天花病毒研究进展

新发传染病防治学习研讨会 2008 Workshop for Control of EID 2008 国家级继续医学教育项目：No.20081207170  20  天花病毒研究进展 赵卫 南方医科大学公共卫生与热带医学学院病毒研究所，广州 510515 第一节 概述 天花是由天花病毒（Smallpox Virus，Variola）引起的烈性传染病，以急起高热、全身脓胞 疹和中毒症状为主要临床现，经呼吸道和皮肤粘膜可以在各种年龄的人群中传播，传染性极强， 死亡率高达 20-30%，常造成大量人力丧失、经济负担和社会恐慌，曾在人类历史上造成过重大灾 难。 一、天花的自然流行 天花是一种古老而又猖獗的疾病， 推测可能出现在公元前一万年正值人类从游牧生活转为农业 为主的定居生活时代。至 20 世纪，天花至少造成全球 3 亿多人死亡。 有文字可考的天花瘟疫最早出现在公元前 2000 多年的印度，由印度传入中国、日本、欧洲和 北非（公元 700 年），再由北非传至加勒比（公元 1518 年）、墨西哥（公元 1520 年）、秘鲁（公元 1524 年）；此间，中北非洲将天花传到巴西（公元 1555 年）和北美（公元 1617 年）；印度在公元 1713 年将天花传到南部非洲；欧洲则在公元 1789 年将天花传到澳洲。中国葛洪在《肘后方》中曾 记载了公元 256-313 年间典型天花瘟疫肆掠中国的情景。上述天花传播路线图，明显地提示了天花 在人类中的流行与其生产力的发展和社会交往的增加相伴随。天花从非洲传至美洲与贩卖黑奴相 关，从欧洲传至澳洲与其殖民活动相关，印度最早与中国的交往可能是天花传入中国及亚洲其它地 区的原因。 一些国家的要人也未幸免天花：英国女王玛丽于 1694年 32 岁时死于天花，法国国王约瑟夫一 世和路易十五、俄国沙皇彼得二世、德国皇帝威廉二世等均死于天花。公元 17 至 18世纪，天花曾 在世界上大流行，仅在欧洲，每年有 40 万人死于天花，感染者三分之一致盲；1853年，夏威夷当 地居民 80%死于天花；1903 年，天花使南美卡亚波部族几乎全部灭绝，15 年后生存者仅剩 500 余 人。到目前为止，仍无特效的方法治疗天花，接种天花疫苗（种痘）是预防和控制天花简便易行的 有效。自从 1798 年英国医生詹纳发明了给人种牛痘预防天花以来，经过近 200 年坚持不懈的 接种疫苗，最终在 20世纪 70 年代末，在地球上彻底消灭了天花。1980 年世界卫生组织（WHO）宣 布了这一结果，并在全世界停止了普遍种痘。20多年来，世界上没有发现一例天花病人。 二、天花病毒与生物恐怖 天花曾是历史上的超级武器。公元 570年，阿比西尼亚的军队攻打阿拉伯圣地麦加，由于军队 中天花流行而全军覆没。公元 1520 年，500 人的西班牙军队入侵墨西哥，在墨西哥军队英勇抵抗 胜利再望时，天花因一个感染的黑奴水手在毫无免疫力的印第安人中间疯狂流行，300 多万印第安 人死于天花，西班牙因此征服了墨西哥。1776 年美国独立战争时期，英军进行了天花预防，而美 军发生了天花，有 50%以上的士兵死于天花，剩余 50%士兵也因病不能参战，结果导致华盛顿领导 的魁北克城战役失败。战后参战美官方说：我们惧怕的是天花，不是敌人。 然而， 天花病毒的致病特点， 使它成为了进行生物战或生物恐怖最好的材料之一。 天花作为生物剂， 许多国家已在禁止发展、生产和大量储存生物武器的公约上签字，但利用保存的天花病毒来制作生 物武器的可能性仍然存在，不能掉以轻心。