乳腺癌等有非常密切的关系。对脂细胞分化机制及其调控的研究,不但对于探讨上重大生命和疾病过程具有重要理论意义,而且对于上述疾病的预防与治疗,特别是对于在细胞和分子水平上筛选针对上述疾病的药物,也具有实际意义。 一、脂肪细胞的起源 脂肪细胞在体内从什么组织分化而来、从什么时间开始出现,至今还知之不多。1979年Taylor和Jones等用多潜能干细胞诱导分化出了肌肉、软骨和脂肪细胞;1997年Dani等将胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES cell)诱导分化成前脂肪细胞;1999年Pittenger等用骨髓衍生的基质细胞诱导生成骨骼细胞和脂肪细胞。上述结果表明胚胎干细胞或多潜能干细胞可能是脂肪细胞的直接来源。 二、脂肪细胞的分化 人和动物的脂肪组织大约三分之一是脂肪细,其余的三分之二是微血管、神经组织、成纤维细和处于各种不同分化阶段的前脂肪细胞,所以从生态学上对成纤维细胞和前脂肪细胞做出区别,或对处于各种不同分化阶段的前脂肪细胞做出区别比较困难。近二十多年来对脂肪细胞增殖分化及调控方面的研究主要使用体外分化系统。最常用的有种体外培养系统,即前脂肪细胞系(preadipose cell line)和原代前脂肪细胞(primary preadipocyte)。现在经建立起来的最有代表性的两个前脂肪细胞系是小鼠胚胎的Swiss3T3细胞中诱导分化出来的,即T3-F442A和3T3-L1小鼠前脂肪细胞系,二者都能异性地分化成脂肪细胞。经过多年努力,最近界上第一个人的前脂肪细胞系已经建立起来,这是一个从婴儿皮下脂肪组织的血管基底细胞经过特定诱导条件建立起来,在一定的诱导分化条件下,此细胞系的95%的胞都可以分化成成熟的脂肪细胞。除了用上述前脂肪细胞系进行体外增殖分化研究以外,也可以用原代培养的前脂肪细胞进行类似的研究。但是使用原代培养的前脂肪细胞有几个明显的缺点:第一,将脂肪细胞从各种成纤维细胞中分离出来比较困;第二,脂肪组织中前脂肪细胞的含量较少,要得足够的前脂肪细胞需要大量的脂肪组织;第三,原培养的前脂肪细胞在体外培养的时间较短,一般超过7~8代。但使用原代前脂肪细胞也有优势:第一,原代前脂肪细胞是二倍体,能够比非整倍体的细胞更真实地反映体内环境;第二,可以根据不同研究的需要,从不同物种、不同性别、不同年龄的不同位获得前脂肪细胞进行体外培养,更具有真实性针对性。 前脂肪细胞系和原代前脂肪细胞具有分化成成的脂肪细胞的能力。待分化的细胞具有一切正常细胞所具有的包括生长和有丝分裂在内的细胞周期,而开始进入分化的前提就是退出此细胞周期。般将待分化的细胞退出细胞周期的现象称为生长制(growth arrest),脂肪细胞分化也是以生长抑制为前提条件的。生长抑制之前,前脂肪细胞一般历一个细胞汇合(confluence)的阶段,但这种细胞接触并不是脂肪细胞分化的先决条件,比如在无血清培养基中培养的密度较低的鼠原代前脂肪细胞缺少细胞间接触的条件下也能分化。一般认为,脂肪细胞分化前的生长抑制发生于细胞周期的G1期,这时的细胞不但停止生长而且失去了对促有丝分裂介质的反应,称为Gd期。另外,还存在由于缺少生长因子而引起的生长抑制(Gs)和由于缺少营养而引起的生长抑制(Gn),这两种生长抑制也都发生于G1期,但只有抑制于Gd期的细胞能在缺少DNA合成的情况下获得分化表型和能在甲基异丁基黄嘌呤(MIBX)的诱导下增殖,而这两个特征是处于Gs和Gn期的细胞所不具备的。 