人肠道病毒71型动物模型研究进展

2010 年 6 月 第 18 卷 第 3 期 中国实验动物学报 ACTA LABORATORIUM ANIMALIS SCIENTIA SINICA June，2010 Vol. 18 No. 3 檵檵檵檵檵 檵檵檵檵檵 殝 殝殝 殝 综述·进展 人肠道病毒71 型动物模型研究进展 刘江宁1，张连峰1，2 (1. 中国医学科学院实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021; 2. 中国医学科学院实验动物研究所，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021) 【摘要】 人肠道病毒 71 型是婴幼儿手足口病的致病原之一，其严重的并发症可导致神经系统疾病，甚至死 亡，是近期威胁中国儿童健康的因素之一。目前尚无临床疫苗可以预防该病毒感染，而 EV71 的动物模型是进行致 病机理、疫苗和药物等研究的基础。本文对 EV71 的两种常用动物模型:小鼠和猕猴(Macaca mulatta)模型进 行了描述，并对其在研究中的应用给与概括，为研究者选择合适的动物模型提供了依据。 【关键词】 人肠道病毒 71 型;手足口病;模型，动物 【中图分类号】R-322 【文献标识码】A 【文章编号】1005-4847(2010)03-S5-05 Human Enterovirus 71 Infection in Experimental animals LIU Jiang-ning1，ZHANG Lian-feng1，2 (1. Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health;Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS)＆ Comparative Medicine Centre， Peking Union Medical Collage (PUMC)，Beijing 100021，China;2. Key Laboratory of Human Diseases Animal Models，State administration of Traditional Chinese Medicine;Institute of Laboratory Animal Science， CAMS ＆ Comparative Medicine Centre，PUMC，Beijing 100021) ［基金项目］十一五传染病专项支持(2009ZX10004-402)。 ［作者简介］刘江宁(1981 －)，助理研究员，研究方向:传染病的动物模型。E-mail:ljn_zb03038@ 126. com ［通讯作者］张连峰。E-mail:Zhanglf@ cnilas. org 【Abstract】 Human enterovirus 71 (EV71)is one of the major pathogens causing hand，foot and mouth disease in children. The serious complications can lead to neurological symptoms and even death. EV71 is one of the factors threatening the health of Chinese children recently. However，there is currently no vaccine available to prevent clinical infection of this virus. As animl models are the foundation for pathogenesis studies，vaccine and drug research on EV71 infection，in this paper，two commonly used animal model for EV71，mouse and rhesus monkey，are described and their applications in research are summarized.