特别是近 20 多年来，全世界未再接种过天花疫苗，至 少有 20 多亿的青少年和相当数量的老年人缺少对天花的免疫力，因此，一旦出现天花，将会造成 历史上罕见的大灾难。 了解人类抗击天花的历史和成功经验， 不但在应对用天花进行的生物恐怖中， 而且在应对类似新发传染病（如 SARS）中都具有重要现实意义。 第二节 病原学 新发传染病防治学习研讨会 2008 Workshop for Control of EID 2008 国家级继续医学教育项目：No.20081207170  21  一、形态 天花病毒是痘病毒科（Poxviridae）正痘病毒属（Orthopoxvirus）的成员，砖型，大小约 100nm×200nm×300nm，中心由一分子双链 DNA 和二个侧体所组成的哑铃状核心，外周为一层脂蛋 白包膜，是目前发现的最大、最复杂的病毒之一。 二、感染性及抵抗力 天花病毒有毒力不同的两种毒株，强毒株引起典型天花，弱毒株引起轻型天花，即类天花。各 年龄层均会感染，但感染后 4天内施打牛痘疫苗仍可减轻严重度或甚至预防疾病的发生。 天花病毒在宿主体外生活力较强， 尤其可耐干燥和低温， 在痂皮、 尘土和衣被上可生存 3～18 个月， 但不耐湿热，在液体中，60℃、10 分钟即被灭活，蒸气消毒法、紫外线亦易将其杀灭。对一般消 毒剂均敏感。 三、致病性 人类感染天花病毒强毒株后，约有 7 至 17 天（平均约 12 天）的潜伏期，发病的时会出现典型 发热、剧烈疼痛和衰竭。发病后会发疹，接着有发烧、疲劳、头痛、背痛、腹痛、呕吐的症状出现。 发疹的最早表现是在口腔与咽喉行成溃疡，病人唾液中有大量的病毒，有 15%的病人会导致精神错 乱。大约 10%淡肤色（light-skinned）的病人在这个期间先显现红斑性的发疹。2到 3 天之后，黏 膜疹与一些不连续的疹同时出现在脸部、手和前臂。在四肢比较远程的部位发疹之后，在一星期内 便传布到躯干部位。皮肤症状很快的由形成斑、疹、丘疹、水疱到最后脓疱状的小囊。四肢和脸上 分布比较多， 在终端肢和脸上症状比较严重， 且呈现离心的分布为其重要的诊断特征。 与水痘比较， 其皮肤症状通常在身体不同的部位同时发展，其症状明显不同。在感染后的 8 到 14 天，那些脓泡 形成结痂后痊愈形成退色的疤。虽然在咽喉、结膜和小便中所含天花病毒的量会随时间之增加而递 减，但于结疤期间，预传染性的病毒仍能够迅速地复出。因此，病人应该被隔离直到所有的结疤脱 落为止。 第三节 流行病史 一、传染源（Reservoir） 本病患者是唯一传染源。天花病人之唾液、血液、组织液、水泡液、脱落的皮屑、结痂、排泄 物及天花病人使用过沾有天花病毒的物品等。从出疹至结痂，各期皮疹渗出液与痂皮内均有病毒， 特别是在出疹期，患者口腔、上呼吸道及食管上段黏膜所形成的许多黏膜疹和浅溃疡中含大量天花 病毒，可随飞沫排出体外，是主要的天花传染来源。重症患者胃肠道及泌尿道可发生病变，粪尿内 亦可带有病毒。 二、天花传染方式（Mode of transmission） 与天花病人之间直接接触，经由吸入天花病毒而传染。传播途径以飞沫直接为主。但也可通过 疱疹、痂皮、飞沫污染物间接传染。 三、可传染期（Period of communicability） 天花为一种感染力极强之病毒，潜伏期由 7 到 17 天不等，一般是 12 天之内，此期间病人无症 状，也无传染性。