生长抑制之后,前脂肪细胞在合适的促有丝分裂和促脂肪生成信号(主要是激素类)的作用下,经过至少一轮的DNA复制和细胞加倍(cell doubling),进入一种无性增殖阶段,此过程可称为无性扩增(clonal expansion)。最近的研究进一步证明无性扩增是3T3- L1前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化的必要前提。无性扩增的意义在于细胞通过增殖而为快速分化打下基础。对3T3 -F442A小鼠前脂肪细胞系进行体外培养发现,在培养基中原来都相互分散的细胞,培养一段时间以后有一些就通过增殖而形成了细胞簇,每个细胞簇一般有4~12个细胞,而另外一些则仍然以单个细胞存在。细胞簇中的细胞大多数都积累了脂肪,而单个存在的细胞一般都没有脂肪生成。但来源于人脂肪组织的原代前脂肪细胞的表现有所不同,比如对此细胞的有丝分裂进行抑制并不能影响其向脂肪细胞的分化。这种现象说明无性扩增可能并不是脂肪细胞分化的不可缺少的步骤,至少可以说此步骤对细胞分化的重要性并不是对所有来源的脂肪细胞都是一样的。 经历(或不经历)无性扩增的前脂肪细胞开始表现出脂肪细胞的某些特征,这个阶段可看成是分化的早期阶段。此时都发生了哪些事件以及这些事件的确切顺序,现在还不很清楚;此外对脂肪细胞分化的研究都是在体外进行的,因此细胞分化的模式也受到材料来源、培养基、培养条件等的影响。Ailhaud等认为脂蛋白脂酶(LPL)的表达是脂肪细胞分化的早期标记,LPL的表达预示着脂肪积累的开始。但LPL的表达是在细胞汇合时自然发生的,不受脂肪细胞分化所必需的各种介质是否存在的影响;LPL的表达也不是脂肪细胞所特有的,其它类型的间质细胞如心肌细胞和巨噬细胞也能合成和分泌LPL。以上现象说明LPL只能作为脂肪细胞分化的一个早期参考性标记,而不能作为特异性标记。目前比较普遍接受的是过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptors, PPARs)和CCTTA增强子结合蛋白(CCTTA enhancer binding protein, C/EBP)可以作为脂肪细胞分化的早期标记。者中的主要异构体是脂肪细胞和脂肪组织所特有,它们在前脂肪细胞中就能检测到,在加入诱导分化的激素或介质之后表达迅速增加,在成熟的脂肪胞中达到最高水平。细胞骨架成分和细胞外质成分种类和水平也伴随着脂肪细胞分化的早期段而变化,例如在脂肪细胞分化的早期检测到肌蛋白和微管蛋白表达减少。随着分化的进行,细胞形状也从成纤维细胞形状逐渐变成近圆形和圆形。现在认为细胞形态的变化是分化过程中必须经的一步,而不仅仅是脂类积累的结果。比如,设法断脂肪酸的合成,使脂类积累不能实现,仍可以观到3T3-L1前脂肪细胞经历形态学上的变化,因此细胞形态的变化也是脂肪细胞分化的早期标记之。脂肪细胞分化的早期还有其他一些可能的标,如胶原蛋白表达水平的变化,前脂肪细胞因子pref-1)的表达变化等。 在脂肪细胞分化的晚期阶段,培养基中的脂肪细胞数量显著增加,脂肪积累的速度显著加快,也获了对胰岛素等激素的敏感性。这时最主要的标志和三酰基甘油代谢关系密切的酶的活性显著增,可检测到增加10~100倍。这些酶包括:ATP柠檬酸裂解酶(ATP citrate lyase)、乙酰辅酶A羧化酶acetyle-CoA carboxylase, ACC)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FAS)、3磷酸甘油醛脱氢酶(glycerol 3hosphate dehydrogenase, GPDH)等。