，to provide fundamentall information for researchers in selection of a suitable animal model. 【Key words】 Human Enterovirus 71;Hand，foot and mouth disease;Model，animal 1969 年，研究者首次从患有中枢神经系统疾病 的婴 儿 粪 便 标 本 中 分 离 得 到 肠 道 病 毒 71 型 (Enterovirus 71，EV71)，Schmidt 等［1］1974 年鉴定。 EV71 病毒属于微小病毒科肠道病毒属，为单股正链 RNA 病毒［2］。1974 年以来，EV71 病毒曾在世界范围 内多次暴发，主要引起婴幼儿(0 ～ 6 岁)手足口病 (HFMD)和无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样 的麻痹等多种与神经系统相关的疾病，而中枢神经系 统感染导致的肺水肿、肺出血和心肌炎，使其致残和 病死率较高。每次疫情暴发，均会夺走许多婴幼儿的 生命［3］。到目前为止，临床上尚无预防 EV71 病毒感 染的疫苗或针对性治疗药物，理想的动物模型是解决 以上问题的关键之一，本综述对 EV71 病毒在中国的 流行特点，现有的动物模型及其应用进行了概括。 1 EV71 病毒流行特点及中国疫情 根据病毒的 VP1 基因序列，EV71 可分为 A、B 和 C 三种基因型，包含 A、B1-B5 和 C1-C5 共 11 个 中国实验动物学报 2010 年 6 月第 18 卷第 3 期 Acta Lab Anim Sci Sin，June，2010，Vol. 18. No. 3 S6 亚型［4］。在 1997 ～ 2005 年马来西亚的暴发中，重症 EV71 感染以 C1、C2、B3、B4 和 B5 亚型为主［4］。在 1999 ～ 2007 年，澳大利亚的重症 EV71 感染以 C1 亚 型为主［5］。2004 年台湾首次出现了 C4 亚型毒株的 流行，2006 ～ 2007 年间，台湾的 EV71 暴发以 B5 和 C5 亚型为主［6］。而中国的 EV71 暴发主要以 C4 亚 型为主，偶尔有 C5 亚型感染的报道［7］。EV71 不同 型毒株之间，在毒力方面并无明显差异，各种基因型 的 EV71 均有引发严重症状的报道［8］。 1997 年以来，EV71 病毒的流行在亚太地区呈 上升趋势［4，6，7］。1981 年，我国在上海发现手足口 病，随后北京、河北、天津、福建、吉林、山东、湖北、广 东和安徽等十几个省(市)相继出现疫情。2008 年 EV71 导致的手足口病疫情在多个省市暴发，2009 年 1 ～ 4 月，全国累计手足口病例 115 618 例， 重症 773 例，死亡 50 例，由于死亡的都是婴幼儿， 引起很大的社会恐慌。李仁清等［9］分析了北京 2006 ～ 2008 年间的流行毒株的序列，发现北京地区 流行的 EV71 仍然是 C4 亚型，并且在同一时期的不 同地区、不同来源和不同疾病状态下分离的毒株在 VP1 序列上无明显差别。但是随着时间推移，核苷 酸变异的不断积累，有出现新亚型毒株的可能。 2 EV71 病毒的动物模型 2. 