General基因芯片技术及其在食品安全检测中的应用

中国国境卫生检疫杂志2007年4月第30卷第2期ChineseFrontierHealthQuarantineApr.2007,Vol30,No.2 21世纪,随着人类基因组计划(HumanGenomic Project,HGP)的完成,后基因组时代揭开了序幕,人 类正从结构基因组学(structuralgenomics)进入功能 基因组学 (functionalgenomies)和功能蛋白质组学 (functionalproteomics)时代。自从1992年Afymetfix 公司首次合成第1块基因芯片以来,在之后的十几 年里该技术以其具有高通量、平行性、微型化、自动 化、快速灵敏、样品用量少等显著特点被广泛应用。 基因芯片技术作为21世纪生物技术的重要发展,在 许多领域均显示出了巨大应用价值。近几年基因芯 片技术也开始在食品安全检测中运用,现将基因芯 片在食品安全检测中的运用进行综述[1]。 1 基因芯片技术 1.1 技术简介 1.1.1 概念 基因芯片,又称 DNA微探针阵列 (Microarray),是生物芯片的一种[2]。基因芯片产生的 基础是分子生物学、微电子技术、高分子化学合成技 术、激光技术和计算机科学的发展及其有机结合[3]。 1.1.2 原理 基因芯片原理根据核酸的分子杂交衍 生而来,即应用固体基因面上集成已知序列的基 因探针对未知序列的核酸序列进行杂交检测。样品 与探针杂交后,再通过激光共聚焦荧光检测系统等对 芯片进行扫描。计算机系统对每一探针上的荧光信 号作比较和杂交探针位置的检测,分析得出结果,实 现基因信息的快速检测[4]。其检测的步骤如下[5]: 样品处理、扩增、然后标记的靶基因与固化处理 的基因芯片进行核酸杂交、洗涤、检测信息、数据处 理、综合信息处理。 1.2 基因芯片分类 据不同分类,基因芯片的 分类方法很多: (1)根据固相支持物的不同,DNA芯片分为无机 (玻璃、硅片等)和有机(聚丙烯膜、硝酸纤维素膜等)芯片。 (2)根据探针核酸种类的不同分为寡核苷酸芯 片和cDNA芯片。 (3)根据芯片点样方式不同,可分为原位合成芯 片、微矩阵芯片和电定位芯片3类。 (4)根据用途的不同分类为基因表达芯片、基因 测序芯片、诊断芯片、指纹图谱芯片等。 1.3 基因芯片技术的基本过程 基因芯片技术主要 包括 4个基本要点:芯片方阵的构建、样品的制备、 固相杂交反应和芯片信号的检测。 1.3.1 基因芯片的制备 微阵列的构建,建立微阵 列的方法有多种。对芯片的介质表面进行氨基化、硅 烷化或二硫键修饰处理是基因芯片技术的重要组成 部分[6]。利用基因芯片点样仪,将引物及探针DNA分 子点涂在经过修饰的玻片等载体上,即制成芯片。主 要有光导原位合成法和合成后点样法[7]。原位合成法 是目前构建高密度寡核苷酸芯片最为成功的方法,直 接在芯片上用 4种核苷酸合成所需探针制备而成。 合成后点样法比原位合成法简单,可利用多个微细 〔综述〕 基因芯片技术及其在食品安全检测中的应用 张高祥 陈一资 黄小波 (四川农业大学动物科技学院,雅安 625014) 摘要 基因芯片技术是一种多学科交叉融合产生的高新技术,该技术具有快速、准确、重复性好等特点,在食品安 全检测中的运用越来越广泛。为此,对基因芯片技术及该技术在转基因食品、食品微生物、食品原料、食品营养成分 检测研究中的基本原理、方法和应用、存在的问题、解决方法与发展方向进行综述。 关键词 基因芯片;食品安全;检测 〔中图分类号〕 R155.5;T20 〔文献标识码〕 A TheApplicationoftheGeneChipTechniqueinFoodSafetyDetection ZhangGaoxiang,ChenYizi,HuangXiaobo.Collegeof VeterinaryScience,SichuanAgriculturalUniversity,Ya'an625014,China [Abstract] Thegenechiptechniqueisahighandnewtechniquewhichdevelopsfrommuti-subject,ithasbeenappliedmoreand morewidelyforaccuratedetectionoffoodsafetybecauseofitscharacterofrapid,accuracyandrepeatalle.Thisarticlewasfocusedon themechanism,methodandapplicationofthedetectionaboutfoodmicrobes,foodtransgenicingredient,rawmaterialoffoodandthe