大花蕙兰组织培养技术研究

河南农业大学 硕士学位 大花蕙兰组织培养技术研究 姓名：尚增强 申请学位级别：硕士 专业：农业推广·组织培养 指导教师：马新明;胡如善 20080301 6一BA NAA IBA’ 2，4～D IAA PGRs MS PLBs AC a GA3 本文所用英文缩写 6一benzyladenine zaDhhaleneaceticacid indolbutyricacid 2，4一dichlorophenoxyaceticacid indoleaceticacid plantgrowthregulators MurashigeandSkoog’Smedium Protocormlikebodies activecharcoal bananamud Gibberellin 45 6一苄基腺嘌呤 萘乙酸 吲哚丁酸 2，4一二氯苯氧乙酸 吲哚乙酸 生长调节物质 MS培养基 原球茎 活性炭 香蕉泥 赤霉素 河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论 大花蕙兰组织培养技术研究 学位 硕士 文目 级别 学生 学科 导师 姓名 尚增强 农业推广 马新明 专业 姓名 学位论文 如需保密，解密时问 年月 同 是否保密 独创性声明 本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中特别 加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，指导教师 对此进行了审定。与我-I雷II作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了 明确的说明，并表示了谢意。 研究篡明搠逸 翮虢丑k川。 日期：锯年钿?调 日期：昭年6月2z扁 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷本和电子版 本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编 学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文 的全部或部分内容。 本人完全了解《河南农业大学知识产权保护办法》的有关规定，在毕业离开河南 农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单位为河南农业 大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农业大学所有，否则， 承担相应的法律责任。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 研究生签名＼蝴蛰导师签名．8娜 学院领导签名． tl t ，l ，． 日期：仞％年汐月7酮 日期：∥汐年厶月7zEj 日期： 年月 日 致 谢 在论文即将结束之际，我衷心地感谢我的导师马新明教授，在我攻读硕士学位的三年里， 在生活、学习、研究等方面，给予了谆谆教诲，悉心培养和严格要求，论文的整个过程都倾 注了他大量的心血。我衷心的感谢胡如善高级讲师(南阳农业学校)，三年来对我的精心指导、 深切关怀和多方帮助!恩师们严谨的治学态度、活跃的学术思想、高深的学术造诣、渊博的知 识以及为人的谦虚和孜孜以求的精神使学生受益匪浅，终身难忘。我唯有在今后的工作中， 以师为模，乘师之风，才是对导师们的最好回报! 感谢我的同事杨玉珍老师和孙廷老师在试验过程中，给予热情的指导和无私的帮助!感谢 在南阳农校组培中心的同学们及工人同志们给予的真诚帮助!感谢我的工作单位领导在我学 习期间给予的大力支持和多方帮助!感谢我的家人多年来对我的理解和支持!感谢三年来所有 给予我指导、关心和帮助的我的老师、同学、朋友和同事们! 最后，向论文评阅人和答辩委员会全体专家教授表示最真诚的感谢! 摘要 大花葱兰(Cymbidiumgrandiflorium)是一种具有很高观赏价值的兰科植物，传统上采用分株繁殖。 随着现代生物技术的发展，以组织培养为主要手段的生物技术逐步应II{；j剑大花蕙兰的繁殖过程中， 大幅度的提高了大花蕙兰的繁殖系数。但是，大花蕙兰组织培养快速繁殖的程序和培养基尚有简化 的空间，如能采用更加简化的程序和培养基达到同样或更好的效果，必将为工厂化生产降低大量成 本。 本文首先介绍了犬花蕙兰生物学特性及观赏价值，阐述了国内外在大花蕙兰培养和快速繁殖方 面的研究现状，在此基础上，以台湾进口的人花蕙兰杂交新品种‘女皇’的花梗为材料，应用组织 培养技术，对适合丛生芽和原球萃增殖、分化的培养基、培养方式进行了系统的研究，提高了诱导 成苗率和繁殖速率，降低了成本。建立了一套经济、高效的快繁技术体系，对培养基、激素用量、 培养方式进行筛选。 试验表明：大花蕙兰最佳启动培养基是MS+6-BA2．0mg·L-l+NAA0．5mg·L～，最佳丛生芽继 代培养的培养基是MS+6一BA1．0mg·L_j+NM,0．1mg·L-。，增殖系数可达5．儿，继代培养的适宜 条件是光照2000Lx，温度(22±1)℃。原球茎增殖的最佳培养基是MS+KT2．Omg·L-1+NAA0．1mg L-1。原球茎诱导芽最佳培养基是MS+6-BA1．0mg·L-l+NMO．1mgL-l。最佳生根培养基是I／2MS+NAA O．5mg-L一+香蕉泥1509-L"1。试管苗移栽的最佳基质是小树皮+小兰基石+椰壳粉(1．5：1．5：1)， 在3、4月份和10月份、遮荫度为70％条件下，移栽成活率可达到80％以上。形成了一套完整的大 花蕙兰离体培养和快速繁殖技术体系。 关键词：大花蕙兰组织培养 花梗 原球茎 1文献综述 兰花是高雅，美丽而义带神秘色彩的植物。