Caveolin1在骨肉瘤中的表达及其意义

Caveolin1在骨肉瘤中的达及其意义 Caveolin1在骨肉瘤中的表达及其意义 作者：郭贵明，吕智，刘彦宾 作者单位：(山西医科大学第二医院骨科，山西 太原 030001) 【摘要】 目的 观察Caveolin1在骨肉瘤中的分布和表达情况，Caveolin1在骨肉瘤临床诊断、治疗及预后评价中的意义。方法 采用免疫组织化学SP法检测39 例骨肉瘤组和22 例良性骨肿瘤中Caveolin1的表达，镜下观察Caveolin1在肿瘤组织中的分布，应用自动图像分析检测Caveolin1的表达情况。结果 Caveolin1表达于所有标本的肿瘤微血管和小血管内皮上，Caveolin1表达于大多数骨肉瘤的肿瘤细胞，定位于细胞膜和胞浆，但在良性骨肿瘤中表达很微弱。Caveolin1阳性表达率在骨肉瘤组中为59.0％，在良性骨肿瘤中为18.2％，两组间具有显著性差异(P＜0.01)，有统计学意义，表明Caveolin1在骨肉瘤中高表达。Caveolin1的表达与骨肉瘤肿瘤体积、病理分型和患者的性别无关(P＞0.05)，与骨肉瘤的组织分化和是否转移有关(P＜0.05)。结论 Caveolin1在骨肉瘤中高表达原因不明，其可能是促进骨肉瘤发生发展的一个潜在因素，也可能作为骨肉瘤治疗的新靶点。 【关键词】 Caveolin1；骨肉瘤；免疫组织化学 The Expression and Clinical Significance of Caveolin1 in Osteosarcoma GUO Guiming，LV Zhi，LIU Yanbin (Department of Orthopaedics，the Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China) Abstract：Objective To investigate the expression of Caveolin1 in osteosarcoma and analyse its significance in diagnosis，treatment and prognosis of osteosarcoma.Methods Caveolin1 was detected by SP immunohistochemical method in 39 cases of osteosarcoma and 22 cases of benign bone tumor，the distribution of Caveolin1 in tumor tissues was observed under optical microscope，and the expression level of Caveolin1 was detected by autoimage analysis.Results Caveolin1 was strongly expressed in the endothelium of microvessels and small vessels in all cases，and mainly localized in the cell membranes and cytoplasm of the most osteosarcomatous tumor cells，Caveolin1 was expressed weakly in benign bone tumor.The positive rate of Caveolin1 in osteosarcoma groups(59.0％) was significantly higher than that in benign bone tumor(18.2％)(P＜0.05).The expression of Caveolin1 was correlated with the metastasis of osteosarcoma and tumor tissue differentiation，but not associated with the patients′gender，tumor′size and the pathological type.Conclusion The reason why the most osteosarcomatous tumorcells strongly expressed Caveolin1 was unknown；Caveolin1 is a potential factor during osteosarcoma growth and invasion；Caveolin1 may be a new target for osteosarcomatous therapy. Key words：Caveolin1；osteosarcoma；immunohistochemistry 骨肉瘤是常见的源于间叶组织的恶性肿瘤，以能产生骨样组织的梭形细胞为特征，占原发骨肿瘤的10％，占原发骨恶性肿瘤的20％，75％的病人年龄在10～30 岁，是严重影响青壮年身心健康的恶性疾病［1］。Caveolin1是Caveolae的重要结构蛋白，参与了Caveolae的形成，以及细胞增殖、分化、凋亡和血管生成信号通路的调控，与肿瘤的发生、发展和转移有密切关系，目前认为Caveolin1同时具有肿瘤抑制因子和促进肿瘤侵袭转移的双重作用。