此时的其它变化有:葡萄糖运转蛋白和胰岛素受体数目增加;瘦素（leptin)开始合成;某些脂肪组织特有的产物开始合或加速合成,这些物质主要有:脂肪酸结合蛋白aP2)、脂肪酸运转蛋白(FAT/CD36)、脂被蛋白(perilipin)、monobutyrin(一种血管生成介质),以及几种血管紧张素肽原等。 超越脂肪细胞分化特定阶段的细胞必定会进入后的最终分化;一旦进入最终分化,则既不能去分,也不能重新进入有丝分裂。因此,失去增殖能力脂肪细胞进入最终分化的标志。 三、脂肪细胞分化调控 细胞分化的本质是基因表达模式的转变。伴随脂肪生成而发生的细胞脂肪积累和形态学上的改等是由于细胞在分化中特定基因的诱导表达所。从这个意义上来说,转录因子的表达和活性决定了分化过程。对培养的前脂肪细胞系和成纤细胞系的研究获得了很多有关促进脂肪生成和脂肪细胞分化的转录因子的数据,用转基因和基因敲除技术对所建立的细胞模型进行体内研究也取得了一些有意义的结果。目前已鉴定出的对脂肪生成和脂肪细胞分化有直接影响的转录因子主要有三种,即:PPAR、C/EBPs和ADD1/SREBP1。 (一)PPARY PPARY是核激素受体超家族中的一员,为过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptor)。和这类转录因子中的很多成员一样,PPAR必须与其他核激素受体形成二聚体并与DNA结合才能表现出转录活性。PPAR有两种异构体,即PPAR 1和PPAR 2。PPAR 2在N末端比PPAR 1多30个氨基酸,是对脂肪细胞分化具有决定性作用的一个异构体,仅限于在脂肪组织中表达。PPAR 1在脂肪组织中的浓度较低,并且在很多其他类型的细胞和组织中也存在,如巨噬细胞、II型肺炎细胞、结肠上皮细胞,以及膀胱、乳腺和前列腺组织等。PPAR被激活之后,细胞表现出很多相应的生理效应,如形态学变化、脂肪积累以及获得对胰岛素的敏感性等。临床上用PPAR激动剂来处理脂肪瘤,发现此起源于脂肪的恶性组织获得很强的分化能力。这种结果是否意味着可以改善此类患者的症状是目前临床研究的一个热点。最近进行的脂肪生成功能缺失实验证明,在促进脂肪细胞分化方面,PPAR既是必需的也是充分的。Rosen等用ES细胞途径证明了PPAR对脂肪细胞在体内和体外的分化都是必需的。他们用野生型ES细胞和纯合缺失ES细胞获得嵌合小鼠。PPAR基因纯合缺失小鼠在胚胎发育的10天左右死亡,10天以内的小鼠胚胎还没有形成可检测到的脂肪;而正常的小鼠10天以内的胚胎已经可以检测到脂肪的存在。在体外,PPAR基因纯合缺失的ES细胞能分化多种组织,但唯独不能分化成脂肪组织。上述结果充分证明PPAR是体内和体外脂肪生成所必需的。 最近利用PPAR在药理学上的抑制剂进行的研究对上述遗传学研究结果给予了补充。Wright等证明由PPAR激动剂诱导的或由有关激素诱导的脂肪生成作用可以被PPAR拮抗剂所抑制。Barroso等最近在一些严重胰岛素抵抗患者体内发现了PPAR杂合突变体。这些患者的突变等位基因在体外表达时也表现为杂合活性。有趣的是这些患者的体脂含量正常,这表明人体维持脂肪生成和维持胰岛素敏感性所需要的PPAR量是不同的。 (二)C/EBPs C/EBPs是另一类脂肪细胞分化的转录调节因子,为CCTTA增强子结合蛋白生理科学进展2004年第35卷第1期9CCAAT enhancer binding protein),主要有3种同分异体,即C/EBP、C/EBP和C/EBP!。