我国古代就常以君子、雅七、幽人等来称颂它⋯。 兰花具有较高的观赏价值和经济价值121，是人们十分喜欢的花卉。不论是切花晶种还是盆花，在国 际市场上都占有重要的地位，是中国和世界著名的花卉。 大花蕙：?_兰L-(CymbidiumgrandiJlorum)，义称虎头兰、西姆比兰，为兰科多年生草本植物，具有极 高的观赏价值，是近几年来在我国花卉市场上十分流行的高档室内盆栽花卉。由于大花蕙兰多为杂 交品种，传统的种子繁殖和分株繁殖等方式不仅无法保持其品种特性，而且繁殖周期长、速度慢， 繁殖系数低，远远不能满足大花蕙兰商品化大生产的要求。因此，有必要开展大花蕙兰组织培养及 快速繁育技术体系研究，以期为工厂化人规模生产提供科学依据。 1．1兰花的植物学特性 兰花一般高20"--'40厘米¨1，根长简状。叶自茎部簇生，线状披针形，稍具革质，2至3片成一 束。总状花序，花被2轮，肉质状，内轮3瓣中，2瓣向上直立，下方一瓣唇形，向外反卷，上具 紫红色斑或无，雄蕊和花柱合生成合蕊柱，花色由黄褐至浅黄，以不具褐色的纯颜色者为贵异。萌 果三角形，种极小。 1．1．1根 地生兰根是丛生的须根系，肉质，间或从须上生出分节支根，兰根概无根毛。一般春兰根较细， 径约0．4厘米左右，蕙兰径约O．5厘米，而建兰、秋兰、寒兰、报岁兰根较上述稍粗长。兰根内贮 丰富的水分和养料，按根的结构可分为内、中、外三部分，最外层为包围全根的根皮组织，主要起 着吸收和保护水分的作用，所以，对兰花浇水不宜过勤，否则，土壤过湿，容易引起根部腐烂。根 皮之内为皮层组织，皮层细胞都是活细胞，有的含有针状结晶，有的含有共生的根菌。当肉质根折 裂时，其中有一粗约0．1厘米的黄白色纤维梗，称为中心梗，不易折断。培养多年的伏盆兰根，在 干燥时，健壮的根旱亚白色，幼根衍生时多为嫩白色，如裸露在盆面或泥外，因受湿气关系，呈青 绿色或暗灰色。兰根有兰菌与它共生，借此得到更多养料，促使繁茂，所以我国传统采移兰花必须 带些宿土，且忌用利器挖掘，也就是这个道理。 1．1．2茎 地生兰没有明显的茎，只有根茎与花茎之别。在根、叶相接处有一肥人的假球苇，其形式有柱 形、梭形、卵形、球形和扁球形，都向上着生，全露或微露在泥面上，在栽种时不应将它全部埋没 泥中。假球茎的人小按种类不同而相异，例如春兰和蒽兰一般高约1"---1．5厘米，径宽为l厘米左右， 其他类更为壮大。健壮的假球萃外面全由绿色叶片包覆着，至衰老后，叶片枯萎缩。裸露的假球苇 呈黄色或黄绿色，这时假球茎上残留着枯老纤细的丝状叶痕物。假球萃按我国艺兰中俗称芦头、蒲 头、龙头等，其中贮藏养料和水分，一般能有二、五年生命，当进入衰老期，还能衍生假球莲，每 当黄霉至盛夏或初秋时季，从假球摹基部滋生出叶芽和花芽。另一种茎是花摹(即花葶、花梗)， 外面包覆着数层苞叶。 1．1．3叶 2 可分为寻常叶和苞叶二种。从假球茎上簇生出的叶称为寻常叶，呈线形或带形，无明显叶柄， 叶束都一次长成，全缘或边缘有细锯齿，平行脉，常绿硬革质，Pt一面人多为暗绿色，叶背较淡，叶 梢尖锐或圆钝。春兰nt‘幅阔约0．4～0．8厘米，长约20多厘米：建兰、．寒兰较宽长：报岁兰更宽， 约在1．5厘米以上。叶片中央的中脉向叶背凸出或微凸，借以支撑兰叶向上着生，虽受风吹飘摇仍 不易折断。每五至七、八叶组成束(每束在我国兰艺中俗称为“筒”或“庄”，每束应以三片叶起 算)。春兰和蕙兰每束标准应有3～5片叶，其他类稍多些。按我国传统艺兰，对春兰和蕙兰叶型， 结合花瓣瓣型总结经验，。认为凡叶尖起沟，兜到基部为佳，梅瓣的叶性较硬，水仙瓣之叶性糯，凡 肥阔厚实，绝大多数出荷瓣或阔瓣花。另一种叶，就是包在花茎上的变态叶，由于退化变成膜质鳞 片状，基部为鞘形，俗称为壳，在植物学上称为苞叶，它主要起着保护花蕾作用。苞叶基部最外两 张有硬角质，内部几张呈现软膜状，我国艺兰家常根据它的颜色和上面筋纹、沙晕，作为辨识花蕾 演变中花瓣瓣型分类的依据。春兰苞叶有五层，盛放时花序顶端的一枚苞片有的耸出花朵，有的低 于花朵；蕙兰等一茎多花的苞叶有7----9层，且每朵花的花柄基部都有一片短狭软膜包叶。春兰和蕙 兰的苞叶的人小、宽窄、色彩都与瓣型有关。 1．1．4花 兰属的花都为不整齐花，花单生或由多个具长短略等的花，着生在长花茎上，排列成总状花序。 就其花的构造来讲，有六瓣一蕊(柱蕊)，分为三轮。最外面一轮是形状相似的三片萼片，艺兰术 语称为外三瓣。中间一轮三片俗称内三瓣，其上侧二片纵生平行，比外三瓣略短，俗称捧瓣；下侧 一片俗称唇瓣或舌呈绒毛状，上面散布红色或紫红色点块，具有这种颜色者称为荤瓣花，如舌上呈 纯绿、白、微黄色称为素瓣花。最里层，为雌雄蕊所组成的柱蕊，俗称鼻或香子，它是蕴藏香气的 部分。柱蕊顶端为雄蕊，外有花粉盖，内有花粉室，含有花粉块，花药无柄，花粉块的下部有伸长 的粉柄块，即胚茎，其基部有胶粘盘。在柱蕊的顶端微向前的下面有一凹洞，内有粘液，这粘液常 被昆虫作为传粉时的媒个物。雌蕊由三枚结合的心皮组成，子房+I'-位，侧膜胎座，胎座内含有多数 倒生胚珠。 1．1．5果实 兰花的雌蕊受精后，花瓣逐渐凋萎，而子房逐渐膨人成绿色棍棒状，大约经过6～12个月，种 果成熟，果皮由黄绿色转成褐色。果实概为柱形，具有三角，果实形状依种类不同而异，这是有助 于鉴别分类的。春兰种果较短矮，一般高约3"--4厘米，蕙兰等稍为长大，粗壮些。秋兰种果与建兰、 蕙兰的种果相似。寒兰与报岁兰相似。兰科植物的果实均为蒴果，呈三角或六角形，每角自项至基 部有粗约0．3厘米的长棱，称为果脊柱。当果实成熟时，每一果瓣平面中央的果脊枉自蒴果顶端弹开， 果瓣产生倒锥形裂缝，便于种子从裂口溅出。兰花种子极为微小，细如灰尘，一般呈长纺锤形，用 肉眼几乎辨认不清，每粒种子只有0．3～0．