在感染后的 8 到 14 天，那些脓泡形成结痂后痊愈形成退色的疤。 虽然在咽喉、 结膜、和小便中所含天花病毒的量会随时间之增加而递减，但是病毒能够迅速地从整个渐愈结疤的 期间中复出，被认为是具有传染性的。因此，病人应该被隔离直到所有的结疤分开为止 四、人群易感性 易感人群人类对天花无天然免疫力， 凡未患过天花、 未种过痘及未按时复种者， 均易感染天花。 第四节 临床特征 一、诊断原则 出疹前与其他传染病，如流感、脑炎、脑膜炎、伤寒、中毒性猩红热等早期症状相似，只能根 据疫情，否则难辨。出疹后可根据下列三点进行诊断。 新发传染病防治学习研讨会 2008 Workshop for Control of EID 2008 国家级继续医学教育项目：No.20081207170  22  1．种过痘菌（应以疤痕为凭）并且年龄在 3～5岁以下，不可能是天花。 2．体检时仔细检查全身各部皮疹分部情况。天花皮疹为离心性分布，而水痘为向心性分布， 可以鉴别轻型天花及重型水痘。 3．在出疹 3 天后，若接种痘苗仍能成功，断定这次发疹必非天花，因天花病人只有在其潜伏 期内接种痘苗才有成功的可能。 二、主要临床表现 天花病人的临床表现分为四期：潜伏期、病毒血症期、出疹期和结痂期。结合临床表现特点， 使用电子显微镜检查，可做出快速诊断。 病毒血症期潜伏期后，病人发病急，表现为寒战、高热、乏力、烦躁、周身疼痛、恶心、呕吐，并 伴有轻度上呼吸道感染症状。此期约 3～4 天，体温从 38℃升至 40℃以上，可造成小儿惊厥或成人 谵妄。 出疹期发病后 3～4 天，头面部和四肢远端出现红疹，躯干较少，呈离心性分布，此时高热下 降。在发病后 6～7 天，体温又逐渐升高，红疹变为疱疹，呈典型的中央凹陷、外周隆起的脐形疱 疹。发病后 8～9 天，体温继续升高，疱疹变为脓疱疹，全身皮肤发红微肿，出现脓毒血症，病人 可出现神志模糊或狂躁，并发肺炎及循环衰竭。 结痂期发病后 14～16天，脓疱开始干枯结痂，21～28 天痂壳脱落，病人恢复，半数病人留有 瘢痕，俗称麻子。 未种过痘的天花病人中 90％表现为上述典型症状，死亡率高达 20％～30％；重型天花常表现 为痘疱融合或痘疱出血，死亡率高达 90％；少数人因种过痘或感染毒力较弱的天花病毒，症状较 轻，死亡率在 1％以下。 三、临床分型 1．出血性天花（Hemorrhagic type） 好发在成人尤其孕妇，因为大量病毒在脾脏及骨髓中繁殖，皮肤上呈现紫斑，皮肤及黏膜明显的出 血，往往在出疹第 5至 6 天尚未确定诊断就已死亡。 2．恶性天花（扁平型，Flat type） 多发生在幼儿，造成严重的病毒血症，疹子进程缓慢，连结在一起呈扁平状，但不会形成脓泡。此 种类型很少发生，大多与人的免疫问题有关。 3．缓和型天花（修饰型，Modified type） 似典型的天花但较不严重，也会有头痛等前驱症状，但发疹期缩短，疹子表浅，数量少，通常不会 发烧。较常出现于曾接种疫苗的人。 4．重型天花（寻常型，Ordinary type）： 皮疹出现前有发烧、头痛、背痛、发冷及呕吐等症状，典型的水泡或脓疱出现在脸部和四肢。 四、防治措施 及早发现病人发现可疑天花病人时，应立即至疫源地调查，进行临床及快速实验室检验。尽快 确定诊断，可缩小天花的蔓延范围。 严密隔离与消毒确诊天花病人后，立即作紧急疫情报告，同时对病人做严密的隔离治疗，禁止 与任何人接触。