基因克隆技术

基因克隆技术 周国岭　杨光圣　傅廷栋 (华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室 ,武汉 430070) 摘要 　综述了基因克隆常用技术包括图位克隆法、转座子或 T2DNA 标签法、同源序列法、表达序列标签 ( EST)法和差异表达基因分离方法的原理、应用、应用的潜力和限制因素。 关键词 　基因克隆 ;图位克隆 ;转座子标签 ; T2DNA 标签 ;同源序列 ; EST ;差异表达基因 中图法分类号 　Q 785 　　人类基因组计划 ( HGP) 的迅速进展及几种模 式生物基因组测序的相继完成为人类提供了大量的 基因组信息 ,这已成为人类探索生命奥秘的入手点 , 同时也为后基因组时代提供了更富有挑战性的任 务。基因组学时代的主要任务是图谱制作和序列测 定 ,后基因组学时代则是进行基因组功能注释 (genome annotation) ,这也是功能基因组学的主要 研究目标[1 ,2 ] 。但如何利用这些研究成果为人类服 务 ,基因则是一个重要的资源。克隆化基因不仅可 以用来兴旺生命科学工业 (如制药业等) ,改良农作 物、畜禽品种等 ,还可以对遗传性疾病进行基因治 疗 ,探索疾病的分子机制和生物发育调控规律。由 于基因组计划要耗费大量人力、物力、财力 ,所以并 非每一种生物都可以拿来测序 ,而且模式生物的基 因有时并不能直接用于其它生物 ,因而克隆其它生 物中对人类有益的基因也变得日益重要。随着基因 专利权的建立和完善 ,基因争夺大战的硝烟日益弥 漫全球 ,克隆基因似乎有着一本万利的诱惑力。在 这样一个大环境下 ,克隆基因的技术也随着分子生 物学发展的步伐而日臻完善和多样化。在传统遗传 学 (正向遗传学) 占主导地位的时代 ,人们以基因产 物为导向来分离克隆基因 (功能克隆) 。由于基因产 物的结构、功能已知 ,可通过分析部分多肽或末端氨 基酸序列 ,反推其核苷酸序列 ,设计探针或引物从基 因组 DNA 文库或 cDNA 文库中筛选克隆 (如玉米 组蛋白脱乙酰酶 HD2 基因的分离[3 ]) ,也可以制备 产物抗体 ,从表达载体构建的 cDNA 文库中筛选相 应克隆 ,进而分离目的基因。功能克隆受限于蛋白 质的分离纯化技术 ,在大部分基因产物的结构功能 未知的情况下 ,人们不得不从另外的角度去寻求突 破。近年来 ,反向遗传学 ( reverse genetics) 的建立 , 为分离未知产物的基因提供了越来越多的策略和思 路。 1 　图位克隆技术 ( map2ba sed cloning or po sitional cloning) 　　随着各种生物分子标记连锁图的相继建立和越 来越多的基因被定位 ,90 年代初 ,图位克隆技术也 应运而生。其基本工作思路为 :首先将目的基因精 确定位在分子标记连锁图上 ,利用与目的基因紧密 连锁的标记筛选大片段 DNA 文库 (如 YAC、BAC、 TAC、PAC 或 cosmid 文库) ,并构建含目的基因区域 的精细物理图谱 ,利用该物理图谱采用染色体步行 (chromosome walking)的方法逐步逼近目的基因 (如 人的 N PC1 基因的克隆[4 ]和拟南芥的 W I GGU M 基因的克隆[5 ]) 。若侧翼标记与目的基因连锁十分 紧密或共分离 ,无需步移就可直接着陆 ,获得含目的 基因的大片段克隆 ,再将大片段克隆作亚克隆分析 或用大片段克隆作探针筛选 cDNA 文库 ,从而将目 的基因确定于 1 个较小的 DNA 片段上 ,进一步作 序列分析和目的基因功能鉴定。基因组 DNA BAC 或 PAC 克隆末端序列的分离是图位克隆中很重要 的一步 , Yang 等利用 BAC 或 PAC 载体的特有酶切 位点 Not Ⅰ或 S f i Ⅰ和 BAC 片段内的多酶切位点 ( EcoR ⅴ、 Hpa Ⅰ、S t u Ⅰ、 X m n Ⅰ) 进 行 双酶切 ,然后与质粒载体连接 ,进行锚定PCR来分 收稿日期 :2001205204 周国岭 ,女 ,1978 年生 ,华中农业大学农学系在读硕士生. 