5微毫克重量，它没有胚乳，只有一个简单的胚，外面包 着疏松、透明、不易透水的种皮，种皮上有许多增厚的术质化的条纹，胚内含有很少的养分，绝人 部分为脂肪类的含物。由于兰花种子微小，数量多(每一蒴果内含有种子约一万粒左右)，同时种 皮有很人的浮力和具有特别抗水湿能力，所以当种子外溅后，随水流传播亦无影响。兰花发芽率共 低，又不易保存，以成熟后播种为好。 ’ 3 1．2大花蕙兰概述 1．2．1大花蕙兰的发展简史 大花蕙兰是兰科兰属部分种类的杂交种，1889年在英国首次杂交成功的世界上第一个大花蕙兰 人jJ：杂交品种为‘韦奇’(CymbidiumX vietchii)。由于当时播种技术有限，一定程度上限制了当 时杂交育种一l：作的进行，之后随着繁殖技术的不断发展，进行了深入的杂交育种T作，不断出现新 的杂交种。四五十年代大花蕙兰的杂交育种开始进入发展的鼎盛时期。1966年在美国长滩举办的第 五届兰花会议的展览会中，大花蕙兰的杂交新晶种一举摘取了40枚奖牌，随后随着商品化的发展， 大花蕙兰逐渐走俏世界花卉市场¨引。由于大花蕙兰在市场上很受欢迎，新品种增加很快，每年都会 出现一些新品种。随着新的栽培技术的应用与发展，无菌试管苗、组织培养等快繁技术的不断改进 与发展，促使生产大花蕙兰的企业、公司遍及全球各地。大花蕙兰己经成为世界花卉市场上常见的 高档兰花之一。 目前，随着经济和社会的发展，人们对大花蕙兰的观赏需求愈来愈走向多元化，香花型、垂花 型、中小型和反季节开花等具有这些特性的品种越来越受到人们的拥戴，同时这也为育种工作者提 出新的科研问题，培育出既能最大程度满足人们需求、又具有较高商品价值的新品种成为杂交育种 工作的主要任务⋯J2’13。。 1．2．2我国进行大花蕙兰生产的优势和市场前景 大花蕙兰在我国花卉市场中占有一个非常重要的位置，我国在发展人花蕙兰生产上在许多方面 具有很大的优势，包括： 首先，我国具有丰富的种质资源。兰科植物分布广泛，主要分布在热带、亚热带地区，大花蕙 兰、兜兰、万代兰、蝴蝶兰及其它洋兰的原生种在中国均有分布，主要分布云南、广西、贵州、广 东、台湾省华南和西南等地。t}|=界首个大花蕙兰的人工杂交品种‘韦奇’就是使用原产于我国的碧 玉兰和象牙白花兰作亲本杂交而成。用于杂交的亲本还有原产于我国的虎头兰、黄蝉兰，美花兰等， 这些野生种大都分布在高海拔的地区：我国具有非常优越的野生资源优势，生产中可以适度开发、利 用这些野生资源，把野生资源具备的优秀品质转化到商业生产中来。科研T作者可以把具有更多优 良观赏价值的野生种质资源加以驯化、引种，利用具有某些优良品性的品种作亲本，培养出花、色、 香、型、抗性等品质俱佳的优良品种，以丰富大花蕙兰市场，提高经济效益。 其次，生产成本较低。针对中国劳动力价格低廉的优势，其它国家和地区的企业己经把T厂建 在中国，比如同是洋兰家族的蝴蝶兰，至2004年，台湾拥有蝴蝶兰生产商300多家，其中己经有 40多家进入人陆生产销售。除此之外我国在花卉生产上还具有十地价格、设备设施、原材料、交通 费用等成木较低的条件，这些条件都为企业发展提供了广阔的空间。 最后，我国具有庞大的市场潜力。春节是大花蕙兰的主要销售期，是典型的节日高档礼品花卉。 我国的人花蕙兰市场潜力巨人，随着经济水平的逐渐提高，人们对其需求也在逐年增加人花蕙兰， 不但在年宵花卉中占据高档花卉的主要市场，而且在平日鲜切花、盆花、租摆用花市场中也占有重 要部分。目前进口的优质人花蕙兰主要集中在人城市的花卉市场中，且消费群体还为少数，但随着 经济的发展，大花蕙兰生产生产成本降低导致的产品价格下降，中小城市的市场和中低收入的群体 4 将有可能成为新的消费群体。 L2．3我国大花蕙兰规模化生产发展和现状 2006年之前，市场上的人花蕙兰主要以日本、韩国、台湾生产的产品为主，也有一些国产大花 蕙兰，但是国产大花蕙兰的品质远远不如日本、韩国的产品，主要集中在低端市场上进行销售。 纵观近几年大花蕙兰在中国的发展，由最初的完全依靠进口而转为国内自主或合作生产。总的 来说经历了几个阶段性时期，第一个时期，1997年至1999年这一时期属丁产品引进期，中国从韩 国、日本直接引入大花蕙兰成品，作为高档年宵花卉进入中国市场，立即吸引了消费者的眼球，引 起花卉界的高度关注。第二个时期，从2000年至2002年，属于国产化可行性试验阶段。由于火花 蕙兰盆花生产利润较高，韩国及国内部分公司、企业或个人在山东、云南等地区开展犬花蕙兰的生 产可行性试验，其栽培结果因地区以及栽培管理条件差别而相差很大，国内生产技术还处于摸索阶 段。之后2003年至2006年，属于优势产区发展提速时期。随着生产技术的学习、摸索与改进，国 内的生产的大花蕙兰的品质逐步得到业界认同，国内外的投资者竞相在一些地区投资进行大花蕙兰 的产业化生产。目前大花蕙兰生产总体卜还处于规模扩张阶段，生产水平参差不齐，产品品质呈现 “正三角形”，即优质花比例最少，低档次花比例最多，中档花比例介于二者之间‘吲，大花蕙兰作 为新兴产品的发展势头势不可挡，但是我国高品质的大花蕙兰想要在国际市场上跻身于世界前列， 还有很长的道路要走。 1．2．4大花蕙兰生产栽培中存在的问题 在生产中，由于尚未引入国外全套的生产管理技术，所以国内对于栽培技术尚需进一步摸索和 改进，虽然有些问题因栽培地区、栽培品种、栽培环境而异，但是总的来说栽培中存在的问题仍然 集中在以下几个方面： 1．2．4．1花期调控 未能在生产中根据不同品种特性制定出相应的花期调控措施，以满足除春节以外不同时期的市 场需求。口前生产栽培中大多数都是满足春节年宵花卉市场的需求，仅有个别早花品种进行适当花 期调控后可以在“十·一”上市，所以针对不同品种特性，采取一定的调控措施、培养出其它季节 市场需求的大花蕙兰盆花势在必行。 1．2．4．