选择种过痘而具免疫力的医护人员进行医疗。对症治疗，并对病人用过的衣物 和排泄物等彻底消毒。天花病毒是最大的病毒之一，呈复合结构，核衣壳包裹 两层脂蛋白膜，对乙醚不敏感。蒸气消毒法、紫外线易将其杀灭。常用的消毒剂升汞、石炭酸、甲 醛等，经 30分钟可将其灭活，漂白粉 1∶10000、高锰酸钾或酒精 60 分钟可将其灭活。 接触者处理以病人为中心，搜索全部接触者，立即种痘，并单独隔离检疫 17 日。体弱多病的 小儿可同时肌注抗天花或抗牛痘球蛋白 0.2～0.3 毫克／公斤体重，以加强预防效果。 实行交通检疫发现天花病人地区及邻近地区居民，除应立即普遍种痘外，还应在交通要道实行 交通检疫，以防止天花沿交通线向外传播。 新发传染病防治学习研讨会 2008 Workshop for Control of EID 2008 国家级继续医学教育项目：No.20081207170  23  国境卫生检疫出现天花流行时，凡从疫区进入我国的一切人员，应持有效的种痘证。凡来自疫 区的船只、飞机等交通工具，旅客及其行李应按国境卫生检疫管理办法处理 第五节 实验室检验 一、检查标本的采集与运送 根据病期选择标本 天花病期不同， 相应的检查也不同， 因此不同的病期， 应采集不同的标本。 按病期的不同，选择采集不同的标本(表 19.1)。 表 19.1 天花不同病期标本的采集 1．血液 5ml，抗凝(肝磷脂)。 2.直接涂抹采集标本 没有生物安全柜等设备时，取皮疹上盖，装入 2ml 的塑料管里，密封后冷藏。取皮疹上盖，在 玻片孔内侧涂抹并使其干燥，制作 3～4枚涂抹标本。 3．直接压玻片采集标本 如上盖不能打开或疱底带有湿性时，可直接把玻片表面压上采取涂抹标本。由于涂抹标本中的 病毒没有灭活，把玻片装入玻片盒并用胶带密封，再装入塑料袋，冷藏。 4．水疱液、脓疱液 用附有注射针(26 G)1ml 的注射器（结核菌素用）吸取 0.1～0.2ml 的 PBS，从疱膜插入，来回 2～3 次混匀后吸取内容液(图 19.4)。把吸取的内容液装入血清管等，4℃冷却后运送。 5．痂皮 用钳子采取痂皮放入塑料管后密封，4℃冷却后运送。 二、病原学检查 水疱液、脓疱液标本，直接用以下方法检查。痂皮，可置于少量的 PBS 中，放置 1h 左右后用 1 次性乳棒搅匀后作为标本用。 1．诊断性培养 用 HeLa 细胞感染正痘病毒后与正常细胞比较，观察细胞变性效果(CPE) 。痘病毒感染后，在 数日内出现细胞死亡，用肉眼可观察到半圆状斑点形成。 2．聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR) 美国和俄罗斯研究人员检测天花病毒DNA主要是聚合酶链反应法。 应用血凝素基因的1个300bp 质粒片断做目的 DNA，使用特异性的 PCR 引物和探针，进行即时聚合酶链反应方法检测天花病毒， 在 3h 内确认出天花病毒和其他正痘病毒。 3．荧光抗体法检测天花病毒抗原 新发传染病防治学习研讨会 2008 Workshop for Control of EID 2008 国家级继续医学教育项目：No.20081207170  24  涂抹标本在室温下用丙酮 10min 固定后使用。抗牛痘病毒兔血清作为 1 次血清，FITC 标识抗 兔 IgG 抗体作为 2 次血清，进行间接荧光抗体法。用间接荧光抗体法能确认标本(涂抹标本)是否存 在有正痘病毒抗原，但此法不能区别天花病毒和其他正痘病毒。