武汉 430070 第 20 卷 第 6 期 2001 年 　12 月 华 　中 　农 　业 　大 　学 　学 　报 Journal of Huazhong Agricultural University Vol. 20 　No. 6 Dec. 2001 ,584～592 © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 离 BAC 的长末端序列[6 ] ,发展了一种高效快速的方 法。图位克隆法首先被应用于模式植物拟南芥 ( A rabidopsis thaliana) ,1992 年 Giraudat 等成功分 离了与拟南芥种子形成和发芽相关的脱落酸信号传 导基因 AB I3 [7 ] ,Arondel 等则分离到拟南芥的ω - 3 脂肪酸脱饱和酶基因 FA D3 [8 ] 。由于抗性性状的遗 传行为简单 ,表型易鉴定 ,而人的遗传性疾病也有这 个特点且人类高密度的分子标记连锁图已建立 ,所 以图位克隆技术在分离植物抗性基因和与人的遗传 性疾病相关的基因上取得了很大的成功。如番茄抗 霜霉病基因 Pto[9 ] 、水稻抗白叶枯病基因 Xa21[10 ] 、 小麦抗线虫基因 Cre3 [11 ]及 200 多个与人遗传性疾 病相关基因的克隆等。 利用图位克隆法克隆基因不仅需要构建完整的 基因组文库 ,建立饱和的分子标记连锁图和完善的 遗传转化体系 ,而且还要进行大量的测序工作 ,所以 对基因组大、标记数目不多、重复序列较多的生物采 用此法不仅投资大 ,而且效率低。因而图位克隆法 仅局限应用在人类、拟南芥、水稻、番茄等图谱饱和 生物上。随着比较基因组学的发展 ,人们意识到要 充分利用图谱饱和生物的遗传信息服务于其它生 物。我们可以利用同科异种间染色体共线性或同线 性 ,通过比较基因组分析和染色体着陆 ,将控制该物 种有关性状的基因或分子标记直接定位在它的分子 标记连锁图中。如利用小麦与水稻基因组间的同线 性 ,Sarma 等将小麦控制开花时间的基因 ( V rn ) 和 控制谷粒硬度的基因 ( Ha) 定位在第 5 组染色体 上[12 ] 。通过大鼠与人的比较基因组分析 ,Scharf 等 定位了 SMA 的一个候选修饰基因 H4 F5 [13 ] 。这些 进展不仅为更快捷地克隆基因创造了条件 ,而且拓 宽了图位克隆法的应用范围。已有人开始利用水稻 的图谱信息筛选水稻小麦同线区的 BAC 或 YAC , 用于测序以搜索候选基因[12 ] 。而且随着越来越多 的 Q TL 被定位在分子标记连锁图上 ,也使人们有 可能通过图位克隆法来分离贡献率大的 Q TL 来改 良生物性状。 2 　转座子或 T2DNA 标签法 (transpo2 son or T2DNA tagging method) 　　同源或异源的转座子或 T2DNA 可以插入到基 因组中导致基因结构的变化 ,从而产生突变基因型。 从 1987 年 Feldman 等将 T2DNA 作为一种基因标签 来筛选突变体以来[14 ] ,迄今为止在植物上已获得了 拟南芥、番茄、玉米、水稻、金鱼草等的转座子插入诱 变和拟南芥等 T - DNA 插入诱变的突变群体 ,从而 为克隆基因创造了条件。此法的基本程序为 :首先 进行突变体的诱变和鉴定工作 ,然后以转座子或 T2 DNA 作为标签 DNA 制成探针或引物 ,筛选突变体 基因组文库 ,用反义 PCR ( IPCR) 技术分离出标签 DNA 两侧目的基因部分序列 ,再依据序列设计探针 或引物筛选野生型基因组文库 ,即可分离出完整的 基因 ,最后用基因互补测验检测其功能。在植物中 利用的转座子系统有 :Ac/ Ds、En/ Spm、Mutator 等 , 其中以 Ac/ Ds 双因子系统利用最多。Johal 和 Bridgs 利用转座子标签法克隆到玉米抗圆斑病基因 HML [15 ] ,这是第 1 个克隆的功能产物未知的植物 抗病基因。Jones 等利用 Ac/ Ds 系统克隆了番茄抗 叶霉病的基因 Cf29 [16 ] ,Aarts 等利用 En/ Spm 系统 克隆了拟南芥的 1 个雄性不育基因[17 ] , Cui 等利用 Mutator 转座子克隆了玉米 T2胞质 1 个核恢复基因 rf 2 [18 ] 。1990 年 Yanofsky 等利用 T2DNA 标签法 克隆到 1 个调节花器官 (柱头和雄蕊)发育基因的转 录因子的基因 A G[19 ] 。