笔者尚未见国内外有关Caveolin1在骨肿瘤中的研究报道，本研究应用超敏免疫组化SP法，检测骨肉瘤和对照组中Caveolin1的分布和表达情况，旨在分析Caveolin1对骨肉瘤的临床诊断、治疗及预后的意义。 1 材料与方法 1.1 研究对象和试验分组 试验组：选取山西医科大学第二医院骨科和病理科2003年6月至2007年3月的骨肉瘤石蜡包埋标本39 例；对照组：选取近四年骨软骨瘤石蜡包埋标本11 例和骨纤维结构不良石蜡包埋标本11 例。所有标本均4 μm厚连续切片，分别进行HE染色和免疫组化染色。由两位有经验的病理医师再次阅片，复核病理诊断。 1.2 实验试剂 兔抗Caveolin1多克隆抗体(sc894)，购自Santa Cruz Biotechnology公司；超敏SP(兔)免疫组化试剂盒(KIT9706)，酶底物显色剂(DAB0031)，均购自福州迈新生物有限公司。其余由病理科提供。 1.3 实验方法 采用免疫组织化学SP法检测Caveolin1在骨肉瘤和骨软骨瘤、骨纤维结构不良中的表达，整个操作按照超敏SP(兔)试剂盒所附说明书进行。所有标本以PBS替代一抗作为阴性对照，以已知Caveolin1强烈表达的肾脏穿刺组织作为阳性对照。 1.4 结果判定 为反映标本高倍视野下Caveolin1染色总程度，利用ImagePro Plus6.0行自动图像分析，选择平均光密度(mean denesity，MD)为指标。MD只作定性分析，以MD＞0.017 7为表达阳性，MD≤0.017 7为表达阴性。1.5 统计学处理 采用SPSS11.5统计软件，计数资料用χ2检验或Fisher精确概率检验法进行统计学处理，结果均以P＜0.05为差异显著性检验水平。 2 结 果 2.1 Caveolin1在标本中的表达和分布 免疫组化染色显示：a)Caveolin1表达于所有标本的肿瘤微血管和小血管内皮上；b)Caveolin1表达于大多数骨肉瘤的肿瘤细胞，免疫产物呈棕黄色，定位于细胞膜和胞浆，阳性细胞在肿瘤组织中呈散在分布，无一定规律；c)Caveolin1在良性骨肿瘤中无表达或表达很微弱(见图1～2)。 2.2 Caveolin1在骨肉瘤和良性骨肿瘤中的表达 Caveolin1在骨肉瘤和良性骨肿瘤中的阴性表达见表1。22 例良性骨肿瘤中，Caveolin1阳性表达率为18.2％；39 例骨肉瘤中，Caveolin1阳性表达率为59.0％，两组间具有显著性差异(P＜0.01)。 2.3 Caveolin1与骨肉瘤患者各项临床病理指标的关系(见表2)表1 Caveolin1在骨肉瘤和良性骨肿瘤中的表达由表2可见，Caveolin1的表达与骨肉瘤患者的性别、肿瘤体积和病理分型无关(P＞0.05)。在39 例骨肉瘤病例中，高分化为12 例，Caveolin1阳性表达4 例，阳性表达率为33.3％；而中和低分化为27 例，Caveolin1阳性表达19 例，阳性表达率为70.4％。经统计学分析，两者之间Caveolin1的表达有统计学差异(P＜0.05)。肿瘤转移组Caveolin1阳性表达率为91.7％，肿瘤无转移组表达率为44.4％，两者之间的差异具有统计学意义(P＜0.05)。 3 讨 论 Caveolin1于1992年由Rothberg等［2］首先发现，分子质量为21～24 KDa，修饰于Caveolae的内表面，基因定位于人类染色体7q31.1，有三个外显子，在大多数细胞中表达。Lofthouse等［3］发现，格根包尔氏细胞中也有Caveolin1的表达。众多研究表明Caveolin1是一种直接参与细胞生长和增殖的负调控基因。Caveolin1在正常组织中高表达，而乳腺癌、肺癌、宫颈癌和结肠癌中Caveolin1表达明显下降，甲状腺滤泡状癌中甚至无Caveolin1表达。Kai［4］应用原位杂交方法检测癌组织和正常组织的cDNA后显示，卵巢癌标本中的Caveolin1表达下调，同时检测了卵巢癌OVXAR3细胞中Caveolin1的表达，体外实验表明Caveolin1抑制了细胞的存活，所以暗示Caveolin1很可能在人卵巢癌上皮中是一种抑制基因。Franco等［5］证实，Caveolin1的缺失能导致表表2 Caveolin1与骨肉瘤各项临床病理指标的关系皮细胞的过度增殖，进而加速皮肤癌的发生。Engelman等［6］研究认为，Caveolin1就是7号染色体D75S22基因座上的肿瘤抑制基因。 与上述报道相悖，少数研究发现某些肿瘤组织中Caveolin1呈高表达。Yang等［7］研究了大鼠原发性前列腺癌及转移性前列腺癌的多个癌细胞株，发现在大鼠正常前列腺上皮细胞中Caveolin1表达微弱；在原发性前列腺癌细胞中其表达加强，呈胞浆弥漫性；而在转移性前列腺癌细胞中其表达更强，呈浓集颗粒状。同样，在人前列腺上皮细胞中Caveolin1表达呈阴性，人原发性前列腺癌细胞偶见颗粒状浓集表达。Kato等［8］观察分析了130 例手术切除的食道鳞癌标本，发现Caveolin1的免疫反应性与肿瘤的病理分级、淋巴结转移及远处转移有关；Caveolin1阳性组的生存率比阴性组要低，Caveolin1的高表达可作为淋巴结转移及预后差的指标之一。另外，在肾癌、膀胱癌中Caveolin1表达也增高，甚至部分学者发现某些结肠癌和乳腺癌中Caveolin1表达也增高，这提示Caveolin1增高与肿瘤发生、发展有关。 Caveolin1在骨肉瘤中的表达到底是增高还是降低，目前国内外尚未见到报道。