1 次血清如用抗 VZV(水痘病毒)抗 体，可与水鉴别痘。 4．电子显微镜病毒粒子的检出与鉴定 用磷钨酸对标本(水疱液、脓疱液、痂皮乳剂)进行负染色后，用电子显微镜观察痘病毒粒子。此检 查法，不能对天花病毒与猴天花病毒、牛痘病毒等其他的痘病毒进行鉴别。天花患者标本的电子显 微镜检查阳性图例见图 19.5。与水痘患者标本观察到的水痘病毒(疱疹病毒)较易识别。 三、天花的诊断 美国 CDC 对天花的定义与诊断如下： 1.临床病例标准 突然发热(38.3℃)，伴有出疹，有坚实感，深藏皮内，在疾病同一的进展期同时出现疱疹或脓 疱等而没有其他明显的病因。 2．实验室诊断标准 满足以下之一者，可诊断为“天花” 。 （1）临床标本“PCR法”中检出天花病毒 DNA 基因。 （2）临床标本分离出天花病毒(WHO 天花参比实验室或同级别的实验室)，并经天花病毒 PCR 法确认。 （3）病例临床分类 天花已在世界上根绝，不作为自然发生的疾病，若经实验室确诊出病例，则可认为天花爆发。 一旦发生天花爆发，需进行病例分类： A．确认病例 经实验室检测出天花病毒可确认为天花，或符合临床病例标准并经流行病学调查与实验室确 认。 B．可能病例 符合临床病例标准，或不符合临床病例标准但临床类似天花并与流行病学有关的天花确认病 例。 C．疑似病例：发疹伴有发热，并在 1-4d 内出现进展性的皮疹。 第六节 预防措施 一、牛痘接种问题 由于天花己被消灭，种痘已无必要，除了有特殊原因外，婴儿出生后不需要种痘，即便有猴痘 发生的地方，如中非和西非某些国家，亦无需种痘。如需接种，具体事宜如下： 1．疫苗 天花疫苗含有活牛痘病毒，此病毒是正痘病毒属的，与引起天花的天花病毒很相似。接种牛痘 病毒(疫苗) 后，能够产生抵抗天花的抗体。 1999 年 12 月，WHO 天花病毒顾问委员会的结论是：虽然现在证明预防接种是阻断并控制天花 爆发的唯一的公共卫生措施，但目前的疫苗储备量非常有限。委员会还说几个国家正在打算生产更 多的疫苗。现在几个国家的政府正在选择他们保存的疫苗株，并试验其效力，决定是否需生产更多 的疫苗。 WHO 1998 年的一项调查显示，全球现在可以应用的天花疫苗大约有 9 000 万剂，但其保存条 件和效力并不清楚。现存的疫苗和 WHO 在消灭天花的活动中使用的疫苗，是由被牛痘病毒感染的 动物(主要是小牛或羊) 的皮肤碎浆组成的，并在其浓缩物中加入足够的石炭酸以杀死细菌，但不 会杀灭牛痘病毒。随后疫苗冷冻干燥保存在安瓿中，使用时将疫苗用无菌的缓冲液稀释为悬浮液， 用分叉的针头多次在真皮内接种。 新发传染病防治学习研讨会 2008 Workshop for Control of EID 2008 国家级继续医学教育项目：No.20081207170  25  WHO 用于生产疫苗的病毒种株(牛痘病毒 Lister Elstree 株) 保存在荷兰 Bilthoven 的 WHO天 花疫苗合作中心。这个中心每 5 年对一批疫苗的效力进行检验，如适当地保存疫苗，18 年效力都 不会降低。 2．接种疫苗后的保护时限 接种疫苗后至少保护 10 年。如果出现症状，接种过疫苗的人要比未接种的人症状轻，且病死 率低。当保护作用很低时，接种过的人排放的病毒也较少，且可能不会传播此病。 3．预防接种的并发病 经证实现存疫苗有很高的效力，但其引起副作用的频率也很高。如果不能确定确实有暴露的危 险，或危险性很小，那么接种疫苗引起副反应的危险性就很大。