1999 年 Puzio 等则用 T2 DNA 标签法从拟南芥中分离到 1 个与抗线虫有关 的基因[20 ] 。 由于有些植物存在内源转座子 ,像金鱼草、玉 米、拟南芥 ,因而利用和植物本身同源的转座子转座 就不能区分真正标签基因的转座子 ,所以转座子标 签多用异源植物。另外大多数转座子转座频率不 585　第 6 期 周国岭等 : 基因克隆技术 　 © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 高 ,拷贝数过多 ,导致诱变频率很低 ,这使大多数植 物很难获得转座子突变体 ,而且亲本之一必须含有 转座子或要通过转基因或杂交进行转座子引入 ,从 而限制了它的应用。而对于那些要在特定环境或特 定发育阶段才能有突变表型的基因 ,往往由于看不 到明显的突变表型而被忽略 ,大基因组中以基因家 族形式存在的基因 ,由于基因的功能补偿 ,若 1 个或 一部分基因家族成员发生了插入突变 ,也可能看不 到突变表型 ,因而转座子或 T - DNA 标签仅限于分 离克隆那些有明显插入突变表型的基因。鉴于此 , 现在又发展了一种转座子捕捉 (t ransposon traps) [21 ] 的手段来捕捉那些无表型突变的基因 ,包括有增强 子捕捉和基因捕捉 2 种类型。 由于 DNA 测序技术飞速发展 ,大量的基因序 列信息展现在人们面前 ,新的未知功能的基因不断 被发现 ,利用转座子或 T - DNA 标签鉴定基因的生 物学功能得到越来越广泛的应用。但它的一个突出 问题是要进行大量突变体的筛选[22 ,23 ] ,以前所用的 PCR[24 ,25 ]虽然很容易鉴定突变体 ,但要对数以千计 的材料进行 PCR ,工作量仍很大。1998 年 Winkler 等采用 DNA 混合池和杂交策略进行突变体筛 选[26 ] ,大大减少了 PCR 次数 ,从而使工作量减轻很 多。另外要对如此之多的突变体进行生产繁殖也是 一件花费人力物力的事。 3 　同源序列法 (homology2ba sed can2 didate gene method) 　　随着人们对基因认识的不断深入 ,人们发现几 乎所有的基因与其它的基因都有一定的联系。人们 将功能相似来自相同始祖的基因归为一个家族 ,基 因家族的成员往往成簇存在 ,几个基因家族组成一 个超基因家族 ,超基因家族各成员之间既有高度同 源区域 ,也有高度趋异区域 , 如原癌基因 (onco2 gene) 、同源异型 (homeotic) 基因、肌球蛋白 (myosin) 基因等。人们根据基因家族成员所编码的蛋白质结 构中具有保守氨基酸序列的特点 ,发展了一条快捷 克隆基因家族成员的新途径 ———基于同源序列的侯 选基因法。其基本思路为 :首先根据基因家族各成 员间保守氨基酸序列设计简并引物 ,并用简并引物 对含有目的基因的 DNA 文库进行 PCR 扩增 ,再对 PCR 扩增产物进行扩增、克隆和功能鉴定。如植物 抗病基因具有以下保守氨基酸序列 :核苷酸结合位 点 ( nucleotide binding site , NBS) ,富亮氨酸重复序 列 (leucine rich repeat ,L RR) ,丝氨酸苏氨酸蛋白激 酶 ( serine - threorine kinase , ST K) , 亮氨酸拉链 (leucine zipper , L Z) , 跨膜结构 ( t ransmembrane , TM)等。国内不少学者根据抗性基因的保守序列 设计简并引物扩增植物 DNA 文库 ,从获得的抗性 克隆中找到了一些新的抗性侯选基因 [27 ,28 ,29 ]。 Pavesi 等根据谷氨酸脱氢酶基因 ( GD H) 结构中某 些序列在物种中的保守性设计简并引物进行 RT - PCR ,利用扩增产物制备探针筛选龙须菜 cDNA 文 库 ,得到 GD H 的全长 cDNA[30 ] 。对于同源性很高 的基因 ,可以直接用作探针进行非严谨性杂交筛选 另一物种的 DNA 文库。如 Gao 等用豌豆淀粉合成 酶基因 ( S S Ⅱ) 的 cDNA 作探针筛选小麦的 cDNA 文库 ,得到小麦 S S Ⅱa 的 cDNA[31 ] 。