1 小鼠模型 EV71 感染的 1 日龄新生 ICR 或 BALB / c 小鼠 是最为常见的 EV71 模型动物。临床分离毒株对肌 肉组织的噬性高于脑组织，临床分离株经过小鼠体 内扶强后，可以引发神经症状，甚至可以感染 1 周龄 或两周龄的小鼠。 Chumakov 等［10］使用 B1 亚型的保加利亚临床 分离株感染 1 日龄的新生小鼠，可引发瘫痪和肌炎 及肌纤维坏死。Arita 等［11］将 B1 亚型的 EV71 毒株 在 NOD /SCID 小鼠颅内传代扶强，分离到了一株 NOD /SCID 小鼠适应毒株，该毒株感染 3 ～ 4 周龄的 NOD /SCID 小鼠后，可以使其表现出后肢麻痹。 Chua 等［12］将 B3 亚型的澳大利亚临床分离株 在 BALB / c 小鼠颅内扶强，扶强后的毒株感染 1 ～ 7 日龄 BALB / c 小鼠，引发了严重的致死症状，骨骼肌 是病毒的主要复制位点，病毒侵染引发严重的坏死 性肌炎。Chan 等［13］用 B3 和 B4 亚型的 EV71 作为 出发毒株，建立了 1 日龄 ICR 小鼠的感染模型，对小 鼠进行颅内病毒感染后，小鼠均出现明显的体重增 长减缓，而 B3 亚型毒株感染 2 d 后可观察到嗜睡和 运动不协调症状，部分小鼠四肢肿胀并伴随死亡，未 发现后肢麻痹症状，而未死亡的小鼠在感染 6 d 后， 上述症状全部消失，恢复正常。Chen 等［14］用 C2 亚 型的小鼠适应株通过灌胃感染 1 日龄的 ICR 小鼠，2 d 后，小鼠可出现皮肤病变，一般在 4 ～ 7 d 后出现后 肢麻痹，7 ～ 9 d 后死亡，病理观察发现了脑部的淋 巴细胞浸润。随后，Wang 等［15］将上述 C2 亚型毒株 在 1 日龄的 ICR 小鼠颅内 4 次传代扶强后，得到 MP4 菌株。扶强菌株在体内外的毒力均比出发菌 株增强，且扶强后的毒株可通过灌胃法感染 7 日龄 ICR 小鼠，导致其后肢麻痹，并在 5 ～ 9 d 内死亡。 病理观察到了感染小鼠的脑干与脊髓中神经元消失 和凋亡，四肢肌肉大面积坏死。感染早期，可在小鼠 的小肠内检测到病毒复制，而病毒的主要复制位点 是在肌肉、脊髓与脑中。同时，MP4 感染小鼠后，可 发生同窝之间的交叉感染现象。 Ong 等［16］使用 B3 亚型的小鼠适应株，通过灌 胃与注射感染 2 周龄的 ICR 小鼠，小鼠感染后表现 出脑脊髓炎等与人类似的神经症状，感染小鼠的前 角神经元、三叉神经运动核和脑干网状结构的神经 元中病毒数量最多，脑的其他部位也有少量的神经 元被感染。该模型是迄今为止，能感染 EV71 病毒 的年龄最大的正常小鼠。Wu 等［17］将新分离的 EV71 的 neu 毒株在 Vero 细胞中进行两轮培养，得 到 YN3 毒株，其通过腹腔感染新生 ICR 小鼠时表现 出较高的毒力，可致新生的 ICR 小鼠后肢麻痹，最 终死亡。 中国大陆地区的 EV71 流行株主要属于 C4 亚 型，而实验动物普遍对该毒株不敏感，导致多数病毒 株感染动物后，不能表现出明显的临床症状。朵建 英等［18］通过腹腔注射对 1 日龄的 ICR 小鼠进行病 毒感染，随后在脑、肺、骨骼肌与小肠中检测到了病 毒复制，绘制了病毒在骨骼肌内的复制曲线，并联合 组织的病理变化，建立了我国流行的 C4 亚型毒株 的小鼠模型。 2. 2 非人灵长类模型 口服 EV71 病毒不能使猕猴产生严重的神经症 状，猕猴免疫与攻毒多使用椎管或静脉注射接 种［19，20］。Chumakov 等［10］使用保加利亚临床分离 株感染猕猴之后，可使猕猴发生瘫痪，神经系统出现 类似于脊髓灰质炎的病变。Nagata 等［19］分别用 5 种 EV71 的临床分离株(患者分别患有脑炎，脑膜炎 S7 中国实验动物学报 2010 年 6 月第 18 卷第 3 期 Acta Lab Anim Sci Sin，June，2010，Vol. 18. No. 3 和手足口病)，通过椎管注射对猕猴(5 ～ 13 岁，成年 雌性)进行病毒感染，1 ～ 6 d 后，猕猴均表现出了神 经症状:迟缓性麻痹、震颤和共济失调，免疫组化证 实了病毒在脊髓、脑干、小脑皮层、齿状核和大脑中 的复制。