2品种单调 目前国内生产的可供市场销售的大花蒽兰品种较少，如‘两维理’、 ‘玛利莲梦露’、 ‘蒙米 拉丝’、 ‘女皇’等，而目高品质的产品主要都是依靠进口，即使许多企业对一些其它品种进行少 量引入，也冈栽培技术或成本问题没有人面积栽培，这使得我们在生产实践中要进一步研究、摸索 出引入晶种的习性，快速寻找一套适用于该品种的培养方式，同时，有能力的企业可以自主培育或 与科研单位携手培育出新品种，以满足人们不断增加的需求。 1．2．4．3病虫害问题 目前大花蕙兰生长栽培过程中病虫害的发生严重威胁着生产者的利益，降低了花卉的观赏价值， 而人花蕙兰本身因为温度、湿度以及其它管理不当非常容易引起病虫害的发生，所以其病虫害问题 仍需进一步研究，以产生适应不同地区不同栽培环境的一套有效对策。 5 1．2．4．4种苗依靠进口 现在国内生产栽培中使用的试管苗人多数依靠韩国、台湾等国家进口，而我国组织培养技术也 相对比较成熟，且劳动力价格比较便宜，具有这些优势的同时，我们完全可以自主进行种苗生产， 输入国外市场，在同行业中可以一i有更人份额。 1．2．4．5成花质量不高 成花质量直接与花的观赏价值和经济价值相关，目前栽培中存在着由于栽培设施、栽培技术、 管理措施等不当引起的花箭高度不够、每盆花箭个数少、小花败育等现象，这些问题都是大花蕙兰 规模化生产中亟待解决的问题。 1．3国内外研究进展 针对大花蕙兰生产中存在的问题，科研人员进行了一系列研究，多年来国外己在栽培技术、组 织培养等方面进行了很多深入研究，积累了比较丰富的生产经验。近几年来，随着大花蕙兰在国内 的生产和市场地位逐渐升高，国内也开始了大花蕙兰的生产并进行了相关研究。 1．3．1组织培养技术研究 大花蕙兰种子的自然萌发率极低，在自然状态下繁衍困难，如果依靠传统分株繁殖，则繁殖速 度慢、周期长、繁殖率低，为了加快人花蕙兰的繁殖速度、缩短繁殖周期、增加育苗质量，在大花 蕙兰的工厂化育苗中常采用组织培养方式，因此大花蕙兰的繁殖技术主要集中在组织培养技术的研 究方面。 兰花的组织培养始丁二20世纪60年代。Morel采用人花蕙兰的茎尖，．在含有细胞分裂素的KC培 养基上进行培养，茎尖分生组织膨大形成原球茎，并分化出根和叶，首次获得兰花无病毒小植株“引。 因此，大花蕙兰是第一个用茎尖进行试管微繁获得再生植株的兰科植物，并进行了脱毒培养。Whimber 对Morel的方法进行了改进，采用液体震荡培养的方法，大大加快了原球茎增殖的速度，短期内可 获得大量再生植株n引。此后，组织培养技术在兰花生产上得到了广泛应用。据统计，截至1985 年，已有约66个属的数百种兰科植物可利用组织培养的方法进行繁殖n6—7一引。纵观二十世纪60年 代至今大花慧兰组织培养研究主要集中在几个方面： 1．3．1．1外植体的选择 大花蕙兰组织培养选择的外植体通常有茎尖¨4一吼‰21‘22’23’，茎段乜“2引、试管苗茎段扭51、原球茎心乱 2"、根状茎∽’2引’假鳞茎m—h孤3引、花梗和花瓣⋯引等。采用不同外植体诱导的难易程度不同，通常取 新芽8．Orl0．Ocm，茎尖0．2～O．5cm，或利用新芽2．0～3．Ocm时的幼根、切成0．5～O．8cm根段，接 种后容易诱导原球茎m1。 1．3．1．2培养基的选择 在基本培养基的选择上，学者们认为，适合大花蕙兰组培的基本培养基大致有MS，KC，以及White 等，但最适合培养基意见都不一致，刘丽锋H“、谢为龙悼川等发现MS，1／2MS，KC和Vw四种培养基对 大花蒽兰原球茎增殖的影响没有显著影响，但是对发芽率和生根率的影响差异显著阳"：朱根发等对 MS，1／2MS、改良的Kc和宝花1号四种基本培养基进行试验，结果表明改良KC和1／2MS较适合大花 蕙兰的快速繁殖暗8’：认为花宝1号培养基优于Ms培养基旧引：马华升瞳011等对比研究了1／2MS、改良KC， 6 MS和White四种培养基，认为1／2MS培养基的增殖效果最好：胡恒康等对比了MS，1／2MS和Vw三种 培养基，认为MS增殖效果较好啪1。 1．3．1．3激素对原球笨增殖与分化的影响 有研究认为适合人花蕙兰组织培养的细胞分裂素为6-BA幢3’柏J删，并且较高浓度(1．0mg·L一) 的6一BA能够促进原球茎增殖，较低浓度(0．4mg·L叫)的6-BA有利于原球茎的分化担0’3"，但是对其 影响效果冈培养基而异，在KC培养基上表现出一定的抑制作用，但在White培养基上却表现为明显 的促进作用14¨。有研究认为，细胞分裂素BA和KT对原球摹诱导作用极其显著，但是ZT的作用却不 明显：BA和VAA对类原球茎的诱导和增殖有明显促进作用，但是BA对大花蕙兰幼苗的增殖效果更为 显著，与6-BA相比，NAA对原球茎的诱导作用强于6一BA担引。李杰等研究了2，4-D，NAA和KT三种激 素对四个不同品种大花蕙兰茎段愈伤组织诱导和体胚发生频率的影响。结果表明三种激素对愈伤组 织的诱导和体胚发生的影响差异显著，其中2，4一D对愈伤组织的发生作用极其显著，且随浓度升高， 诱导率增加，但高于2．0mg·L。1时，外植体褐化死亡：KT是体胚发生的关键因子，其作用受到2，4-D 的抑制和低浓度NAA的促进m1。T．K等报道了赤霉素能促进组培苗叶片伸长，且低浓度(1mg·L-1) 的生根数较多[47]o 1．3．1．4添加物对大花蕙兰原球茎增殖与分化的影响 不同添加物对原球茎增值与分化影响不同。其中椰乳|20¨、香蕉汁／泥口吼％‰¨棚山¨对原球茎的 增殖与分化有促进作用。但是有研究发现添加香蕉泥、香蕉汁经过连续继代后产生原球茎细小、生 长不良直至死亡现象，影响了原球茎的正常生长H引。有人认为香蕉泥等复合添加物在高温灭菌时营 养成分失活，需抽滤灭菌，操作复杂，除培养物生长必需外，否则不宜使用⋯61。其它一些研究表明， 在培养基中添加适量硝酸铜也能促进原球茎的增殖、分化生根旧1’捌。 