Funkenstein 等用红海鲷和红鳟鱼的生长激素 ( GH) 基因的 cD2 NA 筛选 gsb 的 cDNA 文库 ,得到 gsb GH 的 cDNA 克隆[32 ] 。Almuly 等用 gsb GH 的 cDNA 筛选 gsb 的 基因组文库 ,进一步克隆了 gsb GH 基因[33 ] 。 该方法自提出以来 ,引起了国内外学者的广泛 重视 ,发展很迅速 ,但有些问题是值得重视和思考 的 : ①由于密码子的简并性和不同同源序列间同源 程度的差异 ,简并引物的特异性要设计得当。②由 于某些同源序列并不专属于某一基因家族 ,因而扩 增产物不一定是某一基因家族成员。③基因家族成 员往往成簇存在 ,克隆的基因片段是否为目的基因 尚需进一步判断。因此对 PCR 扩增产物和克隆产 物 ,有必要进行基因与性状共分离分析 ,插入失活或 685 　　 华 中 农 业 大 学 学 报 第 20 卷 　 © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 遗传转化等功能鉴定工作 ,以便最终筛选到目的基 因。 4 　表达序列标签法 ( expre ssed se2 quence tagging method , EST) 　　1990 年以来的人类基因组计划和其它模式生 物的基因组计划在基因序列、定位、表达和功能研究 上积累了大量的数据 ,怎样利用它们更快捷 ,更经济 地克隆基因 ,一直吸引着人们的视线 ,利用计算机协 助克隆基因 (silicon cloning)逐渐成为克隆基因中不 可缺少的部分 ,如同源性比较、计算机辅助结构、功 能分析、引物设计等。EST 是完整基因上能够特异 性标记基因的一部分序列 ,通常包含了基因足够的 结构信息区 ,从而与其它基因相区分 ,大规模 EST 克隆和 EST 资料库的建立[34 ,35 ] ,为利用生物信息 学克隆基因提供了条件。该方法的基本过程为 : ① 对已知的部分序列进行数据库分析 ,筛选出代表新 基因的 EST 及相应的重叠群 ,定位信息等 ,根据所 得信息设计引物 ,制备探针。②用探针进行 cDNA 文库筛选 ,得 cDNA 阳性克隆 ,接着用设计引物与所 得 cDNA 阳性克隆载体臂进行巢式 PCR 和 5’、3’ - RACE ,得 5’端和 3’端部分序列 (约 400 bp) 。③ 对所得阳性克隆和末端序列进行测序。④通过数据 库对新序列进行分析 ,包括与已知基因的同源性分 析、拼接延伸、ORF 识别、结构分析、翻译蛋白质分 析等。⑤若第一步有新 EST 的定位信息 ,即可对基 因进行定位和结构分析 ;若无定位信息 ,还要筛选基 因组文库 ,进行测序和 FISH 定位等工作。⑥最后 对发现的新基因进行突变检测和表达分析。 该方法是建立在大量已有的生物信息资源基础 上的 ,同时结合了目前的新技术 ,为大规模克隆基因 提供了捷径 ,但前提是手头要有已知的序列。目前 , 国际上相当数量的基因分离是从分析同源 EST 开 始的。如田芳等探讨了如何用 EST 法发现、克隆肿 瘤基因[36 ] ,Okano 等利用此法克隆到一族新的哺乳 动物的 DNA 52胞苷甲基转移酶基因[37 ] 。Dymock 等通过 EST 数据库分析克隆到细胞分裂素的 1 个 跨膜受体基因 GCR1 [38 ] 。Vasmatzis 等通过 EST 数 据库分析发现了 3 个在前列腺中特异表达的基因 , 可以用于前列腺癌的基因治疗[39 ] 。 5 　差异表达基因的分离方法 ( differ2 entially expre ssed gene cloning meth2 ods) 　　生物体的生长发育衰老过程是遗传信息有序的 时空表达的结果 ,因而分离差异表达基因将是认识 生命活动过程的入手点 ,只有以此为基础 ,才能深入 理解基因的结构、功能、表达与调控。而差异表达基 因的分离方法也伴随分子生物学技术的发展由单一 化发展为多元化 ,而且呈各种方法互相结合的趋势。 