C/EBPs家族分布不仅仅局限于脂肪组织和脂肪细胞,其功能不仅仅涉及脂肪细胞分化,它们还和粒细胞及肝胞的最终分化有关。C/EBP和C/EBP!在脂肪成中的作用是通过转基因的证明的。Yeh证明,不需要激素诱导,C/EBP的外源性表达（ectopic expression)就足以使3T 3- L1前脂肪细胞向脂肪细胞分化,而C/EBP!的外源性表达可以加速脂肪积累。Tanaka等证明缺少C/EBP和C/EBP!者之一的胚胎成纤维细胞的脂肪生成潜力基本正,但当二者同时缺少时,分化成脂肪细胞的过程被重阻断。体内实验也取得了类似的结果。敲除/EBP和C/EBP!二者之一的小鼠具有正常的白脂肪组织,但棕色脂肪组织中脂肪积累表现迟缓;时敲除C/EBP和C/EBP!的小鼠,85%的个体在产期不明原因死亡,存活的15%棕色脂肪组织量减,而白色脂肪组织的量减少较少。体外培养的开始分化的前脂肪细胞系,在分化的早期出现的C/EBP和C/EBP!的瞬时表达,而C/EBP是在化的较晚期阶段才表达的;C/EBP一旦表达,随有大量的脂肪细胞分化的特异基因开始表达。/EBP的过表达可以加速3T3-L1前脂肪细胞向成脂肪细胞的分化,而该基因反义RNA的表达则可阻断此分化过程。C/EBP基因纯合缺失的动物色脂肪组织和棕色脂肪组织都急剧减少。这些结果表明C/EBP可能和脂肪生成有着更直接的关。Prusty等还证明在脂肪生成的早期激活MEK/RK信号途径可以促进C/EBP和PPAR等转录因的表达,从而促进脂肪细胞分化。 C/EBPs家族除上述3个成员外,还有C/EBP?。脂肪细胞的分化过程中C/EBP?的表达受到抑制,而当分化接近结束时C/EBP?的表达又被重新诱导。C/EBP? 作为该家族的一个成员, 其本身不能与DNA结合,但可以与C/EBPs的其他成员结合成聚体,从而抑制被其结合的这些成员的活性。C/EBPs的含量可以在很多水平上调节,包括转录水、转录后水平和翻译水平。 (三)ADD1/SREBP1脂肪细胞决定与分化因子(ADD1)属于基础螺旋-线圈-螺旋(basic helixloop helix)转录因子家族的一个成员,此转录因子家调节特异组织中的基因表达,特别是起源于中胚的脂肪组织和肌肉组织。此因子最优先在棕色脂肪组织中表达,其次是肝、白色脂肪组织和肾。ADD1又称为甾醇调节元件结合蛋白1(sterol regulatory element binding protein 1,SREBP1)。Kim等发现诱导培养的前脂肪细胞系向脂肪细胞分化时,编码此蛋白的mRNA水平急剧升高;在诱导分化的激素存在时,3T3-L1细胞中ADD1/SREBP1的过表达可导致脂肪细胞标志物表达量的提高和脂肪的大量积累。ADD1/SREBP1影响脂肪生成的机制还不是很清楚,但种种迹象表明与PPAR有关。ADD1/SREBP1和PPAR共表达可显著提高系统的转录活性,而ADD1/SREBP1的单独表达则效果很小。二者的关系可能是ADD1/SREBP1的表达产生了某些能提高PPAR活性的因子。Kim等的实验结果也支持这一观点:ADD1/SREBP1基因杂合能导致脂肪细胞分化的阻断,而加入PPAR配体TZD后分化完全恢复。这些结果表明ADD1/SREBP1是通过影响内源性PPAR配体的生产而对脂肪细胞分化产生作用的。Fajas等最近提出PPAR本身就是ADD1/SREBP1作用的一个靶基因。已经比较肯定的是ADD1/SREBP1在体内可以调节很多和脂肪生成有关的基因的表达,如LPL、FAS、磷酸甘油酰基转移酶(GPAF)等。