不同碳源对大花蕙兰繁殖系数的影响也存在差异，其中蔗糖的效果最好，但是适宜浓度为2％， 超过2％时繁殖系数呈下降趋势㈣1。蔗糖对大花蕙兰原球茎分化也有显著影响，2—3％是较为适宜的浓 度‘2021。 1．3．1．5培养方式和培养条件对人花蕙兰原球茎增殖与分化的影响 研究发现液体培养基比固体培养基中原球茎的生长率高，液体振荡培养可以显著增加原球茎的 增殖率啪1。 培养条件对人花蕙兰原球茎的增殖与分化也存在一定影响。有研究认为25"C比20"C有利于原球 茎的增殖晦引。钟士传⋯9】研究了几种不同光强对大花蕙兰原球茎增殖和分化的影响，结果表明全暗条 件下虽然繁殖系数高，但是影响了萌芽和生根。在400Lx光照条件下，繁殖系数较高，生根萌芽较 少，有利于切块繁殖⋯引。光质对大花蕙兰的愈伤组织诱导、增殖原球茎再生也有一定影响，LeVan TuongHuan等经试验证明100％的红光对愈伤组织诱导最为有效，75％红光+25％蓝光最有利丁愈伤组 织增殖，25％红光+75％监光下原球茎的数量最多。 1．3．1．6褐化和玻璃化的防治 在原球茎或从生芽的继代过程中，在培养基中加入0．5--1．Og·L-1的活性炭，可以抑制培养物产 生的红色多酚氧化物，进而提高繁殖速度【541，此外，缩短继代周期，也可以有效抑制原球笨诱导过 7 程中的褐化现象。在研究中人们发现产生人花蕙兰试管苗玻璃化的原冈主要包括①培养基温度骤 升，造成高温伤害的后遗症②经多次继代培养，原球摹过多吸收细胞分裂素6-BA，使体内激素比例 失调③长期使用用氨、锰、铁、锌等含量较低的培养基，引起的玻璃化。针对产生原因，控制培养 室温度在25～28℃，多种培养基交替使用，连续继代后适当降低细胞分裂素的含量并提高生长素的 含量2～3代，可以有效的控制试管苗玻璃化现象【551。 1．3．1．7生根壮苗和组培苗的移栽 提高生根率上，在生根培养基中减少大量元素用量⋯吼洲、添加适量蔗糖⋯引、活性炭啪1能够达 到效果。此外在生根培养基中添加适量香蕉泥m瑚山71椰乳⋯引、肌醇和水解酪蛋白㈣1能够增加生根 率。有研究认为适合大花蕙兰生根壮苗的适宜培养基为1／29S+0．1-0．5mg·L-'+1096椰乳+O．5g·L。1 活性炭⋯引：此外大花蕙兰在生根壮苗时需要较强的光照⋯8·123]弱光抑制叶片分化。移栽后理想的栽 培基质为苔鲜嘞堋1，也可以使用水苔、碎陶粒、泥炭土和蛙石的混合物乜“571。 1．3．2生态习性和栽培技术研究 由于大花蕙兰生与其它盆花相比生长相对缓慢，生长周期较长，不易获得大量整齐植株，如果 要得到准确的试验结果需要几年的时间，因此对于大花蕙兰栽培方面的科学研究报道相对较少。但 是多年来，学者们对于大花蕙兰栽培技术方面的探讨从未停止过，并取得了一些成绩。 1．3．2．1光 光照对大花蕙兰的生长和发育有一定的作用，据报道，大花蕙兰是洋兰中比较喜光的一种，夏 季遮光50-60％，春秋遮光30％，冬季应保持日光充足H一仉慨6¨光照不足容易产生叶片下垂，光照过 强，产生叶片枯黄现象。 1．3．2-2温度 大花蕙兰的生长适温为15～25"Cn√m慨701。温度对大花蕙兰侧芽发生有一定影响，高温(18"C) 条件下出芽整齐，低温(6℃)条件下出芽时期延长，高温可以促进新茎的生长H¨，但高温条件下叶子 容易徒长，假鳞茎发育迟缓且充实度差(an古舜治等，1979)。低温(8～28℃)条件下大花蕙兰植株 假鳞茎、叶片可溶性糖、淀粉含量增加，而高温(20～32℃)条件下植株的可溶性糖、淀粉含量下降， 但不同温度处理对其假鳞茎、叶片干物质积累、蛋白质及灰分含量影响不大"引。温度是影响人花蕙 兰花芽分化和发育的关键因子之一悖一“7副花芽分化过程中，最适日温为18～22℃，最适夜温为12～ 18。C，超过极限温度时，容易引起花芽发育不良。 低温可以促使大花蕙兰花芽分化旧2’圳研究人员从新茎的生长初期起就在不同的温度条件下栽培 而调查其花芽形成与温度的关系，发现在生长过程中高温条件下新萃形成的越早，花芽创始也稍微 提早。然而，在15～10。C的温度下，花序数量最多：而在35～25"C的温度条件下，花芽创始受抑制m’ 1191。新茎的茎叶含糖量或假球茎的肥大率在高温下较低，在低温下较高。 夏季低夜温可使人花蕙兰花期提前。冬季夜温对人花恶兰生长及成花也有很人的影响，冬季高 夜温对于人花蕙兰的叶片及假鳞萃的生长都明显的有促进作用，但是花箭于六月份即可形成，同时 小花败育数较多"引。随后Sakai等继续这方面的研究¨引，尝试变温栽培对人花蕙兰成花的影响，冬 季夜温由18度逐渐降至6度，叶片数增加，但花芽数减少，花期推迟。Yonekura等认为要生产高 8 质量盆花冬季需有一段5℃低温的时期【7⋯。之后Teruhiko等进行了不同冬季夜温的管理对火花蕙 兰开花影响的试验唧1。结果表明，由秋人剑2月中旬温度为5。C，之后升温至15‘C，这种加温方式 对大花蕙兰的开花有较好的效果，既降低了生产成本，又可生产出高质量的盆花和切花。花芽形成 后，花箭伸长过程的温度控制对于开花的具体时间和成花整齐度及成花质量影响很大。 1．3．2．3水分 大花蕙兰的根为肉质根，基质水分过多，会造成根部腐烂：但大花蕙兰原产热带Ⅱ热带地区，性 喜温暖高湿的环境，如果空气湿度不够，基质水分不充足，则影响植株的生长和开花¨一0’61朋1大花 蕙兰对水分的需求因植株年龄、季节和栽培基质不同而不同。赵九洲等报道了不同基质水分条件下 大花蕙兰的水分生理变化情况及火花蕙兰的基质临界水分含量阙值，得出叶片含水量、叶水势可以 作为大花蕙兰水分万缺的指标。随后他义研究了水分亏缺下外源水杨酸sA和6-BA对大花蕙兰水分 生理特性的影响。结果表明，0．5～4．5mmol／L的SA和2．5—4．