分离差异表达基因的 3 种基本方法为 :差式筛 选 ( differential screening[40 ] ) 、扣除杂交 ( subtraction hybridization[41 ,42 ,43 ]) 、差异展示反转录 PCR (differ2 ential display reverse transcription PCR , DDRT - PCR[44 ]) 。差式筛选法是分别从有特异表达基因的 目标样 (target sample , TS ,以下简称 TS) 和无特异 表达基因的参照样 ( reference sample , RS ,以下简称 RS)中提取 mRNA ,反转录为 cDNA ,并构建 Ts 的 cDNA 文库 ,分别将从 TS 和 RS 中提取 mRNA 制成 cDNA 探针 ,分别用 TS 和 RS 的 cDNA 探针与 Ts cDNA 文库的菌落或噬菌斑作原位杂交 ,选出只与 TS杂交 ,而不与 RS 杂交的克隆即为 Ts 特异表达 的克隆。此法常要经过多轮菌斑杂交 ,不仅费力费 钱 ,重复性差 ,而且灵敏度很低。扣除杂交则是用 TS 提取的 mRNA 反转录成 cDNA 探针与 RS 的过 量 mRNA 或 cDNA 杂交 ,经两轮充分杂交后 ,移去 杂交分子和过量的 RS 的 mRNA 或 cDNA ,将不形 成杂交体的 TS 的 cDNA 纯化富集 ,扩增 ,建立相应 cDNA 文库即为差异表达基因 cDNA 文库。但此法 回收 cDNA 量有限 ,重复性差 ,灵敏度低。DDRT - PCR 则是分别用 TS 和 RS 的总 mRNA 作模板 ,利 用 12 个可能的锚定引物 T11 MN 锚定 mRNA 的 polyA 末端 ,借助逆转录酶合成 cDNA 第一链 ,得 mRNA/ cDNA ,再用相同的 3’锚定引物和 5’端随机 引物分别扩增 TS、RS 的 mRNA/ cDNA ,扩增产物 用序列胶电泳分析差异表达情况 ,将差异带 DNA 回收 ,可进一步鉴定分析 ,最终获得差异表达基因。 它与前二者相比 ,速度快 ,易操作 ,可以鉴定低丰度 差异表达的 mRNA ,分析 2 种以上样品基因的差异 表达等优点 ,但仍存在假阳性率高、重复性差、扩增 片段短等问题。DDRT - PCR 自提出以来 ,也在不 断地加以改进和发展 ,力求不断完善[45 ,46 ] 。 PCR 技术的发展和新技术的出现为差异表达 785　第 6 期 周国岭等 : 基因克隆技术 　 © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 基因的分离方法注入了新的活力。如在差式筛选中 引入 PCR[47 ,48 ] ,不仅提高了效率 ,还降低了假阳性 率。1993 年 Lisitsyn 等将 PCR 引入扣除杂交 ,发展 了扣除扩增。同时用特异引物结合法在 PCR 中主动选择扩增差异 cDNA ,形成了代表性差示分 析 法 ( representational difference analysis , RDA) [49 \ 〗。1996 年 Diatchenko 等采用抑制性 PCR 选择性扩增差异基因片段 ,即利用 DNA 链内退火 优先于链间退火 ,使非目的序列在退火时产生发夹 式互补结构 ,无法与引物配对 ,从而选择性抑制非目 的基因片段的扩增 ,由此提出了抑制性差减杂交 PCR 法 ( suppression subtraction hybridization , SSH) [50 ] 。另外也有人就在主动选择差异基因片段 上动脑筋 ,如采用粘性限制性酶切位点[51 ] ,抗生蛋 白链菌素包被磁珠分离和酶切保护[52 ]等方法主动 选择差异片段。Straus 等受 cDNA 扣除杂交的启 发 ,提出了基因组扣除方案[53 ] ,若研究的基因存在 该基因缺失的突变体 ,就可以用变性的野生型基因 组 DNA 与缺失基因组 DNA 进行扣除杂交 ,纯化出 “多出来的那个片段”。然后设计接头引物进行扩增 富集 ,制备探针筛选基因组 DNA 文库。只是基因 组 DNA 为双链 ,存在自我复性问题 ,降低了每轮杂 交中对差异片段的富集速度 ,因而需经多轮扣除杂 交。以上这些方法在具体操作中 ,也会将其中 2 种 结合使用 ,如差式筛选和扣除杂交 ,先通过扣除杂 交 ,找出大部分单链差异基因片段 ,对这些单链差异 基因片段再建 cDNA 文库 ,通过对这种文库的差式 筛选 ,找到差异表达基因 ,不仅减少了工作量 ,也提 高了灵敏度。