ingredientoffoodnutrition.Inaddition,theexistedquestions,theresolvedmeasuresandthedevelopingwaysofgenechiptechnology infooddetectionwerereviewed. [Keywords] Genechip;Foodsafety;Detection 125· · dell 打字机 dell 高亮 dell 高亮 dell 高亮 dell 高亮 dell 高亮 dell 高亮 dell 高亮 dell 高亮 dell 高亮 dell 高亮 dell 高亮 中国国境卫生检疫杂志2007年4月第30卷第4期ChineseFrontierHealthQuarantineApr.2007,Vol30,No.2 加样针的点样仪将预先制备好的寡核苷酸或 DNA 探针快速、准确地定量点样于芯片表面。 1.3.2 基因芯片标记 生物样品含有许多复杂的生 物分子,为了提高检测结果的准确性,样品必须经过 生物处理获取其中的DNA或RNA,经PCR或RT— PCR扩增并掺入荧光燃料(如Cy3、Cy5等)标记后才可 以和芯片起反应。目前普遍采用的是荧光标记法。随 着纳米技术的发展,最近发展的纳米金标记,通过银 放大后可直接在肉眼或普通光学显微镜下观察。最终 再用相关软件进行信号的分析处理,得出待测样品的 核酸信息[10],显示了比荧光标记更加灵敏的优势。 1.3.3 杂交反应 影响杂交的因素很多,芯片杂交 条件的优化主要根据探针的类型、长度以及研究目 的来确定;但主要是时间,温度及缓冲液的盐浓度。 如果是表达检测,需要长时、低温和高盐条件,较严 谨性杂交。如果是突变检测,则短时、高温和低盐条 件的高严谨性杂交[11]。 1.3.4 杂交图谱的检测与读出 DNA探针大多采用 荧光标记,常用荧光标记法———扫描同焦显微镜检 测,该系统利用激光从芯片背面射入。然后聚焦于 芯片的杂交反应面上,芯片上的荧光标记物被激发 出荧光,经聚焦后,根据荧光信号强弱进入检测器- 激光共聚焦显微镜。通过计算机专业软件分析得出 二维杂交信号图,即芯片图谱。 2 基因芯片在食品检测中的应用 2.1 细菌检测 细菌污染是食品最常见的污染。因 此,食品中病原性细菌检测是食品卫生安全检测中 一个重要的方面。细菌对食品污染,不但会造成巨大 的经济损失,致病细菌的存在还会严重威胁人类的 健康[12]。传统的细菌培养需要复杂的营养条件,种属 鉴定与抗生素敏感试验所需的培养法耗时较长。基 因芯片技术细菌检测,在PCR基础上的病原检测系 统的应用,大大缩短了诊断时间,使那些不能培养或 很难培养的细菌也得到快速诊断。 Anthony等[13]人建立了1个在4h以内致病细菌的 快速诊断方法。他们运用该法对158例经血培养鉴定 为阳性的样品进行检测,结果符合率为79.7%。Carl[14]等 在对4种细菌,即大肠埃希菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、空 肠弯曲菌采用了基因芯片的检测方法,其检测结果不 仅敏感度高于传统方法,且操作简单,重复性好,并节 省了大量时间,大大提高了4种细菌诊断效率。 选择从水、食品和临床样品中分离有关致病菌 或卫生指标菌,并以沙门菌、志贺菌和大肠埃希菌的 标准菌株作对照,观察基因芯片检测致病菌的敏感 性、特异性,并与常规检测方法、PCR检测方法作对 比。结果表明,采用基因芯片技术几乎可以检测上述 所有的细菌,检测结果与传统方法符合率为98%,与 PCR检测结果的一致性为96.3%。基因芯片技术检 测时间约4h;而PCR检测需要8h;传统的方法需要 25d。基因芯片技术引入微生物检测领域为建立快捷 高效的检测方法提供了技术平台,用于食品、水质中 常见细菌/霉菌检测的基因芯片已经问世[15]。该技术 还可以用于食物中毒及临床样品中致病菌的快速诊 断、分子流行病学调查等,具有广阔的应用前景和较 大的经济与社会效益[16]。 2.2 病毒的检测 病毒由1个DNA芯子和1个蛋白 外壳组成。按宿主不同主要分为植物病毒、动物病毒。 其中与人类最密切相关的是动物病毒,特别是一些能 为人类提供主要肉食来源的动物。人们捕杀或食用了 带病毒的动物而使人类感染患病,如疯牛病病毒、口 蹄疫病毒、SARS病毒,又如近几年在东南亚各国爆发 的禽流感,除引起禽类大量死亡外,也使数十人感染 身亡。由于目前人类掌握的医疗技术还不能有效地治 疗病毒性疾病,所以对于这些可通过饮食传播,并会 传染给人的病毒的有效检测就成为预防和控制疾病 的首要措施,基因芯片技术是近几年运用的病毒检测 新技术之一。现在世界各国都在积极地进行能够对人 类构成危害的各种病毒快速检测芯片的研究[17]。杨素 等[18]用分子克隆方法获得口蹄疫病毒、水泡性口炎病 毒、蓝舌病病毒、鹿流行性出血热病毒和赤羽病病毒 各一段高度保守的基因片段,可同时诊断上述5种动 物传染病,此方法不但快速、准确、敏感,而且可同时 进行多种病毒的检测。