5mmol／L的6一BA处理可增加NAA含量， 提高SOD和CAT活性，降低VIDA含量：2．5-4．5mmol／L的SA可以提高净光合速率，增加水分利用效 率，2．5mmol／L的6一BA也可以提高水分的利用效率m¨。 1．3．2．4栽培基质 大花蕙兰的根为肉质根，所以栽培基质应该以疏松透气的材料为主，比如树皮块、木屑、苔鲜、 碎石等n一们陋h删。混合基质因为综合了各种所用基质的优点，所以比单一基质更有利于大花蕙兰幼 苗的生长旧1。姚宏等等认为苔鲜是最适合大花蕙兰生长的基质【鼢1，但由于苔鲜价格较高，用量较大， 所以就生产成本来说不宜使用：而树皮、砖块、苔鲜(3：l：1)和树皮、煤渣、苔鲜(3：1：1)综合了几 种基质的优点且成本较低，所以可以推广使用。杨光明等(2004)认为在天水地区采用朽木屑作为栽 培基质较为理想¨2引，使大花蕙兰生长的最为健壮，增加了火花蕙兰的根数、根长和根粗、叶片、叶 面积，而供试材料中，木炭粒栽培的效果最差。 ’ 1．3．2．5营养与施肥 大花蕙兰植株较大、生长迅速、花箭和小花数较多，所以较其它兰属植物相比需肥量较大¨仉611。 不同施肥浓度、施用比例和施用时期对人花蕙兰的营养生长和生殖生长影响不同。有研究认为，施 用EC值较高的营养液比Ec值较低的营养液单位面积上的花箭数多，但每个假鳞茎上的花箭数、花 箭长度和单位面积的小花数均低下后者：每个假鳞茎上的花箭数和幼叶上的氮素含量呈负相关⋯’；赵 九洲等研究了两种代用基质和施肥浓度对人花蕙兰幼苗的影响。结果表明幼苗的叶面积增长率、叶 绿素、植株鲜重和光合速率随施肥量的变化而变化。随后在研究中得出N，P，K比例为1：3．3：1．2 时形成最优比例，此时获得单枝花朵数最多怕51。高磷肥对人花蕙兰的成花有明显的促进作用旧1。由 研究认为N，P，K中，钾肥对火花蕙兰花芽分化影响最大，氮肥次之，磷肥最小，三要素对开花品 质影响不同，氮肥对假鳞萃大小、花芽发育及开花品质影响最大，磷肥对小花数影响较人：而钾肥对 花径的影响作用较人．最佳的N，P，K组合为N3P2K3，即N：P：0；：K20=2．4：l：2．6协引 1．3．2．6病虫害防治 大花蕙兰栽培中的主要病害有炭疽病、叶枯病、灰霉病、根腐病、白绢病等常见的虫害有蚜虫、 蓟马、蜗牛、介壳虫等。平时养护中要注意“以防为主、防治结合”的原则。要注意栽培环境的环 9 境卫生，注意通风透气，及跳修剪枯叶和病叶：病虫害发生时及时采取有效措施，以减少对人花蕙兰 的危害【1仉他‰121]。 研究方面，有一人对感染大花慈兰的病原体进行了电镜观察，进行了细胞病理的研究，包括对 花叶病原(丁铭等2004)的研究，对番茄斑萎病毒(TSwV)和烟草花nl。病毒(17MV)复合侵染的犬花蕙兰 同一病叶的细胞病理的研旧1，有人认为引起大花蕙兰感病的3种主要病菌为兰花炭疽病菌、兰花白 绢病菌、兰花黑腐病菌㈨1。防治措施上发现增施磷、钾肥能够增加人花蕙兰炭疽病的防治效果增施 钾肥的[N：P(P20s)：K(K20)=15：15：30]和增施磷肥的[N：P(P20。)：K(KzO)=15：30：15]的防治效果显著 悖¨。菌克、甲基托布津对兰花炭疽病的田间防治效果较好啪1。 1．3．2．7抹芽措施 抹芽是大花蕙兰栽培中一项关键的技术措施“仉％％蚓，即去掉多于的腋芽，集中养分供应主雀 的生长，使其在生长后期形成较大的假鳞茎，以便第二年春季生长出更健壮的专或让将要开花的假 鳞茎贮存更多的养分。养分积累有利于花芽的及时分化和死成，并保证花芽中后期有允足的养分供 应生长。研究证明，抹芽能够提高大花蕙兰开花率。能够使假鳞茎增粗，经过抹芽处理的植株开花 率约为未经抹芽处理的四倍嘞1。 1．3．3促成栽培技术研究 · 6月"--"10月是大花蕙兰花芽分化及发育的关键时期110。，对它的促成栽培往往在这个阶段。因此， 大花蕙兰的越夏是非常重要的时期，在此时期采取适宜的栽培方式能够提高成花率和开花品质。一 般传统的促成栽培方法，是在越夏期间将人花蕙兰移到海拔约900m的高山上，利Jf}j自然低温和较明 显的昼夜温差来促进花芽的形成。对于这种方法，很多学者在上山的时间及海拔高度等各方面都做 过很多研究旧引。高山栽培能够促进碳水化合物的积累㈨1，提高假鳞茎含糖量和淀粉含量，有利丁诱 导花芽产生及花箭的伸长和发育，提前花期旧71。Arbel等尝试用喷雾系统(Fog-c001ingSystem)来 进行降温，使花无需上山，在温室内进行越夏。结果表明，喷雾系统比风扇一水帘系统调：i了的温室温 度要更加一致，还可降低促成栽培的成本。夏天在温室内利用高压喷雾降温设备降温对大花蕙兰进 行越夏栽培，花期比在室外栽培要提前两周，但是比高山栽培要晚四周，叶片数和假鳞茎的生长有 提高啪1。之后，Sangamine等继续这一方法的研究，结果表明喷雾系统与传统方法都能够有效地进 行催花，但前者的花期较晚“删。 大花蕙兰促成栽培技术研究方面还应用了植物生长调节剂，Ohno，H．在高温条件下对丁刚出现 的花芽施以GA3¨011，但是促花的效果并不明显。乙烯利一使花期提前4-6天【1021。而学者们发现，在 花芽形成后花箭伸的过程中，植物生长调节剂的使Hj会产生一定的效果¨011。BA处理后，温度控制 在昼夜温度为30℃／25℃的成花率及花箭长度最好n吲。有人研究得出200mg／kg赤霉素水溶液，能有 效减少黄蕾现象，大幅度提高花穗坐蕾率¨叫1。刘同在对花箭伸长至20cm的花箭进行处理时发现， GAj能有效增加花箭艮度|1”1，但是对丁施川时间、浓度、方法上没有深入具体研究。 1．3．4切花保鲜技术研究 ． 目前，大花蕙兰切花贮藏、保鲜技术的研究主要集中在如何减少乙烯的产生或使产生的乙烯无 法发生作用上。研究发现，大花蕙兰切花在衰老过程中有乙烯生成，且随着温度升高，乙烯含量增 10 加、切花衰老加快。