本实验为了研究Caveolin1在标本组织中总情况，采用了较人工数肿瘤细胞更先进的方法——自动图像分析法［9］。结果Caveolin1在骨肉瘤中的阳性表达率(59.0％)明显高于对照组，有统计学意义(P＜0.01)，提示Caveolin1可能是促进骨肉瘤发生和发展的一个潜在因素。本研究还发现Caveolin1的表达与肿瘤的组织分化、是否转移相关。骨肉瘤的恶性程度越高，Caveolin1表达率越高，并且在转移性骨肉瘤细胞中表达更强，提示Caveolin1的高表达可能与骨肉瘤的恶性行为和预后有关。 如何解释Caveolin1在有些肿瘤表达增高而有些肿瘤表达降低，甚至同一肿瘤有两种完全相反的表达结果呢?最近研究认为：a)Caveolin1的基因存在突变型，这可能是导致许多实验出现相反结果的原因。野生型Caveolin1不仅可以抑制细胞恶性转化，而且可以抑制肿瘤细胞的浸润和转移，所以大多数实验表明Caveolin1在高转移性肿瘤细胞中低表达。当Caveolin1基因发生突变时，它不仅不抑制细胞的浸润和转移，而且还有促进作用，所以在某些肿瘤细胞中Caveolin1呈高表达。Hayashi等［10］应用PCRRFLP方法在乳腺硬癌中发现132位密码子突变，将突变型Caveolin1基因导入NIH3T3细胞并做集落形成实验，发现突变型Caveolin1基因表达使细胞获得非贴壁依赖性生长的性质。继而，应用改良博伊登小室法检测出导入突变型Caveolin1基因的NIH3T3细胞具有穿过再构膜的能力，而亲代NIH3T3细胞和导入野生型Caveolin1基因的NIH3T3的细胞却不能穿过此膜。b)Caveolin1对肿瘤发生的负性调控作用是通过脚手架区(scaffolding domain)实现的［11］，但是它的酪氨酸或丝氨酸磷酸化可能有促进肿瘤发生的作用。Lee等［12］发现Caveolin1的氨基端14位点酪氨酸被磷酸化后，与Grb7(生长因子受体结合蛋白7)结合，导致NIH3T3细胞非贴壁依赖性生长和受EGF刺激的细胞的迁移。c)Caveolin1对细胞凋亡的调控也是双向的。Caveolin1在Ras的上游和下游的多个环节上阻止凋亡的启动以及启动后的进程，使细胞得以生存。Yang等［7］报道，Caveolin1能够抑制前列腺癌细胞中cmyc诱导的凋亡，从而促进癌细胞的存活，促进淋巴道转移。然而，还有学者［13］报道，减少Caveolin1的水平，NIH3T3纤维母细胞凋亡被抑制；恢复Caveolin1的水平，则NIH3T3细胞对凋亡的刺激恢复敏感。其可能与Caveolin1使聚集在Caveolae的生长、增殖信号通路受到抑制有关。另外，Caveolin1在细胞恶变中可能存在着另外的调节机制，也可能是由于Caveolin1α和Caveolin1β同源体在不同的组织细胞中所发挥重要作用不同引起的。总之，Caveolin1在肿瘤的发生发展过程中的作用还有待于进一步的研究。 现在Caveolin1与肿瘤的研究成为热点，虽然许多作用和机理并不清楚，但是Caveolin1的表达已经开始在临床上应用。比如利用基因转染技术抑制癌细胞增殖是目前Caveolin1治疗肿瘤的一种策略。Fiucci等［14］利用Caveolin1基因转染乳腺癌细胞系MCF7，发现Caveolin1的表达降低了MCF7细胞增殖率，也显著降低了在软琼脂中的集落形成。通过阻断血管生成来抑制肿瘤细胞转移是肿瘤治疗的另一个重要策略。Labrecque［15］用牛主动脉内皮细胞与GSTCaveolin1共孵育抑制了flk1的VEGF诱导活化，显著抑制了血管生成。本文研究结果提示Caveolin1在骨肉瘤中高表达，可以把Caveolin1作为骨肉瘤的治疗靶，通过应用Caveolin1抑制剂、基因转染或免疫等技术治疗骨肉瘤，或许成为新的希望。 4 结 论 Caveolin1在骨肉瘤中高表达，原因不明；Caveolin1可能是促进骨肉瘤发生和发展的一个潜在因素；Caveolin1可能作为骨肉瘤治疗的一个新靶点。 晋升网简介 晋升网（http://www.js120.net） 致力于成为医务工作者晋升职称心灵导师；是目前国内收录医学期刊、医学杂志最多最权威的医学学术平台；提供免费医学期刊在线阅读；网罗和甄选海量优秀医学论文检索，独立研发医学在线资源分享库和医学在线模拟考试库；整合刊类、标题、关键词检索及全文检索，并独家研发刊社管理和刊社加盟系统、在线投稿、在线查稿、在线阅读、远程审稿、在线下载等系统；聚刊社力量，建服务平台，让晋升网通过“专业”走入每一个医务人员的身边是我们不懈的追求目标； 晋升网(http://www.js120.net)标准 最便捷的晋升通道 最高效的学习方法 最丰富的医学文献 最权威的医学期刊 最专业的医学服务 【参考文献】 ［1］徐万鹏，冯传汉.骨科肿瘤学［M］.第1版.