随后，Nagata 等［20］进一步建立了静脉注射 感染猕猴的模型，猕猴(6 ～ 17 岁，成年雌性)感染病 毒后，具有与人脑炎类似的临床体征与神经病理表 现，包括震颤、共济失调和脑水肿，但没有发生诸如 肺水肿和心脏衰竭之类的神经源性并发症。值得注 意的是，许多 EV71 病毒的临床分离株对猕猴感染 时，表现出了较低的神经毒性［21］。国内未见使用猴 建立感染模型的报道。 3 动物模型的应用 3. 1 病毒在体内的传递及致病机制研究 病毒在体内的传播途径，是发病机制研究的焦 点之一。Chen 等［14］用 C2 亚型小鼠适应株通过灌 胃感染小鼠，组织内病毒滴度实验表明，病毒首先在 小肠内复制并引发病毒血症，随后依次传播到脊髓 的胸段、颈段和脑干中，推测病毒利用逆向轴突的传 递的方式进入脑内复制，这一点与脊髓灰质炎病毒 类似。随后，Chen 等［22］通过灌胃、肌内注射和颅内 注射三种方式对 7 日龄小鼠进行感染后，均导致脑 部感染、松弛型麻痹、肺功能失调和死亡。然而，不 同的感染方式影响了疾病进展和发生神经症状的概 率，与其他两种感染方式相比，颅内注射感染，可导 致小鼠的死亡提前发生，表明从病毒接种到病毒传 递到颅内的时间长短，决定了疾病发生的潜伏期长 短。虽然灌胃感染可引发病毒血症，但是不引发明 显的神经症状，预示着血液运输并不是病毒传递的 主要方式。后肢感染病毒后，首先会在脊髓的腰段 检测到病毒，随后传递到脊髓的颈段，最后抵达脑 部;而上肢感染病毒后，则首先在脊髓的颈段检测到 病毒，从而得出 EV71 病毒依赖神经元逆向传递的 结论。Ong 等［16］发现，通过肌内注射感染 2 周龄小 鼠，病毒进入骨骼肌后，通过运动神经感染附近的中 枢神经，并在中枢神经系统内传递。 关于 EV71 病毒的致病机理，目前尚不清楚。 病毒感染引发的严重神经症状，普遍被认为是病毒 在脑组织的复制引起的。然而，随后的解剖数据表 明，许多患者体内的病毒复制与病变部位并不一致， 并推测宿主免疫系统在发病过程中扮演了重要的角 色［23］。Hashimoto 等［24］用临床分离的毒株经皮下 注射感染猕猴，结果一半的猕猴感染后表现出临床 症状:后肢麻痹或衰弱。病理分析发现了神经系统 和血管的病变，以及脊髓、延髓、大脑和脑干灰质中 的神经元变性消失和炎细胞侵润。但是，在这些部 位均未发现病毒复制，而血清中 EV71 抗体的浓度 却显著升高，这预示着除了病毒复制以外，可能存在 其他致病机制，如免疫过激或交叉免疫反应等［25］。 3. 2 疫苗评价 预防 EV71 病毒感染的疫苗，均处于研究阶段， 目前尚无临床上可以使用的疫苗。猕猴模型中，因 为可以感染病毒的猕猴年龄较高，可以用做疫苗的 自体免疫评价。Arita 等［26］使用减毒的 A 型 EV71 病毒做为疫苗，对猕猴进行免疫，45 d 后经静脉注 射进行攻毒，免疫后的猕猴没有表现出症状，且其血 清对不同亚型的 EV71 毒株(A、B1、B4、C2 和 C4)具 有广谱性的中和作用。然而，从减毒毒株接种的猕 猴脊索中，分离到了活病毒，表明弱毒株仍具有一定 的神经侵染性，并引发了猕猴的震颤等微弱的神经 症状。 由于小鼠对 EV71 病毒的敏感期较短，限制了 其在疫苗评价中的使用。目前，国际上多采用对雌 鼠或母鼠免疫，疫苗产生的抗体可以通过胎盘屏障 传递给幼鼠，随后对幼鼠进行病毒感染，从而间接的 评价母源抗体对幼鼠的保护作用。使用此类方法评 价的疫苗，包括灭活的病毒、病毒结构类似物、VP1 蛋白及 VP1 的 DNA 疫苗。