研究表明，去雄可以促使乙烯的产生，加速衰老，但去雄后不同品种在鲜重、 乙烯产量及唇瓣颜色上差异很大。Harkema，tt．等用8-5000mg／L的AOA对大花蕙兰切花进行预处理 能够延迟唇瓣变色和延K切花寿命，且能够抑制去雄对唇瓣颜色及衰老的影响。研究证明，I-MCP 能够有效抑制犬花蕙兰切花衰老，延长切花瓶插寿命。此外还可以抑制由下花粉损坏而引起的衰老： SuhJungNam等的研究也证实适量的卜MCP预处理能够显著抑制人花蕙兰切花鲜重的减少及花序和 乙烯的生成，还可以抑制在运输过程中由于花粉脱落引起的衰老“吲。 1．3．5育种工作研究 大花蕙兰的杂交育种已有一百多年的历史了，至今己登录的大花蕙兰品种数以千计。它们的亲 本主要是大花的附生类，常常要经过多次反复的杂交，才能形成有价值的品种。兰属植物约有48种， 目前己知用来做杂交亲本的原生种有近20种，例如虎头、美花兰、碧玉兰、多花兰、西藏虎头兰)、 独占春、单氏虎头兰、果香竺)、纹瓣兰、冬风兰、暗紫风兰、澳洲凤兰、德氏风兰、大雪兰、斑舌 兰以及建兰、蕙兰、寒兰，墨兰等¨’10’7州。 目前，大花蕙兰的育种方法仍以杂交育种为主，但是随着大花蕙兰商品化生产趋势的不断扩 大，使用传统的育种技术已遇到了越米越多的问题，比如难于打破种间特性的限制，培育周期长， 难以保持某些优良性状等。所以现在开始尝试采用其它育种方法进行大花蕙兰的育种上作。 研究中人们发现火花蕙兰栽培种中有二倍体、三倍体、四倍体，也有非整倍体，但是以三倍体 品种居多。通过同一杂交组合的染色体数目比较和具亲缘关系的品种间染色体数日比较，发现在大 花蕙兰杂交育种中，会出现“二倍体×二倍体=四倍体”的现象1122]这一研究为多倍体育种奠定了 基础。 研究人员也把基冈技术引入到大花蕙兰的育种上作中。因大花蕙兰的组织培养技术已经发 展的较为成熟，这为其基因工程研究奠定了基础⋯¨。人们利用基冈：r程途径有目的地将外源基因导 入大花蕙兰中改良其某些性状，如生育期长、开花晚、病虫害抗性等。2002年厦门北大生物园将花 期调控基因API转入大花蕙兰中，现已进入中试阶段。另外，在花色n121、花香及抗性等方面的育种 工作中，各国学者也在积极探索尝试用基冈T程进行更有效的杂交育种。大花蕙兰基因组DNA的提 取为我国大花蕙兰种质资源的保存与利用及其良种的选育与推广提供理论与技术支持¨婚1。 其它方面朱根发等进行了大花蕙兰、墨兰、建兰等兰属植物的种间远缘杂交试验，结果发现犬 花蕙兰×墨兰与墨兰×大花蕙兰的杂交成功率存在较人差异，姚献华、王利民对人花蕙兰种子的液 体保存进行了研究，把种子放在按照MS培养基配方配制的液体中，pH5．4，蔗糖309／L，每毫升保 藏液中保藏种子数量在50粒以上，环境温度控制在15"C左右，光照约20001x，保藏液每天早晚震 荡两次，每次2h，即可获得理想的保藏效果。王利民等又进行了人花蕙兰花粉离体萌发试验。为杂 交育种奠定了基础。 1．4本研究的目的和意义 东南Ⅱ国家或地区素有养殖兰花的传统，兰花养殖已经成为东方文化的重要组成部分。兰花姿态 优雅，飘逸清香，代表高雅情趣，又象征着富贵文明，因此被许多人喜爱。近年来，兰花产品中的大路产 品中低档产品已趋向饱和，而以大花蕙兰为主的中高档兰花则相对短缺，而且市场需求鼙日益增大。犬 花蕙的生产地主要是泰国，新加坡，马来西Ⅱ和中国台湾省。我国人陆的大花蕙兰绝大部分还是依 赖台湾、日本、韩国和荷兰进口的，由于人工、地租等各项成本的客观差异，台湾、韩国以及日本的生 产成本人大高丁．中国，加上关税及运输的费川极大，造成了大花蕙兰的市场价格K期居高不下，使人花 蕙兰很难进入普通百姓家庭，从而影响了人花蕙兰的市场需求，因此，如果能实现人花蕙兰的国产化，在 国内进行大花蕙兰的育种!组培快繁和栽培生产，其成本将大幅下降，随着售价的人幅下降，人花蕙兰在 中国的市场潜力将不可计量。另外，如果能够在大陆选育、繁殖出优质的大花蕙兰，则我们完全可以将 产品出口，反销至台湾、韩国及日本，组织培养是大花蕙兰品种繁育、生产的重要环节。本论文以大 花蕙兰的花梗为外植体，通过建立一个大花蕙兰品种的组织培养体系，研究了大花蕙兰组织培养生产 中的各个环节的主要影响因子'为实现人花蕙兰的组织培养工厂化生产提供技术依据。 12 2引言 兰花在植物分类学上属于兰科(Orchidaceae)植物，是单子叶植物，为多年生草本，附生、地生、 或腐生。兰科植物按生态习性可分为地生兰和气生兰两种，生于地上而有球茎、鳞茎、块茎者称为 地生兰，冈主要产于中国，故也称为中国兰。如我国及东南亚特产的兜兰、茎脊兰、鹤顶兰等。气 生兰都产于热带和弧热带，大都以气生根着生于树林的枝干或岩石上，其花的形和色，大而鲜艳， 具有很高的观赏价值旧1。此类兰花有蝴蝶兰属、石斛兰属、卡特兰属、文心兰属、树兰属、万代兰 属等。兰科是显花植物中最人的科之一，估计有800个属，3万一3．5万个原生种。另外，在英国 《国际散氏兰花杂种登记目录》正式登记的人工杂交种约4万种以上，而且每年以1000种以上的数 目在增加。我们常见的中国兰和洋兰，只是兰科植物中--,1,部分有观赏价值的栽培种类，还有大量 的野生兰科植物分布于世界各地，有待丁二我们去发掘、保护、引种栽培和杂交育种。 兰花传统的繁殖方式主要是分株繁殖，然而一株健壮的兰花每年只能长出一至数个芽，繁殖系 数极低H1，一般只能增殖卜3倍。许多珍稀品种无法大量繁殖，不能满足市场的需求，致使一些稀 有品种的售价，每个叶芽高达几千元甚至几万元以上。不少品种在栽培条件下很少结种子。同时由 于兰花的种子极小，胚发育不完全，没有提供营养的胚乳或其它组织，因此不易发芽，要借助共生 的菌类供给养料才能萌发哺1。许多名贵品种实际上是一些自然突变体，如果这些品种通过有性生殖 产生种子，再由种子繁殖后代，那么这些后代中的绝大多数个体将会丧失原品种具有的独特观赏价 值哺1。