Kang 等利用扣除杂交后的 RNA 或 DNA 样品进行 DDRT - PCR ,发展了交互式差减差 异 RNA 显示 (reciprocal subtraction differential RNA display , RSDD) 技术[54 ] 。它结合了扣除杂交和 DDRT - PCR 的优点 ,成为一种高效、快速分离差异 表达基因的方法。而为了适应于对大量基因进行全 面、系统的差异分析 ,cDNA 微列阵 (cDNA microar2 ray) 、DNA 芯片 (DNA chip) [55 ,56 ,57 ]和综合性基因 鉴定 ( Integrated procedure for gene identification , IPGI) [58 ] 技术也开始建立起来。下面对 RDA、 SSH、RSDD3 种方法作一下详细介绍。 5. 1 　代表性差示分析法 (RDA) RDA 的操作过程如图 3 所示。 1)制备扩增子。提取 TS 和 RS 的 mRNA 并反 转录制备双链 cDNA 即 tester cDNA 和 driver cD2 NA 。然后用限制性内切酶切 ,将酶切片段装上接 头 ,末端补平后 ,加入接头引物进行 PCR 扩增。 2)扣除杂交。去除接头后仅对 tester 片段加上 新的接头 ,用过量的 driver cDNA 与之杂交退火 ,将 形成三种产物 : tester/ tester、tester/ driver、driver/ driver。 3)特异性片段的扩增。末端补平后 ,加入新接 头引物进行 PCR。3 种产物中仅自身退火形成的 tester/ tester 两端均能和新引物配对而呈指数扩增 , tester/ driver 仅一端可和新引物配对而呈线性扩增 , Driver/ driver 无引物配对不扩增。然后用绿豆核酸 酶去除单链 DNA 分子 ,再进行 PCR 富集特异表达 cDNA 片段。 4)对特异片段进行克隆 ,通过 FISH 等技术进 一步分离特异表达基因。 该法可用于分离与生理条件改变相关的基因及 不同发育阶段差异表达的基因。Hubank 等利用 cDNA RDA 技术找到了激活 V (D) J 重组的基因 RA G21 和 RA G22 ,并在 Pre2B 细胞系 1～8 中分离 到一些在咖啡因作用下上调表达的克隆[59 ] 。朱玉 贤等用 cDNA RDA 法比较 GA 处理和未经 GA 处理 的豌豆细胞内基因表达差异 ,发现该豌豆细胞内有 数个被 GA 特异性抑制的 mRNA ,并克隆了其中分 子量最大的片段 PGA S 123 [60 ] 。湛凤凰等应用 cD2 NA RDA 法分离到 4 个在鼻咽癌中缺失的片段 ,可 能为具抑癌功能的已知基因或新基因[61 ] 。Fu 等用 此法克隆到一在巨噬细胞中上调表达的新基因 DL M21 [62 ] 。此法具有高效、敏感、阳性率高的特 点。但两处理样间若存在较大差异 ,或某些基因在 TS 中存在上调表达 ,效果则不十分理想。 5. 2 　抑制性差减杂交 PCR 法 ( SSH) SSH 的基本流程如图 4 所示。 1)第 1 次杂交。提取 TS 和 RS 的 mRNA 反转 录为 tester cDNA 和 driver cDNA ,用 RsaI 或 Hae Ⅲ 酶切成平头末端 cDNA ,分成均等 2 份 ,分别加不同 的接头 ,再分别与过量的 driver cDNA 杂交 ,将形成 4 种产物 :a ,单链 tester cDNA、b ,自身退火的 tester/ tester 双链、c ,异源退火 tester/ driver 双链、d ,driver cDNA。 2) 第 2 次杂交。合并 2 份杂交产物 ,加入新的 变性 driver cDNA 退火、杂交 ,这次除了 a、b、c、d 4 种产物外还形成产物 e ,e 是 tester 自身退火形成 , 885 　　 华 中 农 业 大 学 学 报 第 20 卷 　 © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 图 3 　RDA[ 49 ] Fig. 3 　RDA 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 图 4 　SSH[ 50 ] Fig. 4 　SSH 图 5 　RSDD[ 54 ]) Fig. 5 　RSDD 但两端带不同接头。 