Wu 等［17］比较了灭活全 病毒疫苗、VP1 的 DNA 疫苗和 VP1 蛋白对雌鼠免 疫后，母源抗体对幼鼠的保护能力。雌鼠经灭活病 毒免疫后，再交配产下的的幼鼠，经 2300LD50的病 毒剂量感染时，存活率达到 80%，而母鼠经 VP1 蛋 白的 DNA 疫苗和 VP1 蛋白免疫后产下的的幼鼠， 在 230 LD50的病毒剂量感染时，存活率分别为 40% 和 80%，指出灭活全病毒作为疫苗具有最佳的保护 效果。Chung 等［27］表达并纯化了 EV71 病毒类似 物—VLP，VLP 模仿了全病毒的形状、衣壳蛋白结构 和蛋白组成。免疫后的 BALB / c 母鼠产下的幼鼠， 在受到 EV71 病毒(1000 LD50)攻击时，存活率可以 达到 89%，其保护活性大于变性的 VLP 蛋白和热灭 活的 EV71 病毒。 Ong 等［28］使用 2 周龄 ICR 小鼠的感染模型，对 甲醛灭活的全病毒疫苗进行了自体免疫评价。对 1 日龄的新生鼠进行初次免疫，7 d 后进行加强免疫。 加强免疫 7 d 后的幼鼠进行病毒感染，结果均未表 中国实验动物学报 2010 年 6 月第 18 卷第 3 期 Acta Lab Anim Sci Sin，June，2010，Vol. 18. No. 3 S8 现出症状，各组织也未检测到病毒。 3. 3 药物筛选 抑制 EV71 病毒的药物研究，多处于细胞水平 上，在动物模型中对于药物治疗效果进行验证的报 道并不多见，概因为感染病毒的幼鼠存在年龄过低、 感染周期短和不宜进行给药等缺点。Li 等［29］对 12 ～ 14 d 的 ICR 小鼠进行腹腔注射感染病毒，感染后 2 h 开始腹腔注射利巴韦林药物，每日剂量为 100 mg /(kg·bw)，持续给药 9 d，发现利巴韦林可以通过 抑制组织内的病毒复制，来降低小鼠在面临病毒感 染时的发病率、致死率(致死率降低到 30%)和麻痹 后遗症。Liu 等［30］研究了 I 型 IFNs 对病毒感染的 幼鼠的治疗效果，对 3 日龄的 ICR 小鼠进行腹腔注 射攻毒，感染 2 ～ 3 d 后注射地塞米松(I 型 IFNs 的 抑制剂)，会加剧临床症状，增加组织内病毒滴度。 而在病毒感染前 12 h 注射 IFN 素的诱导剂，则会提 高成活率和降低组织内病毒滴度。注射 I 型 IFN 的 抗体，则会提高死亡率和组织内病毒滴度。并且，在 感染病毒后的 3 d 内，连续 3 d 注射 IFN-αA，则会使 幼鼠存活。Weng 等［31］发现，牛乳铁蛋白在小鼠体 内具有抗病毒效果，它可以延缓麻痹，降低死亡率。 但是治疗组的死亡率依然达到了 70%，表明其体内 治疗效果微弱。 4 展望 EV71 病毒被认为是脊髓灰质炎病毒被扑灭后， 目前最重要的嗜神经性肠道病毒。然而，由于该病 毒的流行地区主要是经济不发达的亚太地区，不能 引起发达国家的足够重视，导致其研究进展不够迅 速。关于 EV71 病毒感染的致病机理，目前尚不清 楚;没有临床上可以使用的疫苗和针对性治疗药物， 使疫情在很长时间内难以得到缓解，而解决上述问 题的关键，是建立理想的模型。猴模型虽然可以满 足上述要求，但是价格昂贵，不适合大规模药物筛选 研究;目前小鼠的感染年龄过低，感染周期短，限制 了其在疫苗的自体免疫评价和药物筛选中的应用。 而进一步提高可感染病毒的小鼠年龄，甚至建立成 年小鼠的感染模型，有望解决上述问题。 中国大陆地区手足口病疫情的病源主要是 C4 亚型毒株，但是，该亚型的毒株对于实验动物普遍敏 感性不高，导致目前尚未见可以使被感染动物发病， 甚至死亡的模型报道。进一步提高病毒对动物的噬 性，或改善动物对病毒的敏感性，有望解决这一问 题。 参 考 文 献 ［1 ］ Schmidt NJ， Lennette EH， Ho HH. 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