综上所述可以将各转录因子与脂肪细胞分化的关系总结如图1。图1脂肪生成过程中各转录因子的功能及相互关系(箭头表示有激活或促进表达作用)除上述几个转录水平上的调节因子以外,影响脂肪生成和脂肪细胞分化的因子很多,如生长激素(GH)、胰岛素、类胰岛素生长因子1(IGF 1)、糖皮质激素(glucocorticoid)、前列腺素(PG)、肿瘤坏死因子(TNF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子10生理科学进展2004年第35卷第1期TGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(BFGF)、瘦素、视黄酸(RA)、三典甲腺原氨酸(triiodothyronine)、环腺苷酸(cAMP)、甲基异丁基黄嘌呤等。这些影响有促进分化的,也有抑制化的;有直接作用,也有间接作用;可以单独作用,可以协同作用。总之,它们对脂肪生成和脂肪细分化的影响很复杂,对其机制的阐明也需要一个期的过程。 四、脂肪细胞分化研究中存在的问题 利用前脂肪细胞系开展的研究对脂肪细胞分化调控有了很多认识,但应该注意到的是以前脂肪胞系为模型进行的相关研究也有一些缺点:细胞非整倍体状态可能会影响细胞的分化竞争能力;体外培养的前脂肪细胞系失去了其体内的固有环;体内不同部位的脂肪细胞表现出各不相同的生理特点,而体外培养的前脂肪细胞系不能反映出这差异;在体内白色脂肪组织存在于很多部位,如脏器周围(perigonadal)、网膜(omental)、腹膜(retroperitoneal)以及皮下(subcutaneous)等,从身体不同部位离出的前脂肪细胞其分化成脂肪细胞的能力各不同;体内不同部位的成熟脂肪细胞的代谢行为也不相同,比如,内脏脂肪和皮下脂肪对肾上腺素刺的脂肪分解的反应就不一样。脂肪细胞表现行为位置差异具有极大的临床意义:内脏脂肪含量升的成人(主要为男性)往往比体重较重但主要是皮脂肪较多者具有更高的患胰岛素抵抗、高脂血症心血管疾病等的危险性。当然,尽管应用前脂肪胞系研究脂肪生成和脂肪细胞分化有上述种种限,与其它细胞类型比较,它还是相对更能代表其在内的真实情况,因此到目前为止是不可代替的用研究脂肪生成、脂肪细胞分化、肥胖及II型糖尿的发生机制的有力工具。另一个应该引起关注的问题是,上述细胞系都只能分化成白色脂肪组织,而哺乳类动物还有另类脂肪细胞即棕色脂肪细胞,其主要功能是消耗量而不是储存能量。棕色脂肪组织对能量的消耗由一种叫做解链蛋白1(UCP 1)的脂肪组织特异蛋白质参与完成的,其机制是通过解除呼吸链中电子传递而建立起来的跨膜质子梯度而释放能。从生理上讲,棕色脂肪组织的功能是适应寒冷防止肥胖。体外培养的棕色脂肪细胞模型也是有,但这些细胞不像白色脂肪细胞模型那样比较真地代表其在体内的生理状况,因此对棕色脂肪的究也比较滞后。加强对棕色脂肪组织和棕色脂肪细胞的研究,对于全面理解人及动物的脂肪细胞及其功能,脂肪细胞分化机制及其调控,将具有重要意义。 参考文献 1.细胞和分子生物学/魏保生主编/编写傲视鼎考试与辅导高分研究组.-北京：科学出版社，2004.04    182页；26cm.-(医学考研专业基础课和专业课突破系列) 2.细胞生理学/(美)吉斯(A.C.Giese)著/高天礼译.-北京：科学出版社，1984   706页；26cm 3.细胞世界探索/上海细胞生物学研究所.-上海：上海科学技术出版社，1983.03    267页；19cm.-(现代自然科学普及丛书)