另外，由于长期无性繁殖，造成带病毒植株日益增多，使兰花的优良品质下降⋯。因此如何运 用生物技术快速繁殖名优兰花就格外引人注目。 大花蕙兰(Cymbidiumgrandiflorium)，是兰科兰属(Cymbidium)中的一部分大花附生种类及其 杂交种，是世界上栽培最普及的洋兰之一，仅次于膏特兰(Cattleya)和蝴蝶兰(Phalaenopsis)。它 是一种名贵的气生兰，具有雍容华贵的外貌，色彩鲜艳的花朵，享有“兰花皇后”的美誉旧1。尤其 是当今的人花蕙兰品种，都是经过一百余年多代杂交选育出的优良品种。与原种比较，花型规整， 花瓣宽，花朵优美，色彩艳丽而丰富，花茎直立而挺拔，花朵数目多且排列紧密，深受国内外兰花 爱好者的欢迎，具有较大的市场潜力。如近期风靡日本、台湾等地的‘女皇’就是由火花系统的品 种与建兰杂交而育成的，其花草直立，花径为7-8cm，花为金黄色，具芳香味。真正是把人花蕙兰 的花大、色艳和传统国兰悠雅花香的韵味相结合了。根据卢思聪等旧1报道，近几年的元旦春节市场 上只有少量火花蕙兰销售，有四枝花一盆的，其售价可达500-600元，两枝花一盆的也可卖到150 多元，并且极为旺销。但人多是一些花卉公司以整盆的方式从国外进口在国内销售的，价格昂贵。 大花蕙兰如能在国内大批量种植，其售价完全可被普通消费者接受。 以苇尖为外植体，在国内外已有成熟的经验，以花梗为外植体报道较少，有鉴于此，本文以大 花蕙兰‘女皇’的花梗为外植体，加强人花蕙兰离体培养繁殖技术的研究，探索通过组织培养加快 人花蕙兰繁殖速度和提高繁殖系数，解决目前市场供不应求的问题，为人花蕙兰试管苗．J：厂化生产 提供技术依据具有重人的意义。 13 3、试验材料与方法 利用人花蕙兰‘女皇’花梗的鉴段为材料，探讨组织培养技术。本文土要从外植体表面灭菌， 各阶段基本培养基的选择，植物激素的附加及移栽基质的选择设置试验，研究各关键点的最优技术。 试验于2006年4月一2007年10月在南刚农校组织培养中心进行。 3．1初代培养的实验 3．1．1外植体表面灭菌方式的实验设计 ‘ 外植体灭菌的预处理：先用自来水将花梗清洗干净，再用稀的洗沽精溶液浸泡10min，同时用 毛刷轻轻刷洗表面并不断搅动，之后用清水漂洗5"-6遍。然后在超净工作台上分别用A、B、C、D 四种方法进行表面消毒。 A：用70％的酒精浸泡10s，然后用0．1％的升汞(加两滴吐温．60)处理15min，再用无菌水冲 洗4"--5次。 B：用70％的酒精浸泡10s，然后用2％的次氯酸钠(加两滴吐温．60)处理18min，再用无菌水 冲洗4"--5次。 C：用0．1％的升汞(加两滴吐温．60)处理15min，然后用无菌水冲洗4～5次，接种到无糖培 养基上培养1d后，再用方法A消毒。 D：用1．3％的次氯酸钠(加两滴吐温．60)处理20min，然后用无菌水冲洗4"-5次，接种到无 糖培养基上培养1d后，再用方法B消毒。 把消毒的花梗茎段接种到预先准备的启动培养基上，一瓶接种一个茎段，在(23_-1)℃，光照12ll／d， 光照强度2000Lx的条件下培养。接种20天后统计污染率、枯死率和存活率。 3．1．2初代基本培养基的实验设计 据报道，植物组织培养中常用的许多培养基均可进行蕙兰组织培养，常用的培养基为MS，1／2MS， KC和VM等，参考前人的经验，结合预备试验的结果，设定以下启动培养基(单位：mg·L1蔗糖 2．0％琼脂0．6％下同)： 14 表1培养基种类 在表1中，每种培养基接种‘女皇’20瓶，在(22±1)℃，光照121a／d，光照强度2000Lx的条件 下培养(一F同)。根据培养物生长情况确定大花蕙兰启动最佳培养基。 3．2丛生芽增殖实验设计 3．2．1丛生芽增殖培养基的实验设计 根据预备试验的结果，参考前人的经验，分别以MS、1／2MS、KC、Vw作基本培养基，附加 6-BA1．0mg·L1+NAA0．1m酽L．1，每种培养基接种生长旺盛的试管苗‘女皇’单芽茎段10瓶，每瓶 接种5株，30天后根据培养物生长情况确定大花蕙兰芽增殖的基本培养基。其他培养条件同上。 3．2．2植物生长调节物质配比的实验设计 植物组织培养中，培养基中生长调节物质的种类和浓度是影响植物生长的主要因素。根据文献 和预备试验，选择6-BA、NAA两种生长调节物质，各设三个浓度，进行两冈素三水平完全随机区 组试验。试验共设九个处理，每处理分三个区组，每个区组接种‘女皇’10瓶，每瓶接种5株。30 天后统计每区组的增殖系数(增殖系数：增殖后芽数／增殖前芽数)，以确定生长调节物质的最佳组 合。其他培养条件同上。 ‘ 表2不定芽增殖培养基中生长调节物质的冈素 3．2．3不同碳源及碳源浓度的实验设计 在组织培养中，．糖对植物材料的分化生长培养起着重要作t}fj，根据文献和预备试验，分别川食 用白糖、蔗糖作碳源，浓度分别为1％、2％、3％、4％，以确定大花蕙兰离体培养中合适的碳源以 及碳源浓度。培养基为MS+6．BAl．0“g．L1+NAA0．1mg·L．1，每个处理接种‘女皇’20瓶其他培养 条件同上。 15 3．2．4环境条件的实验设计 在植物组织培养中，光照强度与温度对植物材料的生K分化、移栽成活起着重要作用，根据预 备试验，以MS+6BAl．0mg·L1+NAA0．5mg·L1为培养基，光照强度分别设定1000Ix(日光灯)、 2000Ix(日光灯)、3000lx(日光灯)、自然光(透过玻璃的散射光)四个处理；温度分别设定 18℃、20℃、22℃、24℃、26。C四个处理，以确定最佳的光照强度与温度。每个处理接种20瓶，每 瓶接种5株，其他培养条件同上。 3．3原球茎培养试验设计 3．3．1不同培养时间转接对诱导原球茎的影响 茎段