3)特异性片段的扩增。末端补平后 ,先后加接 头的内、外侧引物扩增 ,a 和 d 无扩增 ,b 由于两端接 头互补形成发夹结构也无扩增 ,c 仅一端有引物结 合呈线性扩增 ,仅 e 两端可配不同引物而呈指数扩 增。 4)特异性片段 e 克隆 ,并进一步分离差异表达 基因。 985　第 6 期 周国岭等 : 基因克隆技术 　 © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 该法通过 2 次杂交和 2 次 PCR ,使假阳性率可 降到 6 %[63 ] ,且灵敏度高。用 SSH 可一次同时分离 几十至几百个差异基因 ,使效率大增。但由于 SSH 需 mRNA 量大 (几微克) ,对 mRNA 来源困难的材 料不利。因为 SSH 对不同材料或材料间存在小片 段缺失不能有效检测 ,所以研究材料的差异不能太 大。SSH 主要集中在肿瘤基因的克隆上 ,也有用于 细胞凋亡研究的[50 ] 。Zhang 等用 SSH 法克隆到人 视网膜簇状蛋白的 1 个新基因 ———CL UL I 基 因[64 ] 。 5. 3 　交互差减差异 RNA 显示 (RSDD) RSDD 的主要过程如图 5 所示。 1)交互差减。分别提取具有差异表达的 2 种组 织细胞 A、B 的 mRNA ,反转录为 cDNA ,并构建 cD2 NA 文库。将这 2 个文库进行交互差减得到 A 减 B 和 B 减 A 的 2 个差减 cDNA 文库 ,由于构建文库所 用的噬菌体载体上带有质粒载体的结构 ,载体进入 宿主后 ,其上质粒载体被切下 ,得质粒 cDNA 文库。 2)差异显示。用 3’2锚定引物和 5’2随机引物 对 2 个差减文库提取的 DNA 分别进行 PCR 扩增 , 将扩增产物用 5 %序列胶电泳 ,显示并分离差异条 带 ,回收差异 DNA ,再次扩增后 ,获得富集的差异表 达片段。 3) 表达分析。采用反向 Northern 分析和 Northern 分析鉴定经再次扩增的差异 DNA 片段的 真伪。反向 Northern 分析是将差异显示得到的扩 增后 DNA 片段转膜 ,分别与来自 A、B 细胞系的总 mRNA 经反转录制备的32 P 标记的 cDNA 第一条链 探针进行杂交 ,只与亲本来源细胞系杂交 ,而不与另 一细胞系杂交的即为真正差异表达的基因。 4)对差异片段克隆、测序 ,并进一步分离获得差 异表达的基因。 RSSD 可以有效快速地鉴定由于细胞生理变化 而在基因组中差异表达的基因 ,它结合了 DDRT - PCR 和扣除杂交的优点 ,减少或消除了共有序列 , 使序列胶上条带清晰度增加 ,并使低丰度序列得到 富集 ,降低了假阳性率 ,且 RSDD 仅用较少的引物 进行逆转录 PCR 就可分析全部差异表达基因 ,但 RSSD 并不能完全杜绝假阳性。Kang 等用 RSDD 法克隆并证实了促进肿瘤发展的基因 ( PEGene) 和 抑制肿瘤发展的基因 ( PS Gene) [54 ] 。 基因克隆的技术发展很快 ,种类也越来越多 ,但 每一种方法都有它的优势和劣势及适用范围和限制 因素 ,因而我们必须根据所克隆基因的类型和实际 条件选择最佳的方案。随着各种知识的积累 ,克隆 基因的技术也逐步完善 ,速度效率也不断提高 ,相信 人类终将掌握大规模、快捷、经济基因克隆的技术。 参 　考 　文 　献 1 　李子银 ,陈受宜. 植物的功能—基因组学研究进展. 遗传 ,2000 ,22 (1) :57～60 2 　解　涛 ,梁卫平 ,丁达夫. 后基因组时代的基因组功能注释. 生物 化学与生物物理进展 , 2000 ,27 (2) : 166～170 3 　Lusser A , Brosch G , Loidl A , et al. 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