周琦 [19]等也研制出用于检测 SARS病毒的全基因芯片,共660条病毒探针,覆盖了 SARS冠状病毒的全部序列,应用该基因芯片可对病 人、出入境食品、动植物及其产品进行检测。 2.3 对转基因食品和食品原料的检测 2.3.1 转基因源食品 基因修饰食品,又被称为转基 因食品或基因工程食品。在欧盟新型食品条例中将 基因修饰食品定义为:“一种由经基因修饰的生物体 生产的或该物质本身的食品。”具体包括2类:包含 基因修饰组分的食品和食品基料;由基因修饰生物 生产,但并不包含基因修饰组分的食品。我国及菲律 宾利用转基因技术培育出“超级水稻”和“超超级水 稻”。我国培养生长速度快、节约饵料的转基因鱼上 万尾。上海医学遗传研究所与复旦大学合作的转基 因羊的乳汁中含有人的凝血因子,既可以食用,又可 以药用,为通过动物廉价生产人类的珍贵药物迈出 了重大的一步[20]。转基因食品开始进入我们的生活。 2.3.2 转基因食品的安全性 对于转基因食品的安 全问题目前还有较大的争论,且目前还没有通用的 检测方法,而基因芯片技术可以快捷准确地对其检 测。将目前通用的基因、抗性基因、启动子和终 126· · dell 高亮 dell 高亮 dell 高亮 dell 下划线 dell 下划线 中国国境卫生检疫杂志2007年4月第30卷第2期ChineseFrontierHealthQuarantineApr.2007,Vol30,No.2 止子的特异片断制成检测芯片与待测产品的 DNA 进行杂交,就可以判断待测样品是否为转基因产品。 基因芯片技术不但可对转基因食品进行定性检测, 还可以定量的检测其种类。利用该技术既可检测食 用成品,也可检测鲜活的动植物材料。其灵敏性好、 自动化程度高、特异性强、假阳性低、简便快速及准 确率高是一门极有发展前途的技术[21]。该技术可靠 性已被对大豆、玉米、油菜、棉花等农作物样品的检 测结果所证实。另外,利用该技术也可以筛选转基因 所需要的目的基因[22]。在农业上,基因芯片筛选发生 基因突变的食品原料作物;寻找高产、抗虫、抗病、经 济价值高的作物,进行农药的筛选;检测各种作物的 基因组;通过比较差异表达寻找新基因。 2.4 对食品营养成分等的检测 基因芯片技术在食 品中的应用成为新的研究领域,利用基因芯片技术 研究食品的营养成分,营养素与蛋白和基因表达的 关系,将为揭示肥胖的发生机理和预防打下基础。 Wodicka[23]采Affymetrix公司制作的酵母基因表达型 芯片,对在营养丰富及营养贫乏2种培养基中生长 的酵母细胞的基因表达情况进行了分析,发现结构 及核糖体蛋白基因的表达基本稳定,与培养基营养 丰富与否关系不大。但是,一些目前尚未阐明功能基 因的表达是与培养基营养状态有关。在营养缺乏时, 有 140个基因表达增加;而在营养丰富时,有 36个 基因表达较多。Lvakhovith等[24]应用 DNA芯片技术 检测1,25一二羟维生素D3处里过的乳腺癌细胞的 FGF-7的表达,发现无论在 mRNA水平还是蛋白水 平都有明显的增加,从而首次揭示了维生素D可能 通过调节FGF-7的表达而调节细胞的生长分化。 3 结论 尽管基因芯片技术已经取得了长足的发展,在 食品安全的检测中得到越来越多的运用,但仍然存 在着许多问题。DNA芯片技术需要昂贵的尖端仪器, 探针合成和集成操作复杂,对样品进行一定程度的 扩增,以便提高检测的灵敏度,目标分子的标记是一 个重要的限速步骤,如何简化或绕过这一步现在仍 然是个问题,当前多数方法使用荧光法进行检测和 分析,重复性较好,但灵敏仍然不高等问题尚需解 决。基因芯片技术还有许多不完善的地方,其产业化 还需要时间和资金的投入,但由于它在食品安全检 测中具有高通量,平行性,自动化等优点,随着国家 对高科技、新兴产业越来越重视,对芯片技术的投资 正在加大,DNA芯片技术会更成熟,生产和应用的成 本逐渐降低,在食品的生产、流通、安全检测等方面 的应用会越来越多[25]。 参 考 文 献 1 武瑞,连学昭.基因芯片技术在中药研究中的应用[J].中兽医医药 杂志,2005,24(1):21-23 2 JosephW.FromDNAbiosensorstogenechips[J].NucleicAcidsRes, 2000,28:3011-3016 3 张宝珠.基因芯片技术[J].实验室科学,2005,(4)2:126 4 邓平建.基因芯片技术(上)[J].中国公共卫生,2001,17(8):719-721 5 包文奇,崔迎旭.基因芯片技术在预防兽医学中的应用[J].河南农业 科学,2004,(10):78 6 孙啸,王晔,张晓莉,等.基因芯片设计及数据分析软件系统[J].东 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