要确定个体已暴露或确实有暴露的 危险时方可接种。一种细胞培养的更为安全的牛痘疫苗有望在近期使用。现在正在研制一种用于已 暴露或感染天花的人被动免疫的单克隆天花病毒抗体，同时对艾滋病病毒( HIV) 感染者也是安全 的。 4．禁忌证 一些人不能进行预防接种，这些人包括：孕妇、免疫功能紊乱或正在进行免疫抑制治疗的人、 HIV 感染者和有患湿疹史的人。 如国家的权威部门认为流行的危险性很大， 需要为这一部分人接种， 如果可能的话最好是用从感染牛痘病毒的羊或小牛体中提取的免疫球蛋白为这些人进行肌内注射。 5．WHO 关于用双叉针接种疫苗的指导(多次划痕的技术) (1)接种部位 上臂外侧三角肌附着处。 (2)皮肤的准备 无。如接种处较脏，可用湿布擦拭。用消毒剂会杀死疫苗中的病毒。 (3)从安瓿中取疫苗 1 支无菌双叉针(必须是凉的) 伸入安瓿中取疫苗。取出时，针的叉头中含 1 滴疫苗，这就够 接种用量了。 (4)在皮肤上接种疫苗 针与皮肤呈 90°角(垂直)。针头接触皮肤，滴下疫苗。不管是首次接种还是再次接种，都要 在直径 5mm 的范围内(通过皮肤上的疫苗)垂直于皮肤，上下迅速划 15 下。划时要用力，这样在接 种处会出血痕。如果未出现血痕，说明划时不够用力，就要重复接种过程。虽然无明显的出血现象 最理想，但出现血也不会降低免疫成功率。 (5)敷裹伤口 接种后不需要敷裹伤口。 (6)灭菌 WHO 强烈建议使用一次性针头。 (7)未用的疫苗 未用的、已溶解的冻干疫苗应在每个工作日结束时丢弃。 6．预防接种的并发症 与预防接种有关的并发症共有 4 种，其中 3 种包括异常的皮疹。 (1)牛痘湿疹发生于接种者或未接种的接触者，他们正在患或曾经患过湿疹。这些皮疹发生的 部位在湿疹发生的部位或湿疹曾经发生的部位。皮疹发炎症状加重，有时会扩散到健康皮肤。如婴 儿有大面积的皮肤被感染，预后很差。 (2)进行性牛痘(坏疽性牛痘)只发生于免疫缺损病人。在这些病例中，接种部位的损害未治愈， 继发损害有时会延伸到身体其它部位，而且损害呈进行性发展，(很可能)直到病人死亡，这大约需 2～5 个月。由于出现了更为重要的 HIV/AIDS(艾滋病)，很多国家停止使用牛痘疫苗，因此很多免 疫缺陷病人并未患进行性牛痘。 新发传染病防治学习研讨会 2008 Workshop for Control of EID 2008 国家级继续医学教育项目：No.20081207170  26  (3)全身性牛痘发生于健康人，一般在接种后 6～9d 出现，皮疹不断增多，有时遍布全身。预 后较好。 (4)种痘后脑炎是最严重的并发症，有 2 种形式。一种多见于≤2 岁儿童，特征是病情严重、 惊厥。预后常不完全，病人有大脑损害和瘫痪。第二种常见于> 2 岁的儿童，特点是突然发病，发 热、呕吐、头痛和不适，随后意识不清、遗忘、意识模糊、不安、惊厥、昏迷。病死率大约为 35 %， 多发生在 1 周内。1968 年在美国开展了一项研究，共调查了 1 400 万接种者，以估计这些并发症 的发生率。共有 9 人死亡。 二、牛痘苗的储备问题 虽然天花在人群中的传播已中断，很少有可能再次发生流行，但对于那些不可预测情况要有所 准备，由于人群中不再接种疫苗，大家都已成为易感者，WHO在荷兰国立公共卫生和环境保护研究 所的 WH0 合作中心备有 58 万人份的痘苗冰冻保存，并定期检查其效力，以便急需，同时保存牛痘 病毒毒种及应接种所需的双叉针。