北京：人民军医出版社，2001：179199. ［2］Rothberg KG，Heuser JE，Donzell WC，et al.Caveolin a protein component of caveolae membrane coats［J］.Cell，1992，68(4)：673682. ［3］Lofthouse RA，Davis JR，Frondoza CG，et al.Identification of caveolae and detection of caveolin in normal human osteoblasts［J］.J Bone Joint Surg (Br)，2001，83(1)：124129. ［4］Kai W，Luda D，Alexander A，et al.Caveolin1 is downregulated in human ovarian carcinoma and acts as a candidate tumor suppressor gene［J］.Am J Pathol，2001，159(5)：16351643. ［5］Franco，Terence M，William S，et al.Absence of caveolin1 sensitizes mouse skin to carcinogeninduced epidermal hyperplasia and tumor formation［J］.Am J Pathol，2003，162(6)：20292039. ［6］Engelman JA，Zhang XL，Lisanti MP.Sequence and detailed organization of the human caveolin1 and caveolin2 genes located near the D7S522 locus (7q31.1).Methylation of a CpG island in the 5′promoter region of the caveolin1 gene in human breast cancer cell lines［J］.FEBS Lett，1999，448(23)：221230. ［7］Yang G，Timme TL，Frolov A，et al.Combined cMyc and caveolin1 expression in human prostate carcinoma predicts prostate carcinoma progression［J］. Cancer，2005，103(6)：11861194. ［8］Kato K，Hida Y，Miyamoto M，et al.Over expression of caveolin1 in esophageal squamous cell carcinoma correlates with lymph node metastasis and pathologic stage［J］.Cancer，2002，94(4)：929933. ［9］吕宏升，朱庆生，王军，等.全自动显微镜及图像分析系统处理免疫组化图像［J］.中国体视学与图像分析，2004，9(1)：3740. ［10］Hayashi K，Matsuda S，Machida K，et al.Invasion activating caveolin1 mutation in human scirrhous breast cancers［J］.Cancer Res，2001，61(6)：23612364. ［11］Song KS，Tang Z，Li S，et al.Mutational analysis of the properties of caveolin1.A novel role for the Cterminal domain in mediating homotypic caveolincaveolin interactions［J］.J Biol Chem，1997，272(7)：43984403. ［12］Lee H，Volonte D，Galbiati F，et al.Constitutive and growth factor regulated phosphorylation of caveolin1 occurs at the same site(Tyr14) in vivo：identification of a cSrc/Caveolin1/Grb7 signaling cassette［J］.Mol Endocrinol，2000，14(11)：17501775. ［13］Liu J，Lee P，Galbiati F，et al.Caveolin1 expression sensitizes fibroblastic and epithelial cells to apoptotic stimulation［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2001，280(4)：823835. ［14］Fiucci G，Ravid D，Reich R，et al.Caveolin1 inhibits anchorageindependent growth，anoikis and invasiveness in MCF7 human breast cancer cells［J］.Oncogene，2002，21(15)：23652375. ［15］Labrecque L，Royal I，Surprenant DS，et al.Regulation of vascular endothelial growth factor receptor2 activity by caveolin1 and plasma membrane cholesterol［J］.Mol Biol Cell，2003，14(1)：334347. 申明：本论文版权归原刊发杂志社所有，我们转载的目的是用于 学术交流与讨论，仅供参考不构成任何学术建议。